灰葡萄孢菌诱导的百合转录辅激活因子LlMBF1a基因的克隆及其特征分析

转录辅激活因子MBF1a参与了植物对病原真菌的防御反应。利用电子克隆结合RT-PCR技术从百合中分离了LlMBF1a基因,其开放阅读框长429 bp,编码142个氨基酸。LlMBF1a分子量为15.53 ku,理论等电点为10.12,为稳定的水溶性非分泌蛋白,含有典型的MBF1结构域和α螺旋-转角-α螺旋模序。亚细胞定位分析表明,LlMBF1a主要在细胞核中表达。LlMBF1a在根、茎、鳞茎、叶中的表达量无显著差异,受灰葡萄孢菌侵染诱导表达且在相对抗病品种中持续高水平表达,表明LlMBF1a可能参与了百合对灰霉病的抗性反应。     

大麦MBF1基因的电子克隆与生物信息学分析

通过同源比对,对大麦MBF1s基因进行了电子克隆,并通过生物信息学的方法对其及编码蛋白质进行了预测和分析.结果表明,克隆到大麦MBF1家族3个成员HvMBF1a、HvMBF1b和HvMBF1c,三者所编码蛋白质均包含典型的MBF1和HLH结构域,无可识别的信号肽和跨膜区,均为亲水性蛋白,含有数个可能的磷酸化位点.电子表达谱结果表明,3个成员在大麦的大部分组织器官中都有表达,而HvMBF1a和HvMBF1b对所分析的胁迫处理响应不明显,HvMBF1c的表达受各种处理的剧烈诱导,HvMBF1c可以作为大麦和其他作物抗逆性分子育种的重要候选基因.     

猪MBF1基因的克隆与序列分析

克隆了MBF1基因875 bp的c DNA序列和1 919 bp的基因全序列(登录号:EF 625885)。序列分析表明,猪MBF1基因序列与人、小鼠的相似性分别为89%和88%,氨基酸序列与人和小鼠的相似性分别为99%和97%,猪MBF1基因包含5个外显子和4个内含子,内含子的剪接方式都符合"GT-AG"法则;组织表达谱分析表明MBF1基因在心、肝、脾、肾、子宫中表达量较高,在胃和小肠中低表达。     

百合热激转录因子基因LlHsfC1的鉴定、表达与亚细胞定位

为了深入研究百合热激反应的分子机制,以麝香百合杂种系品种‘白天堂’为试验材料,鉴定了百合C类Hsf基因LlHsfC1,其开放阅读框为780 bp,编码259个氨基酸,推定蛋白质分子质量为30.1 ku,理论等电点为9.61.LlHsfC1蛋白含有热激转录因子的特征结构域,但与百合A类Hsf相比,LlHsfC1缺少转录激活模序和核输出信号.亚细胞定位分析表明LlHsfC1在细胞核中表达.37℃胁迫处理显著促进了LlHsfC1的表达;LlHsfC1的表达受热胁迫与Ca~(2+)处理协同诱导.此外,构建了植物过表达载体pCAMBIA1301-LlHsfC1,为进一步研究LlHsfC1基因的功能提供了基础.     

花生热激蛋白AhHSP70与热激因子AhHSF基因的克隆及表达分析

热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和热激转录因子(heat shock factors,HSFs)在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥了重要作用。本研究从花生转录组文库中筛选到HSP70、HSF的c DNA片段,通过序列比对在花生全基因组序列中获得这两个基因的基因组序列,根据序列信息设计引物,以花生叶片c DNA为模板扩增全长ORF并进行生物信息学分析。结果显示,Ah HSP70基因的ORF全长为1 962 bp,编码653个氨基酸,分子质量为71.45 k D,理论等电点p I为4.93;Ah HSF基因的ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸,分子质量为46.03 k D,理论等电点p I为4.85。Ah HSP70与Ah HSF均不具有信号肽,为可溶性蛋白,二级结构中有大量无规则卷曲。利用这两个基因的氨基酸序列分别与来源于其他物种HSP70、HSF的氨基酸序列进行同源比对,并构建进化树进行亲缘关系分析,结果表明,Ah HSP70与大豆Gm HSP70亲缘关系较近,与番茄Sl HSP70亲缘关系比较远;Ah HSF与菜豆Pa HSF亲缘关系较近,而与蒺藜苜蓿Mt HSF的亲缘关系较远。利用实时荧光定量PCR对Ah HSP70和Ah HSF在热胁迫情况下的表达进行分析,结果表明这两个基因在42℃高温条件下表达量显著升高,Ah HSP70在高温胁迫3 h后表达明显升高,热处理24 h和48 h后,表达量为对照的50倍和135倍;转录因子Ah HSF在高温胁迫3 h后表达明显升高,高温处理6 h后达到最高,随后下降。本研究初步验证了花生热激蛋白和热激因子基因在花生响应高温胁迫中的作用。     

百合CBL1与CBL3基因的克隆与表达分析

为了深入研究百合响应盐胁迫的分子机制,研究以麝香百合杂种系品种‘白天堂’为试验材料,从中分离得到Ll CBL1与Ll CBL3基因,分别编码213和223个氨基酸。亚细胞定位分析表明Ll CBL1在细胞膜中表达,Ll-CBL3在细胞膜、细胞质和细胞核中表达。基因表达分析表明Ll CBL1和Ll CBL3在根、鳞茎、叶中均有表达; Ll-CBL1和Ll CBL3的表达受盐胁迫诱导,其中Ll CBL1响应盐胁迫的上调表达更加显著。研究结果表明Ll CBL1基因可能与百合的盐胁迫响应密切相关。     

菊花脑热激蛋白70基因的克隆及表达分析

采用同源克隆结合RACE技术从菊花脑叶片中克隆菊花脑(Chrysanthemum nankingense)热激蛋白70基因(hsp70)的cDNA序列,并通过荧光定量PCR(qRT–PCR)分析菊花脑在40℃高温下热激不同时间(0、0.5、1、2、3、6 h)后叶片中hsp70基因的表达差异。结果表明,克隆的cDNA序列全长2 224 bp,与水母雪莲花、紫茎泽兰的hsp70基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为88%、98%,表明该序列为菊花脑的hsp70基因序列(GenBank登录号,KJ561911),命名为Cnhsp70。Cnhsp70基因的开放阅读框为1 944 bp,其编码的蛋白(647个氨基酸)的相对分子质量约为70 900,含有HSP70家族序列标签。qRT–PCR分析的结果表明,Cnhsp70基因的表达在热激后短时间内迅速上调,热激3 h达到最高,热激6 h时表达量迅速下调。     

紫茎泽兰细胞质小热激蛋白HSP17.7基因的cDNA克隆与表达

利用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。     

百合小鳞茎抽薹的差异蛋白质组学分析

为研究百合抽薹调控机理,以自繁的百合小鳞茎‘Siberia’为材料,分析小鳞茎在抽薹前后蛋白质组表达差异。经双向电泳分离,共得到差异表达蛋白质点21个。11个蛋白质点获得MALDI-TOF-TOF-MS的鉴定,其中包含2个伴侣蛋白质、4个参与能量代谢的蛋白质、1个胁迫诱导表达的c DNA产物、3个百合花中的c DNA片段和1个未知蛋白质。结果表明,在百合抽薹过程中,参与能量代谢的蛋白质表达量受到调控,为抽薹过程准备能量或重新合成储能物质;分子伴侣蛋白质或胁迫诱导蛋白质的表达量发生变化,是百合植株应对低温春化的生理反应。     

百合AP2/ERF家族转录因子基因LoERF4的克隆和生物信息学分析

【目的】研究AP2/ERF家族成员ERF基因在百合休眠解除过程中的作用。【方法】以百合品种西伯利亚(Lilium oriental ‘Siberia’)的小鳞茎为试验材料,从前期试验获得的转录组测序数据中筛选得到1个在小鳞茎休眠解除过程中显著上调表达的ERF转录因子,结合RT-PCR技术扩增得到西伯利亚小鳞茎的ERF基因c DNA全长序列,命名为LoERF4;通过多种生物信息学软件对LoERF4的基因结构和理化性质等进行分析;利用荧光定量qRT-PCR技术检测LoERF4基因在小鳞茎休眠解除过程中的相对表达量。【结果】通过克隆得到LoERF4基因全长,该基因开放阅读框全长为606 bp,编码201个氨基酸,含有1个典型的保守AP2结构域;蛋白相对分子量约为21.52 ku,理论等电点为6.43,为亲水性蛋白,没有跨膜结构。qRT-PCR分析结果显示：在西伯利亚小鳞茎休眠解除过程中,该基因的表达量在第20天小鳞茎休眠解除、开始萌发时极显著升高。【结论】在百合中克隆得到的LoERF基因可能是参与调控百合小鳞茎休眠解除进程的关键因子之一。     

百合LiLFY1基因的克隆和表达分析

 【目的】分离百合的LFY类基因,检测百合中LFY类基因的拷贝数并分析其表达模式。【方法】利用 RT-PCR结合RACE的策略克隆百合的LFY类基因,通过Southern杂交检测百合中LFY类基因的拷贝数,通过RT-PCR分析LiLFY1基因的表达模式。【结果】获得了包括全长开放阅读框（ORF）的LiLFY1基因的cDNA序列。与已克隆的LFY类蛋白的同源性分析表明,LiLFY1编码的蛋白与单子叶植物水稻和玉米的LFY类蛋白具有更高的同源性。Southern杂交结果表明,二倍体百合中有2个拷贝的LFY类基因。LiLFY1基因在百合的幼嫩花芽和顶端分生组织中表达,而在根、茎、成熟的叶片和成熟花的各轮器官中不表达。【结论】百合的LiLFY1基因与已克隆的其它作物的LFY类基因高度同源,在百合的顶端分生组织和幼嫩花芽中表达,LiLFY1基因的克隆将有助于调整百合开花时间的基因工程研究。     

叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因的克隆及表达分析

为了解叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因在高温下的作用机制,通过同源克隆及RACE技术克隆并获得叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因全长cDNA序列,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因在不同叶用莴苣品种中的表达量差异。该基因全长2 400bp(KP258179),开放阅读框为2 106bp,编码701个氨基酸,与西瓜(AAC03416.1)、牵牛花(ABZ04081.1)、黄瓜(CAA52149.1)、菠菜(AAB91471.1)等HSP70蛋白高度同源。实时荧光定量PCR结果表明:高温处理时,该基因在热敏品种中表达没有明显增加,随着处理时间的增加甚至表现为下调,而在耐热品种中,其表达上调。成功克隆得到叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因,热胁迫下该基因在不同品种中的表达有一定的差异性,推测该基因可能与叶用莴苣耐热性相关。     

大蒜热激转录因子基因AsHSFB1的克隆、亚细胞定位及其表达分析

热激转录因子(HSF)基因是植物热胁迫响应的重要转录调节基因,在植物胁迫应答和其他抗逆反应过程中起着关键作用。为研究大蒜热激反应的分子机制,本研究基于大蒜转录组数据,以徐蒜6号为试验材料,采用同源克隆方法获得编码HSF的AsHSFB1基因。序列分析结果显示,AsHSFB1含有882 bp的开放阅读框,编码293个氨基酸,其蛋白质含有热激转录因子的特征结构域。在进化关系上,AsHSFB1与拟南芥AT4G11660(AtHSFB2B)同源性最高。亚细胞定位结果表明,AsHSFB1蛋白主要定位在细胞核和细胞质上。本研究采用同源重组技术成功构建pCAMBIA1305-AsHSFB1过表达载体,为进一步研究该转录因子基因的功能,培育耐热大蒜品种奠定基础。RT-PCR分析结果表明,不同大蒜品种中,AsHSFB1基因在叶片中相对表达水平均最高,具有组织表达特异性;38℃高温胁迫处理下,徐蒜6号中的AsHSFB1基因相对表达水平在24 h时明显上调;4℃低温胁迫下,徐蒜815和徐蒜6号中AsHSFB1基因相对表达水平的变化趋势相似,均先上升后下降,在处理4 h时相对表达水平达到峰值。     

紫茎泽兰细胞质小热激蛋白HSP17.7基因的cDNA克隆与表达

利用RT-PCR 和RACE-PCR 技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。      

蝴蝶兰热激蛋白基因PhHsp70序列分析及对冷胁迫的响应

通过RT-PCR和RACE相结合的方法从蝴蝶兰叶片中克隆了一个热激蛋白基因PhHsp70 c DNA序列(Gen Bank登录号为MG214259),该基因全长为2 239 bp,编码647个氨基酸,与多种植物的HSP70基因具有94%以上的相似性;其编码蛋白包含HSP70结构域,属于胞质型HSP70;系统进化分析显示,该蛋白与铁皮石斛的HSP70蛋白亲缘关系最近;PhHsp70基因在营养器官和生殖器官中均有表达,其中在根中表达水平最高,在花器官中表达水平较低;PhHsp70基因在4℃冷胁迫处理0.5 h表达水平下降,冷胁迫1 h后,表达水平升高,在处理24 h时表达水平最高。由此推测,PhHsp70基因参与蝴蝶兰4℃冷胁迫的生理反应。研究结果可为研究蝴蝶兰热激蛋白在低温胁迫响应中的调控机理提供理论基础。     

玉米热激蛋白70基因对温度胁迫的响应

利用RT-PCR技术从玉米自交系H21叶片中克隆获得一热激蛋白70(HSP70)基因的完整开放阅读框,全长1 737 bp,编码578个氨基酸,命名为ZmHSP70。编码的氨基酸与其他作物比对分析表明,ZmHSP70与高粱中一推测的蛋白(SbHSP70,XP_002465635)同源性最高,达95%,与水稻中一推测的蛋白(OsHSP70,EAY89062)同源性达87%。半定量RT-PCR的结果表明,该基因明显受42℃热激诱导表达,热激2 h其表达量达最大值;4℃冷胁迫也能诱导ZmHSP70表达量增加,冷胁迫4 h,其表达量达最大值。ZmHSP70是一个受温度诱导的热激蛋白。     

结球甘蓝游离小孢子热激处理下差异表达基因分析

[目的]本文旨在探讨结球甘蓝游离小孢子培养早期体胚发生的分子机制,分析游离小孢子在热激处理下的基因表达谱。[方法]将易出胚结球甘蓝高代自交系611单核靠边期小孢子分别在体外32.5℃培养1 d(热激处理,E2)、体内正常生长1 d(对照组1,E3)及体外25℃培养1 d(对照组2,E5),利用转录组测序技术(RNA-Seq)对3个处理的小孢子文库进行差异基因表达谱分析,并鉴定热激处理下早期体胚发生的响应基因。[结果]将3个处理的小孢子Uni Gene表达量依次进行两两相比,即E2 vs E3、E2 vs E5以及E3 vs E5,分别鉴定出2 506、1 073和3 322个差异表达基因。基因本体(gene ontology,GO)聚类分析表明,热激处理下的差异表达基因显著富集到细胞组分中的细胞部件、细胞及细胞器;在分子功能中,这些基因在结合、催化活性及核酸结合转录因子活性中的比例最高;在生物过程中的细胞过程、代谢过程及刺激反应等类别中的比例也最高。京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析显示,热激处理下的差异表达基因显著富集到植物激素信号转导、植物病原互作、淀粉和糖代谢、抗坏血酸代谢、苯丙氨酸代谢以及多糖降解等途径。进一步对抗坏血酸代谢途径相关基因进行分析,抗坏血酸过氧化物酶基因APX1和APX2,半乳糖脱氢酶基因Gal DH以及乙醛脱氢酶基因AD在体外32.5℃培养1 d后均显著上调表达。[结论]通过转录组学方法揭示了结球甘蓝游离小孢子在热激处理下基因组的表达变化,鉴定了可能与早期体胚发生相关的抗坏血酸代谢途径基因,为进一步研究甘蓝小孢子体胚发生的分子机制奠定了基础。     

水稻HSF基因OsHsf-like的生物信息学和转录表达分析

植物热激转录因子主要调控植物热激蛋白基因的转录表达,对植物的耐热性起着重要的作用.我们利用生物信息学技术鉴定出1个新的水稻HSF基因OsHsf-like,该基因编码1条719个氨基酸的预测肽链,肽链中包含1个HSF DNA结合域和1个由2个疏水的七肽重复序列(HR-A/B)构成的寡聚域.OsHsf-like的DNA结合域具有典型的HSF DNA结合域的次级结构和三级结构.对寡聚域的结构分析和系统进化分析将OsHsf-like归于B类HSFs.OsHsf-like在水稻穗部低水平转录表达.表达水平不受热激影响.     

不结球白菜幼苗耐热性机制初步研究

以不结球白菜品种苏州青(耐热)和矮脚黄(不耐热)幼苗为材料进行热激处理(40℃,0、6、12、24、48、72和96 h),测定了热激处理对不结球白菜叶片中保护酶活性、丙二醛(MDA)含量以及膜透性的影响,同时利用实时定量PCR(qPCR)技术检测叶片中BcHsp1和BcHsp2耐热基因的表达变化。结果表明:热激处理后,耐热品种叶片中SOD、POD和CAT活性的增幅大于不耐热品种;不耐热品种叶片中丙二醛含量和电解质渗透率的增幅大于耐热品种;相对于不耐热品种,耐热品种热激蛋白基因具有明显稳定的热激诱导表达特性。