大肠埃希菌不耐热肠毒素双突变体的表达及活性研究

为了使大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT)的毒性丧失或减弱的同时仍保留其较强的免疫原性,通过PCR和重叠—延伸PCR扩增突变体LTK63/G192基因片段,IPTG诱导表达目的蛋白,经Western免疫印迹检测目的蛋白,在HPLC系统上纯化目的蛋白,经ADP-核酸转移酶试验及Patent-mouse毒性试验检测其酶活性与毒性,纯化的目的蛋白与鸡新城疫病毒弱毒疫苗联合一起经滴鼻免疫鸡。结果表明:制备的突变体LTK63/G192的基因片段经酶切和测序发现,所构建的表达载体pLTK63/G192阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换;经SDS-PAGE电泳检测,野生型LT及双突变体均表达出约33.0ku和13.0ku的两条蛋白带,与LTA、LTB亚基分子质量相吻合;经Western bolt检测,两个蛋白亚基均可与His抗体发生特异性反应;双突变蛋白的酶活性和毒性与野生型LT相比酶活性和毒性都有所降低;突变体LTK63/G192能辅助新城疫疫苗在血清和黏膜中产生较高抗新城疫病毒的IgG和IgA。说明LTK63/G192是一个良好的免疫佐剂。     

164株大肠埃希菌耐药性分析

目的分析临床分离的大肠埃希菌株耐药性,为合理选用抗生素提供依据.方法根据NCCLS推荐使用的常用抗生素,采用Kirby-Bauer法检测164株大肠埃希菌对8种抗生素耐药性.结果164株大肠埃希菌耐2～4种抗生素居多,少数菌株可耐5～8种抗生素;对氧哌嗪青霉素、氨苄青霉素、复方磺胺、四环素、诺氟沙星的耐药率分别为45%、39%、32%、30%和24%.讨论大肠埃希菌耐药严重,多重耐药现象普遍,应引起临床高度重视.     

沙门氏菌噬菌体裂解酶LysLorf22的制备及溶菌活性分析

根据沙门氏菌噬菌体Lumpael的全基因组序列,预测该噬菌体裂解酶基因并对其进行生物信息学分析;优化其在大肠杆菌表达系统中的表达,并分析噬菌体裂解酶LysLorf22与外膜渗透剂最优组合的溶菌效果。结果表明,裂解酶LysLorf22的相对分子质量为1.76×10~4,等电点为9.14,其较优表达条件为:表达菌株Escherichia coli BL21,37℃诱导4 h。LysLorf22裂解谱较宽,最佳工作浓度为375 nmol/L,在30 min内可使氯仿处理的Salmonella Enteritidis ATCC 13076菌悬液OD_(600)下降0.72;375 nmol/L的LysLorf22与0.5 mmol/L乙二胺四乙酸二钠联用对Salmonella Enteritidis ATCC 13076溶菌效果最佳,在2 h内可使活菌数从1.62×10~9 CFU/ml下降至4.31×10~8 CFU/ml。     

一株大肠埃希菌烈性噬菌体ΦTRI-1的分离及特性分析

通过在E.coli菌液中加入土壤悬浮液共培养获得噬菌体,利用双层平板法反复纯化4次后得到单一清晰的噬菌斑。将单个噬菌斑加入对数早期的E.coli菌液中增殖培养后利用核酸抽提试剂盒提取总核酸,并分别用DNaseⅠ和RNase A对总核酸进行消化,利用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ对其进行酶切;增殖后的噬菌体液进行噬菌体颗粒浓缩,取浓缩液负染后置于电子显微镜下确定噬菌体的形态特征,并进行SDSPAGE电泳分析,确定其蛋白条带;同时测定其他生物学特性,包括滴度、最佳感染复数、一步生长曲线以及其对温度、p H、紫外线、氯仿的敏感性等。结果表明:分离并纯化出1株E.coli烈性噬菌体,命名为ΦTRI-1,形态特征:头部为二十面体的立体对称,直径约为60 nm,有一长尾,长约200 nm;其核酸属于双链DNA,按照国际病毒分类委员会分类标准,其属于有尾噬菌体目(Caudovirales),长尾噬菌体科(Siphoviridae)的烈性噬菌体。生物学特性测定结果显示ΦTRI-1对E.coli的最佳感染复数为0.1,潜伏期约为20 min,爆发期约为60 min,裂解量约为38;ΦTRI-1在40℃时活性最高,在20~70℃活性均较强,80℃时活性丧失;其酸碱耐受力较强,在偏碱环境下活性相对更高;对紫外线有一定的耐受能力;对氯仿敏感,浓度5%的氯仿即可致其失活。分离到的噬菌体属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科,综合其各项生物学特性可知其潜伏期短,裂解能力强,环境适应能力强,具有很好的杀菌效果,具有开发为抗E.coli菌剂的潜力。     

铜绿假单胞菌噬菌体裂解酶LysYH6的表达与活性

以耐药性铜绿假单胞菌为宿主菌分离并筛选出1株烈性噬菌体YH6,根据电镜下的形态特征,YH6为短尾噬菌体家族的成员。通过对YH6的全基因组序列测定和分析,确定了其裂解酶基因,并通过原核表达获得了噬菌体的裂解酶Lys YH6。菌落计数及浊度下降法表明:该裂解酶在EDTA(25 mmol/L)存在的条件下对铜绿假单胞菌表现出了显著的抑菌活性。具有抑菌活性裂解酶Lys YH6的获得为治疗和预防耐药性铜绿假单胞菌引起的感染开辟了新思路。     

大肠杆菌O157 Stx噬菌体裂解酶的克隆表达及活性分析

为研究大肠杆菌O157Stx噬菌体编码的裂解酶(内溶素)对肠出血性大肠杆菌的抗菌作用,克隆表达了大肠杆菌O157Stx噬菌体裂解酶,并检测其裂解作用和裂菌谱。利用PCR方法扩增大肠杆菌O157Min27株中Stx2噬菌体裂解酶基因(R基因),构建表达质粒pET28a(+)-lysEC1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。重组质粒在BL21中获得了高表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的34%,经His-trapTM亲和层析柱纯化后,获得的重组LysEC1的纯度大于97%。体外裂解活性试验证实纯化的噬菌体裂解酶LysEC1对肠出血性大肠杆菌菌株具有很好的裂解作用,这为新型噬菌体抗菌生物制剂的研发提供了新的研发方向。     

果胶裂解酶、木聚糖酶及果胶裂解酶、木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

运用RT-PCR技术,从绿色木霉(AS3.3711)mRNA中扩增出木聚糖酶基因xyn2,并与质粒pPIC9K相连,构建了表达载体pPIC9K-xyn2,转化毕赤酵母GS115,并且将pPIC9K-xyn2和pPIC9K-PelC(果胶裂解酶)同时转化毕赤酵母GS115,通过组氨酸营养缺陷型筛选,G418高拷贝菌株筛选,以及摇瓶诱导表达筛选,分别得到一株高表达木聚糖酶毕赤酵母菌株X5和一株同时高表达木聚糖酶和果胶裂解酶毕赤酵母菌株PX6。同时,将一株高表达果胶裂解酶毕赤酵母菌株P2保存。重组酶酶学性质分析表明,P2和PX6分泌果胶裂解酶,X5和PX6分泌木聚糖酶最适温度均为50℃;P2分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为14.2U/mL;X5分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为5.8U/mL;PX6分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为12.6U/mL,分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为4.2U/mL。     

兔源大肠埃希菌噬菌体分离鉴定与生物学特性研究

对浙江省某兔场腹泻病兔进行病原分离鉴定,经革兰氏染色和PCR鉴定,分离出致病性大肠埃希菌1株,命名为ZJE1株。ZJE1株对链霉素、环丙沙星敏感。以ZJE1株为宿主菌,分离纯化出噬菌体4株,分别命名为ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5,并对其生物学特性、形态与结构特征进行研究。结果显示,4株噬菌体分离株均由六角形的头部、可收缩的尾鞘和尾管组成,均属于肌尾噬菌体科。采用双层平板法测定噬菌体分离株的宿主谱、最佳感染复数、pH稳定性、热稳定性和一步生长曲线。结果显示,ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5具有宿主特异性,在37~55 ℃的条件下可保持良好活性。ZRP2、ZRP3在pH值7的条件下可保持良好活性,ZRP4、ZRP5在pH值5~7的条件下可保持良好活性。ZRP2、ZRP3、ZRP5的潜伏期为11~19 min,均能在体外裂解ZJE1株。研究成果可为应用噬菌体治疗兔大肠埃希菌病提供研究基础与数据支持。     

毕赤酵母分泌表达SAMS及表达产物活性分析

[目的]利用毕赤酵母分泌表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）。[方法]以酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）基因组DNA为模板,通过PCR扩增出S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因2（sam2）,构建重组毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9Ks-am2,转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达分泌蛋白SAM合成酶,并用HPLC测定重组蛋白的酶活力。[结果]经SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量约50kD,比理论值42.5 kD稍大,可能是分泌过程中糖基化等加工造成。体外酶促反应结果显示,伴随甲醇诱导及初步纯化过程的进行,蛋白活力逐步提高,纯化后比活力为61.48 U/mg。[结论]该研究首次实现了SAM合成酶的胞外表达,为开发和建立体外酶促法生产SAM工艺奠定了基础。     

李斯特菌噬菌体裂解酶的研究进展

单核细胞增生李斯特菌是重要的食源性致病菌,可通过污染的食品进入人体,引发食品安全事件。噬菌体作为李斯特菌生物防治的有效手段,能够特异性识别菌体细胞,造成细菌裂解死亡。噬菌体发挥抑菌活性的关键在于其双链DNA所编码的裂解酶(肽聚糖水解酶类)能够在增殖过程的后期有效裂解宿主菌的细胞壁,将子代噬菌体释放到胞外环境中。本文综述了李斯特菌噬菌体裂解酶的种类、作用原理和结构特征,并探讨了裂解酶的应用领域和未来发展方向。     

重组菌丝霉素在毕赤酵母中的分泌表达及活性研究

为获得一种能分泌菌丝霉素的毕赤酵母菌并探讨菌丝霉素的活性,将优化的目的蛋白碱基序列与标签MBP基因序列融合,通过双酶切将重组基因序列插入到毕赤酵母pGAPZaA表达载体上并进行连接反应。取10μL连接产物转化至感受态细胞,挑取含Zeocin(25 mg/L)平板筛选出的单菌落进行PCR鉴定,将阳性克隆送往测序公司测序。对鉴定正确的含有重组质粒的大肠杆菌DH5α进行活化培养并提取其质粒,得到的重组质粒进一步线性化和纯化,并电转入GS115感受态细胞中筛选出阳性克隆,诱导分泌蛋白,对其进行Western blot检测、纯化、活性分析和质谱鉴定,得到的重组蛋白为55 Ku左右,浓度为700 mg/L,纯度达到80%以上。质谱鉴定结果表明,蛋白序列的覆盖率达到98%,纯化后的蛋白也对金黄色葡萄球菌具有抑制作用,成功构建出一株能够分泌菌丝霉素的毕赤酵母菌,这为菌丝霉素的工业化生产和研发新型绿色的饲料添加剂奠定了基础。     

鸡大肠埃希氏菌致病性,菌毛表达及血凝特性

观察比较了鸡大肠埃工菌某些分离株腹腔接种,气管接种对１日龄鸡的致病性,研究了在体外不同培养条件下,菌株菌毛的表达情况,菌株的血凝谱及血凝特性。     

浙江省2市动物源大肠埃希菌及肠球菌耐药性比较和分析

为了解2020年浙江省金华市和台州市动物源细菌耐药情况,于2020年5月分别从这2市7个畜禽养殖场随机采集畜禽肛拭子样品284份,使用选择性培养基分离大肠埃希菌和肠球菌,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)对其进行鉴定,并使用微量肉汤稀释法检测这2种细菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)。结果显示:金华市大肠埃希菌对四环素的耐药率最高(87.5%),其次是对磺胺异噁唑(81.2%),对黏菌素的耐药率最低(0%);台州市大肠埃希菌对磺胺异噁唑的耐药率最高(97.1%),对美罗培南和黏菌素的耐药率均为0%。金华和台州2市肠球菌对磺胺异噁唑耐药率均为100%,其次是对泰妙菌素,均为98.6%,2市未检测到对奥格门汀和万古霉素耐药的肠球菌。此外,从整体耐药率、MIC分布和耐药谱型上看,台州市的细菌耐药性水平比金华市的高。总之,通过对2个地级市的畜禽养殖中细菌耐药性水平进行监测和对比发现,2市的动物源大肠埃希菌和肠球菌耐药水平较高且存在差异。因此,通过农业主管部门的兽药减量化行动,持续监测耐药性动态变化十分必要。     

单核细胞增生李斯特菌噬菌体裂解酶Lys039的活性分析及初步应用

为探究单核细胞增生李斯特菌噬菌体裂解酶的特性及在食品基质中的初步应用,从NCBI获取李斯特菌噬菌体裂解酶lys039基因序列,分析其生物信息学,并在大肠杆菌中表达纯化,研究其裂解活性、对生物被膜的影响以及在牛奶基质中的应用。结果表明：1）裂解酶Lys039由341个氨基酸组成,分子质量为36.4 ku,等电点为9.81,其结构具有酰胺酶活性,对本实验室22株单核细胞增生李斯特菌、2株无害李斯特菌、1株伊氏李斯特菌以及1株威氏李斯特菌具有裂解活性,但是对葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及沙门菌没有显示出裂解活性。2）随着Lys039浓度的升高,裂解活性逐渐增强,最适温度为30 ℃,最适pH值为6.0。3）Lys039能显著清除单核细胞增生李斯特菌形成的生物被膜,并且可以降低牛奶中单核细胞增生李斯特菌的细菌数量。综上,Lys039温度耐受范围广、耐酸耐碱且裂解谱较宽,可显著清除生物被膜以及初步应用效果良好。 本研究为进一步防治及快速检测单核细胞增生李斯特菌提供理论基础。     

重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶gene02524的酶学性质及抑菌活性

几丁质酶是催化降解几丁质的水解酶,在防治植物真菌病害与虫害方面的应用越来越广泛,是一种重要的生防蛋白。棘孢木霉TD3104是一株优良的植物病害生防菌,几丁质酶在抑菌防病过程中发挥重要作用。为克隆表达棘孢木霉TD3104几丁质酶基因gene02514,明确酶学性质和抑菌活性,利用毕赤酵母表达系统对目的蛋白进行表达,并通过SephadexG-100凝胶进行纯化,对序列进行分析并研究其酶学性质及进行体外抑菌试验。本研究成功地构建了pPIC9K/gene02524重组载体,并且经过比对发现其包含GH18家族的特征氨基酸序列,获得了毕赤酵母转几丁质酶基因工程菌,表达的重组几丁质酶表观分子量44.4 ku,K_m=2.048 2 g/L,V_max=0.635 5×10³μmol/（L·min）,最适反应温度为50℃,最适pH值为5.0,在pH值为3.5时稳定性最高;金属离子Cu²⁺、Hg²⁺可强烈抑制酶活性;可抑制金黄壳囊孢菌等病原真菌的生长。研究结果为解析棘孢木霉几丁质酶在生防中的作用及功...     

致仔猪腹泻大肠埃希菌的分离及耐药性分析

为调查江苏省泰州地区引起仔猪腹泻的主要病原,采集腹泻仔猪的肛拭子样品共70份,利用MA琼脂平板共分离得到136株细菌。鉴定结果表明,其中含大肠埃希菌119株、沙门氏菌5株、志贺菌4株、阪崎肠杆菌8株。致病性试验确定其中有81株细菌为致病性大肠埃希菌,对其进行O抗原血清型鉴定,有36株分离菌被定型,分属于6种血清型,以O₇₈和O₁₀₁为优势血清型。进一步对分离得到的大肠埃希菌进行肠毒素基因检测,结果表明,这些大肠埃希菌中包含ST1+ST2型20株、LT1+ST2型44株、ST2型17株,共3种产肠毒素类型。药敏试验结果显示,超过75%的菌株对头孢他啶、阿米卡星和氧氟沙星表现为敏感,而对常用的四环素、头孢呋辛、卡那霉素、多西环素等呈现耐药性,且存在严重的多药耐药现象。研究结果可为泰州地区仔猪腹泻的预防和治疗提供参考依据。     

产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检测及耐药性分析

目的:检测临床标本中产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,分析其耐药性,为指导临床合理地选用抗菌素提供可靠的依据。方法:用VITEK-32型全自动细菌分析系统进行细菌鉴定、药敏试验和ES-BLs测定。结果:产ESBLs大肠埃希菌为43.1%,产ESBLs肺炎克雷伯菌为19.4%;2种产ESBLs菌对氨苄西林、头孢唑林等7种抗生素的耐药率为100%,对头孢吡肟、环丙沙星等8种抗生素耐药率为54.5%~85.7%,而对亚胺培南敏感未出现耐药现象。结论:临床标本产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率较高,应限制广谱β-内酰胺类抗生素特别是第三代头孢菌素的使用;亚胺培南可作为治疗产ESBLs菌严重感染的首选药物。ESBLs;大肠埃希菌;肺炎克雷伯菌;耐药性     

产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检测及耐药性分析

目的：检测临床标本中产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，分析其耐药性。为指导临床合理地选用抗菌素提供可靠的依据。方法：用VITEK-32型全自动细菌分析系统进行细菌鉴定、药敏试验和ESBLs测定。结果：产ESBLs大肠埃希菌为43．1％．产ESBLs肺炎克雷伯菌为19．4％；2种产ESBLs菌对氢苄西林、头孢唑林等7种抗生素的耐药率为100％，对头孢吡肟、环丙沙星等8种抗生素耐药率为54．5％～85．7％，而对亚胺培南敏感未出现耐药现象。结论：临床标本产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率较高，应限制广谱β-内酰胺类抗生素特别是第三代头孢菌素的使用；亚胺培南可作为治疗产ESBLs菌严重感染的首选药物。ESBLs；大肠埃希菌；肺炎克雷伯菌；耐药性     

沙门菌噬菌体T139基因组分析及其裂解酶LysT40的异源表达和活性鉴定

为开发噬菌体裂解酶作为一种新型的抗菌剂,用于沙门菌的防控,采用生物信息学及异源表达蛋白的方法,获得鼠伤寒沙门菌噬菌体T139的裂解酶,并验证裂解酶对鼠伤寒沙门菌的裂解活性。通过对鼠伤寒沙门菌噬菌体T139基因组进行分析,发现该基因组全长38 854 bp,平均GC含量为49.10%,不包含tRNA基因。进化树分析表明噬菌体T139属于T7噬菌体属,共预测出43个ORFs,有23个被赋予已知功能。多序列比对及保守结构域分析表明,orf 40基因编码的蛋白（LysT40）包含126个氨基酸残基,具有内肽酶保守结构域,为可能的噬菌体裂解酶。LysT40二级结构中存在大量的螺旋结构（70.63%）,使得该蛋白能够保持结构稳定。将orf 40进行异源表达、纯化,经过SDS-PAGE和Western blot分析,在10~15 ku处获得单一目标蛋白条带,纯化的蛋白质量浓度为280 μg/mL。LysT40在30 min内对氯仿或EDTA预处理的鼠伤寒沙门菌具有较好的裂解活性,吸光值OD600相比于对照组分别下降0.18和0.31。     

宠物源大肠埃希菌耐药性及耐药基因调查

【目的】了解广州市宠物源大肠埃希菌Escherichia coli耐药性和耐药基因携带情况。【方法】2016年7月至2017年7月从广州市4家宠物医院采集健康或患病犬猫样品共319份,其中,健康动物127份,患病动物192份。采用选择性培养基分离大肠埃希菌,利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定菌种;采用琼脂稀释法测定大肠埃希菌对11种抗菌药物的敏感性,利用PCR和测序检测耐药基因的携带情况。【结果】319份样品共分离得到大肠埃希菌203株,其中,患病动物源109株,健康动物源94株。203株大肠埃希菌中有179株至少对1种抗生素耐药;对氨苄西林耐药率最高(76.85%),对头孢噻肟、四环素、多西环素和磺胺甲噁唑-甲氧苄啶耐药率均高于50%;对阿米卡星最为敏感,耐药率仅为10.84%。患病动物源大肠埃希菌对11种抗菌药物的耐药率均高于健康动物源,除阿米卡星、氟苯尼考和磷霉素外,对其他药物的耐药性均差异极显著(P 0. 01)。耐药基因检测结果显示,floR检出率最高(检出率为34.97%),blaCTX-M-9G、blaCTX-M-1G、fos A3、rmt B和bla CMY-2检出率分别为22.66%、20.19%、17.73%、10.34%和1.48%,未检测到blaCTX-M-2G和blaCTX-M-25G。【结论】广州地区宠物源大肠埃希菌耐药状况严峻,且常携带多种重要耐药基因。应当加强对宠物源细菌耐药性的监测。