鮰爱德华菌单克隆抗体的制备及其在黄颡鱼“红头病”研究中的应用

以黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco “红头病”病原---鮰爱德华菌 Edwardsiella ictaluri A86为抗原,利用杂交瘤技术制备了鮰爱德华菌黄颡鱼分离株的菌体单抗5D11、1B8、1G7、3G8、5A9、3H8,其效价分别为1：1280、1：1280、1：2560、1：320、1：160和1：80。结果表明：6株单抗与11株鮰爱德华菌黄颡鱼分离株均可以结合,与迟缓爱德华菌、气单胞菌、大肠杆菌、链球菌、弧菌等10株参考菌株均无交叉反应,单抗5D11和1B8可与鮰爱德华菌参考菌株结合。应用免疫荧光和免疫组织化学法检测了鮰爱德华菌对黄颡鱼的侵染规律。结果表明：黄颡鱼经人工注射鮰爱德华菌A86感染6 h后,在其肝、肾、脾、心、肠和胃中检测到了阳性细菌,其中脾脏中最多,心脏中最少;感染24 h后,脑中检测到阳性细菌;30 h后,鳃中显示有阳性信号;54 h后,在眼的外边缘检测到少量阳性细菌。研究结果可为进一步研究鮰爱德华菌在黄颡鱼体内的致病机理提供技术手段及基础,对揭示黄颡鱼“红头病”的发病机制具有重要意义。     

黄颡鱼朗格汉斯细胞的鉴定及其功能基因的表达分析

为研究黄颡鱼朗格汉斯细胞的结构特点以及细菌感染对其功能相关基因表达的影响,采用免疫组化技术对黄颡鱼免疫器官中朗格汉斯细胞进行鉴定,通过透射电镜进一步观察到黄颡鱼朗格汉斯细胞的超微结构,并采用荧光定量PCR检测鲶爱德华氏菌感染后黄颡鱼免疫相关组织内朗格汉斯细胞功能相关基因IL-1β、TNF-α、IL-10和TLR-4的表达情况。结果显示,黄颡鱼头肾和脾脏中具有朗格汉斯细胞的特异性分子标记CD207蛋白,且黄颡鱼朗格汉斯细胞的结构与其他脊椎动物类似,即细胞质中大量的伯贝克颗粒围绕着中心粒呈放射状排列。在鲶爱德华氏菌感染后,朗格汉斯细胞功能相关基因IL-1β、TNF-α、IL-10和TLR-4在黄颡鱼免疫器官内的表达量显著上调。上述结果表明,黄颡鱼含有朗格汉斯细胞,并且其可能参与了机体抗鲶爱德华氏菌感染的免疫反应。     

黄颡鱼迟缓爱德华氏菌的分离鉴定与药物敏感实验

【目的】确定导致广西3个大型养殖场黄颡鱼大量死亡的原因,筛选出具有较好疗效的药物,为黄颡鱼迟缓爱德华氏菌的预防控制提供有力的技术支持。【方法】从广西多个养殖场采集死亡黄颡鱼内脏组织,按常规方法进行病原分离鉴定及选取临床常用的34种药物进行药物敏感试验。【结果】从鱼内脏组织中分离到3株病原菌,分别命名为GXLJ20-1、GXLJ20-2、GXLJ20-3。通过形态学、生理生化特性、16S rDNA鉴定,确定为迟缓爱德华氏菌。经药物敏感试验,菌株对恩诺沙星等16种药物敏感,对9种药物中度敏感,对9种药物表现为耐药。【结论】迟缓爱德华氏菌是致黄颡鱼及同池养殖的青鱼、鲢鱼、罗非鱼等鱼类死亡的病原;通过药物敏感试验筛选出恩诺沙星等16种敏感药物,在生产过程中可根据实际情况选用对迟缓爱德华氏菌进行预防和治疗。     

黄颡鱼"裂头病"病因调查

黄颡鱼"裂头"病是近年来发生的黄颡鱼的新型病害,对广东顺德地区(龙眼、勒流、锦丰、杏坛等)黄颡鱼发病池塘进行采样分析,经流行病学调查、组织病理检测、病原分离等,对黄颡鱼"裂头"病的病因进行筛查.在所患病鱼脑部和浓汁中均分离出一种生长缓慢、透明的针尖状菌落.经鉴定为鲶爱德华氏菌.     

黄颡鱼“裂头病”病因调查

黄颡鱼“裂头”病是近年来发生的黄颡鱼的新型病害,对广东顺德地区（龙眼、勒流、锦丰、杏坛等）黄颡鱼发病池塘进行采样分析,经流行病学调查、组织病理检测、病原分离等,对黄颡鱼“裂头”病的病因进行筛查。在所患病鱼脑部和浓汁中均分离出一种生长缓慢、透明的针尖状菌落。经鉴定为鲶爱德华氏菌。     

广西斑点叉尾鮰爱德华氏菌的分离鉴定

在广西2处网箱和2处池塘发病斑点叉尾鮰中分离到4株呈β溶血的革兰氏阴性杆菌,经细菌形态、培养特征、生理生化特性鉴定3株为钻鱼爱德华氏菌、1株为迟钝爱德华氏菌,通过PCR检测、PCR产物核苷酸序列测序及Blast比对,进一步确定3株为钻鱼爱德华氏菌、1株为迟钝爱德华氏菌;致病性试验结果显示,这4株分离菌株具有较强的致病性,能引起斑点叉尾鮰发生爱德华氏菌病;药敏试验结果显示,4株分离菌株对氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、氟哌酸等高度敏感。     

斑点叉尾鮰鲇鱼爱德华氏菌的分离与鉴定

[目的]研究爱德华氏菌的鉴定方法,为爱德华菌病的快速诊断及防治提供参考依据。[方法]选取患病斑点叉尾鮰的表皮、肝脏和肾脏组织进行细菌分离,对选择性培养基上生长出来的疑似菌株进行革兰氏染色、氧化酶试验、葡萄糖发酵及生化特性试验鉴定菌株。[结果]共分离得到3株形态不同的肠杆科细菌,经过鉴定其中1株为鲇鱼爱德华氏菌。[结论]患病斑点叉尾鮰感染了爱德华氏菌。     

黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备与特性

采用饱和硫酸铵(SAS)盐析法结合Protein A亲和柱层析法提取了黄颡鱼血清免疫球蛋白,经SDS-PAGE测定该纯化蛋白重链和轻链的分子量分别约为73 ku和30 ku。应用杂交瘤单克隆抗体技术获得2株抗黄颡鱼免疫球蛋白的单抗杂交瘤细胞,分别命名为B10-C3和F6-F2,并对这2株单抗的特性进行分析。2株单抗的亚级份测定均为IgG2a;腹水抗体效价为1∶(7.29×10~5);2株单抗具有Western-Blot反应特性,能识别黄颡鱼免疫球蛋白的重链;单抗F6-F2对纯化的黄颡鱼免疫球蛋白的检测灵敏度为20 ng,单抗B10-C3对纯化的黄颡鱼免疫球蛋白的检测灵敏度为39 ng;2株单抗都与黄颡鱼免疫球蛋白发生特异性结合,而与鲇鱼、鳗鲡、鲫鱼、草鱼、鳊鱼、鲈鱼、鳜鱼和白鱼等血清免疫球蛋白无交叉反应。上述结果表明,B10-C3和F6-F2这2株单抗具有高度灵敏和特异等特点,可用于黄颡鱼病原早期诊断和免疫应答水平监测,同时揭示了同目不同属的鲇鱼和黄颡鱼血清Ig之间的相似度较低。     

养殖大菱鲆感染迟缓爱德华氏菌的分离、毒力基因及ERIC-PCR分析

为了调查辽宁省葫芦岛市养殖患病大菱鲆Scophthalmus maximus病原菌感染情况,选用迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda特异性引物对分离菌株进行PCR鉴定,共分离得到22株迟缓爱德华氏菌。结果表明:迟缓爱德华氏菌毒力基因的PCR扩增显示,22株菌均含有kat B、fim A、gad B、esa V等基因;人工感染试验表明,22株迟缓爱德华氏菌感染并致大菱鲆累积死亡率均为100%;ERIC-PCR结果显示,迟缓爱德华氏菌模式菌株(ATCC15947)与分离株可分为2个基因型,分别标记为Ⅰ和Ⅱ型,其中22株迟缓爱德华氏菌分离株均为Ⅱ型,与ATCC15947菌株为Ⅰ型明显不同。本研究结果为养殖大菱鲆迟缓爱德华氏菌感染的防控提供了依据。     

养殖黄颡鱼腹水症病原研究

对近年来黄颡鱼养殖过程中暴发的腹水症的病原进行了研究.病鱼症状主要为游动迟缓,体表、肝脏充血,积有腹水,后期伴有皮肤溃烂等,采用光镜及透射电镜超薄切片观察,生理生化指标鉴定及16S rDNA同源性分析及系统发育树构建等方法,对从多处组织中分离获得的病原菌进行了鉴定:其形态特征及生理生化指标符合迟钝爱德华氏菌特点,GenBank中同源序列检索结果显示,该菌与迟钝爱德华氏菌的16S rDNA序列同源性高达99%,系统进化树中与迟钝爱德华氏菌自然聚为一支.     

黄颡鱼病原嗜水气单胞菌分离鉴定及致病性研究

2015年江苏淮安地区养殖黄颡鱼暴发出血性肠炎。从濒死鱼肠组织和腹水中分离纯化出2株细菌,通过16S rRNA进化树分析显示,这2株菌与气单胞菌属的嗜水气单胞菌亲缘关系较近。致病性试验显示,2株菌对健康黄颡鱼具有较强的致病性,病原菌浓度达到5×10~4CFU/m L时,死亡率在40%~50%,病原菌浓度达到5×10~8CFU/m L时,死亡率在90%~100%。药敏试验显示,分离到的2株菌都对依诺沙星、头孢曲松、舒巴坦、恩诺沙星敏感。确定了淮安地区暴发的黄颡鱼出血性肠炎病原为嗜水气单胞菌,对黄颡鱼健康养殖和疾病防控具有重要意义。     

黄颡鱼溶血性腹水病初探

从濒死黄颡鱼腹水中分离到一株细菌HS01,对分离株理化特性及DNA序列进行检测,根据理化特性、16S rRNA和gyrB基因序列比对,分离株HS01为嗜水气单胞菌。人工感染该菌后发病鱼出现与自然发病类似症状,并表现强毒力,对黄颡鱼的半致死剂量为2.51×10⁵ CFU·g^-1,且从病灶中分离到与感染菌一致菌株,因此确定嗜水气单胞菌是此次黄颡鱼溶血性腹水病的病原。分离株对头孢唑肟、头孢噻肟、奈替米星及氟苯尼考等10种抗生素高度敏感;对头孢拉定、链霉素、新霉素及卡那霉素等6种抗生素中度敏感;对阿莫西林、青霉素、妥布霉素及红霉素这4种抗生素耐药。本研究为黄颡鱼溶血性腹水病防控提供了理论依据。     

龟源迟缓爱德华氏菌分离鉴定及灭活疫苗研制

【目的】利用从发病死亡的中华草龟(Chinemys reevesii)分离到的病原菌株制备灭活疫苗。【方法】对该菌进行培养特性、生理生化特征、16S rRNA同源性分析、药敏等试验。人工感染中华花龟(Ocadia sinensis),确定半数致死剂量(LD50)。经0.03%甲醛灭活后与铝胶3∶1制成灭活疫苗,对中华花龟进行腹腔注射免疫,测定血清抗体效价,以5LD50活菌浓度进行攻毒试验测定免疫保护率。【结果】分离鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌。两次免疫14 d后抗体效价分别为1∶64和1∶256,在5LD50剂量攻毒后相对免疫保护率分别为60%和73%。【结论】本灭活疫苗二免的相对保护率达73%,有保护效果,可用于龟的迟缓爱德华氏菌病的预防。     

黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及“黄优1号”肌肉营养成分比较

为科学评价生长速度快、抗病能力强的新兴养殖品种"黄优1号"(Pelteobagrus vachelli♀×Pelteobagrus fulvidraco♂)肌肉营养价值,测定其肌肉中常规营养成分、氨基酸和脂肪酸的含量和组成,并与其父本瓦氏黄颡鱼和母本黄颡鱼进行了比较。结果发现:黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和"黄优1号"肌肉中共检测出17种氨基酸,在总氨基酸含量、总必需氨基酸含量以及总鲜味氨基酸含量等方面均以"黄优1号"肌肉中含量最高。"黄优1号"肌肉中富含人体必需脂肪酸,含量高达22.85%,与其母本黄颡鱼肌肉中必需脂肪酸含量接近,略低于其父本瓦氏黄颡鱼肌肉中必需脂肪酸含量。结果表明"黄优1号"具有较为显著的氨基酸和脂肪酸营养价值的双重优势。     

Effect of complex Chinese herbs on non-specific immune function and disease resistance in yellow catfish(Pelteobagrus fulvidraco R.) by oral administration

根据供试黄颡鱼的鱼体质量添加中草药制剂剂量(0～1000mg/kg)的不同,试验设6个组(对照、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ),连续投喂30 d后,测定黄颡鱼血液中白细胞的吞噬活性、血清中溶菌酶和补体活性;另采用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)注射的方法进行人工攻毒,进行抗病力检测.结果表明,各供试组黄颡鱼血液中白细胞的吞噬活性均显著高于对照组.第Ⅰ组黄颡鱼血清中溶菌酶的活性与对照组之间没有显著性差异,而试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组和Ⅴ组黄颡鱼血清中溶菌酶的活性均显著高于对照组.第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和第Ⅴ组黄颡鱼血清中补体活性与对照组之间存在显著差异,而第Ⅰ组与对照组之间无显著性差异.活菌攻毒的方式证明投喂复方中草药制剂能增强黄颡鱼对人工感染A.hydrophila活菌的抵抗力.从增强非特异性免疫机能与抗病力的效果考量,这种复方中草药制剂在黄颡鱼饵料中添加量以400～800mg/kg为宜.     

一种复方中草药制剂对黄颡鱼非特异性免疫机能和抗病力的增强作用

根据供试黄颡鱼的鱼体质量添加中草药制剂剂量(0～1 000mg/kg)的不同,试验设6个组(对照、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ),连续投喂30d后,测定黄颡鱼血液中白细胞的吞噬活性、血清中溶菌酶和补体活性;另采用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)注射的方法进行人工攻毒,进行抗病力检测。结果表明,各供试组黄颡鱼血液中白细胞的吞噬活性均显著高于对照组。第Ⅰ组黄颡鱼血清中溶菌酶的活性与对照组之间没有显著性差异,而试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组和Ⅴ组黄颡鱼血清中溶菌酶的活性均显著高于对照组。第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和第Ⅴ组黄颡鱼血清中补体活性与对照组之间存在显著差异,而第Ⅰ组与对照组之间无显著性差异。活菌攻毒的方式证明投喂复方中草药制剂能增强黄颡鱼对人工感染A.hydrophila活菌的抵抗力。从增强非特异性免疫机能与抗病力的效果考量,这种复方中草药制剂在黄颡鱼饵料中添加量以400～800mg/kg为宜。     

伪狂犬病病毒(PRV)不同毒株抗原相关性研究

为了解PRV不同毒株之间的抗原性差异,评价弱毒FB株预防新型PRV的潜力,以4株PRV(FA、FB、Bartha-K61和FJ2012)毒株及其高免血清为材料,应用交叉中和试验测定PRV不同毒株的抗原性差异,通过FB免疫猪攻毒试验评价弱毒FB株对新型PRV的保护潜力。结果表明:中和抗体测定表明兔抗FB株、FA株、Bartha-K61株和FJ2012株高免血清的中和效价分别为1∶54、1∶91、1∶91和1∶215。交叉中和试验显示FB株与FA株、FB株与FJ2012株、FA株与FJ2012株的抗原相关性(R值)均大于0.8,Bartha-K61株与FA株、FB株、FJ2012株的R值均小于0.4,表明FB株与FJ2012株的抗原相关性高于Bartha-K61株与FJ2012株。仔猪免疫攻毒试验显示FB免疫猪能抵抗新型PRV(FJ2012株)的攻毒,保护率100%。提示PRV弱毒FB株有望成为预防新型猪伪狂犬病毒(FJ2012株)的疫苗候选株。     

基于荧光定量PCR法的鸡传染性支气管炎疫苗免疫效果评价研究

采用鸡胚传代致弱法得到一株可用于鸡传染性支气管炎疫苗的候选毒株,同时设定一个商品疫苗作为对照,采用荧光定量PCR法评价疫苗的免疫效果。结果表明,攻毒后7 d,两组试验鸡多数脏器均能检测到弱毒,部分脏器检测不到强毒,说明致弱毒株候选疫苗和商品疫苗对试验鸡有很好的保护作用。     

瓦氏黄颡鱼肝脂酶基因cDNA序列的克隆与序列分析

利用RT-PCR方法克隆瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)肝脂酶cDNA序列片段,并对其基因结构和系统进化关系进行分析.瓦氏黄颡鱼肝脂酶cDNA片段长1065 bp,编码353个氨基酸.肝脂酶氨基酸序列同源性分析结果表明,瓦氏黄颡鱼与其他鱼类的同源性为62%-100%.瓦氏黄颡鱼肝脂酶氨基酸残基包含糖基化位点、催化位点、催化中心三联体位点、脂质结合位点和多肽"盖"等主要结构区域.系统进化树分析表明,瓦氏黄颡鱼肝脂酶与草鱼、鳙、斑马鱼肝脂酶聚为一支.因此,瓦氏黄颡鱼的肝脂酶在鱼类进化中较为保守.     

野生与船养瓦氏黄颡鱼肌肉营养组成与评价

[目的]比较野生和船体网箱养殖(船养)瓦氏黄颡鱼的肌肉营养组成。[方法]对采自同一水域的野生和船养瓦氏黄颡鱼的肌肉营养成分进行了比较。[结果]野生瓦氏黄颡鱼粗蛋白、粗灰分和粗脂肪含量分别为船养瓦氏黄颡鱼的1.16倍、1.69倍和0.90倍。在检测到的17种氨基酸中,野生瓦氏黄颡鱼除酪氨酸和组氨酸含量低于船养瓦氏黄颡鱼外,其余种类氨基酸均高于船养瓦氏黄颡鱼。野生瓦氏黄颡鱼总氨基酸(TAA)、总必需氨基酸(TEAA)、总鲜味氨基酸(TDAA)含量分别是船养瓦氏黄颡鱼的1.18倍、1.51倍和1.13倍。野生瓦氏黄颡鱼必需氨基酸构成比例符合世界粮农组织/世界卫生组织对优质蛋白质的要求,而船养瓦氏黄颡鱼不符合。根据氨基酸评分,野生瓦氏黄颡鱼的第一限制性氨基酸为缬氨酸,除缬氨酸外,其余必需氨基酸的氨基酸评分均大于等于0.90;船养瓦氏黄颡鱼的第一限制性氨基酸为亮氨酸,只有苯丙氨酸+络氨酸的氨基酸评分大于1,3种必需氨基酸的氨基酸评分在0.65以下;野生瓦氏黄颡鱼的必需氨基酸指数为69.62,船养瓦氏黄颡鱼为55.36。[结论]野生和船养瓦氏黄颡鱼的肌肉营养成分存在差异。野生与船养瓦氏黄颡鱼生活在同一水域,水质条件几乎一致,饵料差异可能是影响瓦氏黄颡鱼肌肉营养成分的主要原因。