铁皮石斛及其混伪品的rDNA ITS序列分析与鉴别

[目的]从分子水平上实现对铁皮石斛及其混淆品快速准确的鉴别。[方法]通过对铁皮石斛及其混淆品的rDNA ITS区序列进行分析,计算遗传距离,并采用邻接法构建NJ系统树。[结果]8个来自不同产区的铁皮石斛rDNA ITS区序列全长636 bp;铁皮石斛及其6个常见混淆品药材ITS序列长度范围为636～641 bp,其中ITS区(不包括5.8S)片段长度为483 bp,含信息位点60个(12.4%),变异位点185个(38.3%);各样品间遗传距离范围为1.108%～2.594%,NJ系统树也表明铁皮石斛与其混淆品的亲缘关系较远。[结论]ITS序列可对铁皮石斛及其混淆品进行快速简便的鉴别。     

基于ITS2和SNP技术鉴定浙江铁皮石斛的初步研究

铁皮石斛以营养价值和保健功效备受消费者青睐,但不同品种和不同品质铁皮石斛的区分和鉴别存在困难,急需建立一种快捷、准确、高效的鉴定方法.以浙江省12个铁皮石斛和其他省的10个石斛为材料,选取DNA条形码ITS2,优化扩增体系,对扩增产物进行测序,经序列比对与分析,获取浙江铁皮石斛DNA条形码ITS2中的特异性SNP位点;...     

基于DNA条形码的我国吴茱萸主要栽培种遗传分析和分子鉴别研究

采用ITS2和psbA-trnH DNA条形码组合分析我国吴茱萸主要栽培种的遗传背景,并对其进行分子鉴别。获得的ITS2序列全长223 bp,共获得7个差异位点,其中特异性鉴别位点2个;psbA-trnH序列全长419 bp,获得特异性鉴别位点3个。基于ITS2碱基序列采用邻接法构建系统聚类树,结果表明:吴茱萸、石虎和疏毛吴茱萸的遗传背景差异较为明显,且吴茱萸与石虎的亲缘关系更为接近;嫁接可以使吴茱萸的遗传背景发生较大的变异;并且序列特异性位点可以准确有效地对吴茱萸正品和伪品进行鉴别。     

基于rbcL序列的半边莲与通泉草的分子鉴别方法

市场流通中半边莲容易与通泉草相互混淆,拟基于rbcL序列建立半边莲与通泉草的分子鉴别方法。采集不同产地的半边莲样品9份,通泉草样品7份,所有受试样品提取总DNA。对其叶绿体DNA中rbcL片段进行扩增、测序,用ClustalX 2.1软件进行多重序列比对后,应用Meg 5.0软件构建NJ系统聚类树进行聚类分析,根据二组样品间的SNP位点设计相互鉴别的特异性引物,建立特异PCR鉴别方法,并应用SYBR Green I染料法建立对2种中草药进行快速检测的方法。本研究建立了对半边莲与通泉草2种中草药进行分子鉴别的方法,并建立了荧光快速检测方法。     

基于ITS2序列的丹参及其混伪品分子鉴定研究

[目的]采用DNA条形码及特异性引物PCR技术对中药材丹参及其混伪品进行分子鉴定研究。[方法]以核基因ITS2序列作为DNA条形码,对研究材料进行PCR扩增并双向测序,将所得序列构建NJ系统发育树。利用Koetschan等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构,同时采用自设引物进行特异性引物PCR鉴别研究。[结果]ITS2序列长度为470 bp左右;从系统聚类树图可以看出,丹参及其伪品分别聚在不同支,表现出单系性;比较二级结构发现,丹参与甘西鼠尾差异甚微,与牛蒡在螺旋茎环的数目、大小、位置以及螺旋臂由中心环伸出时的转角等方面具有明显区别;通过特异性引物PCR技术可将丹参及其伪品进行区分。[结论]DNA条形码技术和特异性引物PCR技术均能够有效地区别丹参及其混伪品,在中药材的鉴定中具有重要的应用前景。     

广西斑地锦及其混淆品DNA条形码分子鉴定

为鉴定斑地锦（Euphorbia maculata L.）及其混淆品,以广西采集的41份斑地锦及其混淆品为研究对象,提取其基因组DNA,对各个样品的条形码rbcL和psbA-trnH序列进行扩增并测序,与GenBank下载的13份斑地锦及其混淆品rbcL和psbA-trnH序列进行了分析比对,计算了斑地锦及其混淆品的种内、种间遗传距离并采用邻接法构建了系统发育树。结果发现,斑地锦种内遗传距离明显小于其与混淆品的遗传距离,系统发育树中斑地锦样品聚为单系并能够与其混淆品明显区分开,这表明rbcL和psbAtrnH序列可用于斑地锦及其常见的混淆品的鉴别。     

识别杜洛克猪个体身份的DNA条形码

为了对杜洛克猪个体身份进行DNA识别,从31对PCR引物中筛选到了8对引物可高效扩增猪基因组片段并获得39个SNP位点,从39个SNP位点中选留杂合度H≥0.1的16个SNP位点,用于编制杜洛克猪个体身份识别的DNA条形码及相应的数字条形码。结果表明,编制的DNA条形码或相应的数字条形码很好地区分了10窝共计68头杜洛克猪个体身份。从这68个样本中,8对引物分离的基因型种类分别是2、10、9、3、3、9、3、3种;理论上这8对引物分离到的这些基因型可有2×10×9×3×3×9×3×3种组合,即可用于131 220头杜洛克猪的个体身份识别。因此,根据筛选的8对引物扩增的16个SNP位点编制的DNA条形码或相应的数字条形码,足以满足规模种猪场杜洛克猪的个体身份识别。     

半夏及其易混品的DNA分子鉴定

基于ITS、matK、trnL-trnF、rpl32-trnL和rps16序列对栽培半夏及其易混品开展DNA条形码鉴别研究,结果表明:ITS、rps16序列可作为DNA条形码用于半夏及其易混品的鉴别研究中,matK、trnL-trnF序列可作为天南星科不同属间DNA条形码或条形码组合候选序列鉴别半夏及其邻近属植物,rpl32-trnL序列可作为鉴别半夏及其易混品的DNA条形码候选序列。     

基于ITS条形码序列的枸杞属植物鉴定

采用改进CTAB法提取枸杞(Lycium Chinense Mill.)叶片DNA,利用合成的特异引物对其DNA中nr DNA ITS区进行扩增,利用ITS条形码序列,对枸杞属种质资源进行鉴定,分析其亲缘关系。结果表明,测序得到了17份枸杞属近缘种的ITS条形码序列,整个ITS序列长度变异范围为603~632 bp,平均为624 bp,整个转录间隔区(ITS1+ITS2)对位排列后总长度为480 bp,有194个变异位点,占40%;保守位点288个,占60%。聚类分析结果表明,17份种质资源可分为5个大类群。基于ITS条形码序列分析在鉴定枸杞属种质遗传多样性及其亲缘关系具有一定的优越性。     

基于ITS2的北沙参药材及其伪品的分子鉴定

利用内部转录间隔区2(ITS2)条形码来鉴定河北某药材市场北沙参的真伪品,探讨分子方法鉴定北沙参药材真伪品的可行性。提取12份北沙参样品的DNA,利用ITS2引物进行PCR扩增,对扩增产物进行双向测序,利用CodonCode Aligner软件进行序列拼接。从Genbank下载13条北沙参序列,利用MEGA 6.0分析比对25份序列,计算其种间、种内的Kimura双参数遗传距离(K2P距离)以及各序列的变异位点并进行聚类分析,利用RNA多重排列(locARNA)来预测北沙参及其伪品的二级结构。12份样品中10份为北沙参,1份是川明参,1份为祁木香。ITS2序列可以较好地区分北沙参及其伪品,可作为北沙参鉴定的有效方法而加以推广。北沙参的DNA条形码鉴定体系的建立,为DNA条形码技术在临床及市场监管领域的实践应用提供了理论基础。     

石斛药理作用研究进展

目的筛选合适的DNA条形码序列并建立高效准确鉴定药用石斛(Dendrobium)的方法。方法以12种药用石斛的82个样品为材料,提取样品总DNA,对核基因片段ITS和ITS2、叶绿体基因片段psbA-trnH和matK序列进行扩增和测序;利用生物信息学软件进行序列特征、DNA条形码序列间隔(barcoding gap)和系统发育分析。结果4条序列扩增成功率均为100%,其中ITS和ITS2测序成功率最高,均为97.6%,其次是matK为96.3%,psbA-trnH为95.1%;ITS和ITS2序列与其他序列相比,种内和种间存在重叠的部分较少,具有条形码序列间隔。系统发育树表明：ITS和ITS2序列能够成功区分12种药用石斛及混伪品,psbA-trnH序列未能把叠鞘石斛(D. aurantiacum Rchb. f. var. denneanum)、双斑叠鞘石斛(D. aurantiacum Rchb. f. var. zhaojuense)和流苏石斛(D. fimbriatum)以及混伪品全部区分开,matK序列未能把叠鞘石斛和流苏石斛区分开;4条序列联合构建的系统发育树与ITS和ITS2单序列构建的系统发育树相似。结论以ITS和ITS2序列为主,psbA-trnH和matK序列为辅的DNA条形码鉴定方法能够对药用石斛及其混伪品进行快速准确的鉴定。     

基于DNA Barcoding的金银花及其易混品鉴别研究

采用不同序列对金银花及其易混品开展基于DNA条形码的鉴别研究。结果表明:14个样品中仅有4个个体为金银花,其余分属于大花忍冬复合类群,为山银花基原植物,多序列NJ树支持《Flora of China》中的大花忍冬复合类群划分,ITS、mat K、trn Ltrn F序列可鉴别金银花及其易混品,rpl32-trn L和rps16序列也有较好的DNA条形码应用前景,可作为金银花及其易混品分子鉴别的DNA条形码候选序列。     

新开发的禾本科通用性分子标记的检测与评估

为开发更多的适用于禾本科Poaceae植物通用性分子标记, 丰富竹类植物的遗传信息, 依据禾本科单拷贝同源基因(COSⅡ)已知序列的保守区域设计了14对引物, 以此引物对刚竹属Phyllostachys植物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增, 并对部分扩增产物进行测序。结果所有引物可以在至少1个材料中得到特异性扩增, 其中7对引物在5个供试材料中均能扩增到产物, 13对引物在5个样本中表现出多态性, 占引物总数的92.9%。对部分扩增产物进行测序, 所测序列均为特异性扩增序列。同一引物在不同样本中的扩增片段间存在单核苷酸多态性(SNP)位点, 部分SNP位点会导致氨基酸序列提前终止或酶切位点变化。对有合适内切酶存在的变异位点进行PCR-RFLP验证, 验证结果与测序结果一致。利用NTsys 2.10e软件, 对5个供试竹种材料进行了亲缘关系分析, 毛竹Phyllostachys edulis与绿粉竹Phyllostachys virdiglaucescens亲缘关系最近, 紫竹Phyllostachys nigra与其他4个竹种亲缘关系最远。所开发的14个COSⅡ引物在刚竹属植物中具一定通用性, 同时挖掘出更多竹类植物中的遗传信息。     

中国兰中几种常见DNA条形码标准序列的PCR扩增方法

[目的]DNA条形码技术是分子鉴定的最新进展之一,为了研究中国兰的DNA条形码技术,实现中国兰的快速鉴定。[方法]该文通过电泳成像技术、BLASTN核苷酸相似序列检验等分析方法,对一种中国兰ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等常用DNA条形码标准序列PCR扩增的方法进行了可行性检验。[结果]该方法可以在中国兰中有效扩增ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等条形码序列,并通过双向测序获得序列信息,ITS标准序列由于引物存在非特异性扩增,需要重新设计合适的引物。[结论]利用该方法,可以有效获得中国兰中ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等几种常见DNA条形标准序列,并大大简化了PCR反应操作步骤,为进一步研究中国兰的DNA条形码技术提供了参考和借鉴。     

16种观赏石斛兰的遗传关联性分析

石斛兰种质资源的评价与创新是育种工作的基础。为了挖掘石斛兰资源有效的分子标记以及优良目的性状相关基因,本研究主要观测了16份石斛兰种质资源形态学性状以及利用RAD-seq分子标记技术分析这些品种资源之间的遗传进化关系,对16种观赏石斛兰形态学与RAD-seq分子标记进行了关联分析。结果表明,形态学分析显示16个石斛兰品种间遗传变异较大,相似系数在0.776～0.926之间;与形态学结果相比,16个石斛兰品种RAD-seq的测序结果显示种间遗传差异更大,与参考基因组相比相似系数在0.252 2～0.898 2之间。RAD-seq聚类分析表明,聚石斛、霍山石斛和金钗石斛亲缘关系较近;形态学关联分析发现,这3个石斛兰品种都具有花香且花序侧生现象,其他石斛兰品种没有此特征。对这3个石斛兰品种区别于其他品种的SNP标记位点相关序列进行提取和注释,发现了大量的次生代谢途径和光合作用相关基因。16个观赏石斛兰品种间存在较丰富的遗传多样性,其中聚石斛、霍山石斛和金钗石斛亲缘关系较近,并发现分类结果可能与花香和花序侧生现象相关。     

基于ITS2条形码对龙虎山野生石斛资源的研究

铁皮石斛是我国名贵中草药之一,位列"中华九大仙草"之首。选取江西龙虎山铁皮石斛样品中的31株样本进行品种鉴定,采用DNA条形码对31株样本进行ITS2序列分析,利用软件MEGA6.0对筛选得到的31个ITS2序列进行遗传距离的测定和进化树的构建,确定其之间的亲缘关系,发现其中有6个品种为龙虎山特有品种,就此建立起江西龙虎山铁皮石斛资源库,为保护江西优质的石斛资源奠定理论基础。     

凉粉草DNA条形码通用序列的筛选及其混伪品分子鉴定

提取凉粉草基因组总DNA,使用通用引物扩增核基因ITS1、ITS2序列和叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK序列并进行测序,使用CodonCode Aligner软件对完整序列进行拼接并对其进行比对,使用MEGA 7.0邻接法(neighborjoining,NJ)法构建系统聚类树。结果表明,matK序列扩增成功率低;ITS1序列存在单一变异位点且测序成功率低;ITS2、rbcL和psbA-trnH等3个序列无变异位点,序列扩增成功率、测序成功率高,序列长度在233~671 bp,从系统聚类树上得出ITS2序列可以将凉粉草与其他3种混伪品区分开,而rbcL和psbA-trnH序列在区分时存在一定的混淆。ITS2序列可以考虑作为鉴别凉粉草的优选序列。     

铁皮石斛和金钗石斛杂交后代的分子鉴定

铁皮石斛和金钗石斛是《中华人民共和国药典(2015版)》收录的2种药用石斛,具有重要的药用价值和经济价值。然而,目前关于这2种石斛药用价值的遗传基础研究和优良新品种选育等相对较弱。本研究以铁皮石斛和金钗石斛2个亲本,以及它们的131个F₂代杂交单株作为研究对象,从320对SSR引物中筛选出特异性引物,用于铁皮石斛和金钗石斛杂交后代的真假杂种鉴定。结果表明,3对石斛属特异性SSR引物DNtSSR013、DNtSSR147和DNtSSR150,可将杂交群体扩增带型分为真杂交种型、母本型、父本型、缺失型,进而从131个杂交群体F₂代中共鉴定出119个真杂交种,真杂交种占杂交群体的91%。因此,利用SSR分子标记技术鉴定石斛杂交群体是可行的,相关结果为铁皮石斛和金钗石斛的遗传图谱构建,石斛多糖和石斛碱等活性成分QTL定位奠定了基础。     

苏钟猪个体身份SNP识别的数字条形码编制

苏钟猪是江苏省农业科学院利用太湖猪为母本,长白猪为父本育成的品种。为苏钟猪个体身份识别及猪肉产品溯源之需,对苏钟猪个体身份SNP识别进行研究。本研究共设计29对引物,并从中筛选7对引物用于苏钟猪的个体身份识别。7对引物扩增产物能直接测序且测序图谱背景干净,序列阅读无歧义。7对引物共扩增52个SNP位点,经关联性分析及杂合度过滤(H≥0.1)后,选留41个SNP位点用于苏钟猪个体身份识别的数字条形码编制;同时,编制了7头公猪和12头母猪所生的96头苏钟猪个体身份SNP识别的数字条形码,数字条形码很好地区分了96头苏钟猪的个体身份。根据96头苏钟猪条形码编制时分离到的各引物对扩增片段的基因型数,7对引物扩增的41个SNP位点,理论上可用于近5.00×106头猪的个体身份识别。因此,本研究建立的苏钟猪个体身份SNP识别的数字条形码编制方法,可用于规模猪场苏钟猪的个体身份识别及肉产品溯源。     

不同地区毛鸡骨草与鸡骨草rbcL 序列差异分析

应用改良CTAB法提取不同产地毛鸡骨草与鸡骨草的总DNA,PCR 扩增其rbcL 序列并测序,应用MEGE5.1 软件作 序列同源性分析,计算遗传距离并构建系统发育邻接树。结果表明,毛鸡骨草与鸡骨草各具为一支,有亲缘关系,可见rbcL 序列可成功区分两者,因此,rbcL 序列可以作为鸡骨草的DNA 条形码。