贵阳市市售鸡肉中五种食源性致病菌污染状况调查研究

对贵阳市市售鸡肉中5种食源性致病菌的污染情况进行调查,结果表明:50份样品中食源性致病菌总检出率为48%,其中空肠弯曲菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌的检出率分别为24.0%、22.0%、6.0%、2.0%、0,40份冻鸡肉样品的检出率为55%,10份鲜鸡肉样品的检出率为20%。对农贸市场市售冻鸡肉样品进行抽查,34份样品中5种致病菌的检出率为58.8%,其中空肠弯曲菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌的检出率分别为32.3%、17.6%、5.9%、2.9%、0;对6份超市冻鸡肉样品进行检测,食源性致病菌的检出率为33.3%,其中空肠弯曲菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌的检出率分别为0、16.7%、16.7%、0、0。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立了食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。选取hlyA基因作为靶序列设计1对引物,在单核细胞增生李斯特氏菌中能扩增出356 bp的预期片段,大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的单增李斯特菌种特异性。纯培养的检测极限为46个细菌。用该方法对36份食品样品进行检测,检测结果与分离鉴定方法完全相符,表明该方法可适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测。     

单核细胞增生性李斯特菌分离鉴定

按照国家标准检测了4类肉制品中的361份样品。应用PCR方法检测了单增李斯特菌溶血素hly基因。分析单核细胞增生性李斯特菌在即食食品中污染情况。共检出20株单增李斯特菌,检出率为5.54%(20/361),主要污染来源是调理肉制品,污染率高达16.88%(13/77)。阳性菌株中含有溶血素基因的菌株有18株,占90%。表明被检测地区肉类食品中,致病性单增李斯特菌污染率较高。     

动物源性空肠弯曲菌的临床检测与特性分析

为做好畜禽疾病防控及动物性食品安全评价,根据空肠弯曲菌的16S rDNA基因和马尿酸酶基因(hipO)分别设计2对特异性引物,建立双重PCR方法用于空肠弯曲菌的检测。通过对参考菌株的测定,确定了其特异性高、灵敏度强,最小检出的DNA浓度达1 pg·μL~(-1)。在采集的540份临床健康羔羊肛拭子样品和92份患病畜禽肠道样品中,共检出10份样品为空肠弯曲菌阳性,其中羊、鸡、鹅的阳性检测率分别为0.74%、10.5%和12.5%。通过细菌分离纯化,获得了10株空肠弯曲菌。体外培养试验发现羊源分离株生长速度低于鸡源和鹅源分离株。药敏试验表明所有分离株对磺胺类药物完全耐药;对头孢菌素类、四环素类、喹诺酮类药物的耐药性较高,且所有菌株均为多重耐药菌株。     

单核细胞增生性李斯特氏菌virR和mprF基因分布

为了研究virR和mprF基因在单核细胞增生性李斯特氏菌中的分布状况,为单核细胞增生性李斯特氏菌的防治及追踪污染源提供依据,本试验以分离自石家庄、保定地区的生鲜肉、水产品、速冻食品等6类不同来源共189株单核细胞增生性李斯特氏菌菌株为研究对象,利用热启动PCR技术对virR和mprF基因的分布进行了检测。结果表明:virR基因的总检出率为92.1%,mprF基因的总检出率为96.3%,且同时含有这2个基因的概率为91.5%;食品来源不同,单核细胞增生性李斯特氏菌virR、mprF基因的检出率稍有差异,且同一来源的菌株其mprF的检出率都稍高于virR,这表明不同的基因在单核细胞增生性李斯特氏菌中的分布存在差异。     

单核细胞增生李斯特菌qPCR检测方法的建立及应用

【目的】为了建立一种快速、准确、可靠的畜产品中单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测方法。【方法】根据保守序列设计并筛选出一对特异性引物，经过反应体系及程序优化，建立染料法qPCR检测方法，并使用临床样品评价该检测方法的效果。【结果】建立的qPCR方法特异性较好，扩增，对纯培养细菌的检测限可达到10² CFU/mL,检测方法变异系数小，稳定性高；对生猪肉和牛奶人工污染模型中的检测限为10³ CFU/mL,比普通PCR灵敏度高10倍。使用qPCR分别对50份牛奶样品和生猪肉样品检测，阳性率均为2.00%,与普通PCR方法验证结果一致。【结论】成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR方法，可以用于临床样品单核细胞增生李斯特菌的检测。     

实时荧光PCR法与国标法检测单增李斯特菌比较

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是食源性致病菌之一,可引起人和动物患病。对食品中单增李斯特菌进行检验,对保障食品安全至关重要。为明确实时荧光PCR法在食源性单增李斯特菌检测中的最低检出限以及在不同食品类型中的检出效率,对实时荧光PCR法检测单增李斯特菌的最低检出浓度进行了摸索与验证,对人工污染单增李斯特菌的豆粉、饼干、生菜、猪肉4种食品,在不同培养时间点取样采用实时荧光PCR法检测,同时与国标法GB 4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》检测进行了比较。结果表明,实时荧光PCR法具有检测速度快、灵敏度高的优点,可在快速检测中应用,但因其死菌可以产生假阳性问题,而国标法检测可以分离得到污染菌株用于后续研究,因此,建议对于实时荧光PCR法检测阳性的样品用国标方法复检确认。     

PCR在快速检测食品单核细胞增多性李斯特菌中的应用

为应用PCR快速检测食品中的单核细胞增多性李斯特菌,设计合成了针对单核细胞增多性李斯特菌溶血素编码基因的特异性引物进行PCR扩增.结果表明,在单核细胞增多性李斯特菌中能扩增出348bp的预期片段,大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和李斯特属的绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌和格氏李斯特菌的扩增结果均为阴性.用该方法检测了81份食品样品,检测结果与分离鉴定方法一致,表明本方法可用于食品中单核细胞增多性李斯特菌的快速检测.检测样品中,单核细胞增多性李斯特菌污染率为8.6%,以禽肉类制品中的污染率最高.     

江苏地区临床健康肉羊的产气荚膜梭菌感染分析

为揭示临床健康肉羊的产气荚膜梭菌感染概况,于2018年4-6月选择江苏地区肉羊养殖场30个,采集3～5月龄肉羊肛拭子样品892份.所有样品接种至梭菌增菌液,于厌氧条件下增菌培养后,以PCR进行产气荚膜梭菌的检测,并对部分检测为产气荚膜梭菌阳性的样品进行细菌分离.结果表明:175份(19.62％)肛拭子样品为产气荚膜梭菌阳性,提示临床健康肉羊的消化道可携带产气荚膜梭菌.数据分析表明,3、4、5月龄羊差异不显著,免疫羊与未免疫羊差异不显著.通过对分离的68株产气荚膜梭菌进行α、β、ε和ι毒素基因检测,确定了其中43株(63.24％)为A型产气荚膜梭菌,25株(36.76％)为D型产气荚膜梭菌,提示A、D型是江苏地区肉羊感染的主要产气荚膜梭菌类型.     

应用LAMP检测方法检测乳制品中的单核细胞增生李斯特氏菌（英文）

[目的]考察LAMP方法检测乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌的可靠性。[方法]使用恒温环介导技术,以单核细胞增生李斯特氏菌编码的李氏溶血素O的hly A基因为研究对象设计引物,建立单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP快速检测方法。[结果]LAMP法特异性强,灵敏度与荧光定量PCR相当。使用LAMP方法检测各种乳制品中的单核细胞增生李斯特氏菌结果与细菌分离方法检测结果完全一致。[结论]LAMP检测结果可以通过肉眼直接加以鉴别,适合乳制品突发事件情况中的检测。     

绵羊产单核细胞李斯特菌的分离及鉴定

采用生化反应、溶血试验、致病力试验等常规方法对从疑似产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)患病羊脑组织分离的病原作了初步鉴定.通过PCR扩增hlyA基因部分保守序列,测序证实其与已报道的核苷酸序列的同源性达到100%,从而确诊该菌为产单核细胞李斯特菌.     

MPN-PCR法定量检测武汉鸡肉制品中的空肠弯曲菌

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是引起人类细菌性腹泻的主要人畜共患病原菌之一,严重时可导致人类格林-巴利综合征。其中鸡肉污染导致的食源性传播是人类感染的重要原因。为了调查武汉市鸡肉制品的空肠弯曲菌污染情况,运用最可能数法(MPN)及聚合酶链式反应(PCR)技术结合,即MPNPCR方法 ,对市场采集的128份鸡肉样品进行了空肠弯曲菌的定量检测,结果阳性检出率为18.75%,其中鲜鸡肉检出率为28.26%,冻鸡肉检出率为13.41%,含菌量范围为3.6~92.0 MPN/g。     

应用PCR快速检测单核细胞增生症李斯特菌的研究

用聚合酶链式反应(PCR)扩增hly基因,检测单核细胞增生症李斯特菌的纯培养物及其模拟污染的生猪肉、水和牛奶。41株单核细胞增生症李斯特菌的PCR结果呈阳性,而其他李斯特菌,包括英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威儿李斯特菌和格氏李斯特菌以及非李斯特菌均未出现特异性片段。这表明所扩增的hly基因3′末段850bp的DNA片段对单核细胞增生症李斯特菌具有较高的特异性。PCR对单核细胞增生症李斯特菌纯培养物的检测低限达10~5cfu·mL~(-1),对16hLEB增菌培养的模拟污染生猪肉、水和牛奶的增菌培养液用PCR捡测,结果检测生猪肉低限达400cfu·kg~(-1)、水和牛奶为400cfu·L~(-1)。整个检测过程只需24h。这表明PCR法对单核细胞增生症李斯特菌的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点。     

荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌

[目的]建立一种快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法。[方法]针对单核细胞增生性李斯特氏菌的特异基因hlyA,结合锁定寡核苷酸（LNA）,设计引物和探针,利用阳性质粒和模拟标本建立单核细胞增生性李斯特氏菌实时定量荧光PCR检测方法。[结果]以单核细胞增生性李斯特氏菌为模板克隆了hlyA基因,得到阳性质粒,并进一步建立了荧光定量PCR方法,得到标准曲线Y=-3.273 X＋37.640,相关系数R2=1.000;该方法的灵敏度可以达到1.2×10 CFU/ml;人工污染猪肉检出限可以达到3.2×102 CFU/ml。[结论]建立了快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法,为实现食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测构建了一个技术平台。     

鸡肉中单核细胞增生李斯特氏菌的分离与鉴定

对从长春地区某一肉鸡屠宰加工厂扦取的１５２个东鸡肉样品进行的单核细胞增生李斯特氏菌分析,对分离菌株用ＡＰＩ Ｌｉｓｔｅｒｉａ试剂盒及其他方法进行了鉴定。经检验,１５２个样品中有１６个样品（１０．５％）为单核细胞增生李斯特氏菌阳性,另有８７个（５７．２％）为Ｌ．ｉｎｏｃｕａ,Ｌ．ｗｅｌｓｃｈｉｍｅｒｉ和Ｌ．ｇｒａｙ阳性。为了比较ＯＸＡ和ＰＡＬＣＡＭ这２种选择培养基的单核细胞增生李斯特氏菌的分离效果,     

牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法的建立

【目的】建立牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法。【方法】根据布鲁氏菌IS711序列和单增李斯特菌毒力因子HlyA序列设计并合成引物,建立双重PCR检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检测,并制备污染模型乳,通过直接检测、增菌后检测、细菌富集后增菌检测,确定最低检测限。【结果】建立了牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法,该方法特异性好、敏感性高、可重复性好。布鲁氏菌和单增李斯特菌单PCR检测最小DNA质量浓度分别为0.282和3.33 pg/μL,双重PCR检测最小DNA质量浓度分别为2.82和33.3 pg/μL。感染模型乳不经过增菌,布鲁氏菌和单增李斯特菌最低检测限分别为104和8×104CFU/mL;经过24h增菌,就可以检测到10 CFU/mL的布鲁氏菌,经过12 h增菌,就可以检测到8 CFU/mL的单增李斯特菌;经过离心法富集细菌后再增菌,灵敏度可以扩大40~50倍,布鲁氏菌经24 h增菌后最低检测限为10 CFU/40 mL,单增李斯特菌经12 h增菌后最低检测限为8 CFU/40 mL。【结论】建立的双重PCR检测方法特异、灵敏、可重复,可单独或同时检测牛奶中的布鲁氏菌和单增李斯特菌,也可以用于其他产品中布鲁氏菌和单增李斯特菌的检测。     

单核细胞增生李斯特菌新型内化素lmo0549的分子特征及其表达

应用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)新型内化素lmo0549基因进行克隆和测序,并对其进行生物信息学分析;通过扩增获得Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区序列,并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,转入大肠杆菌中用异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,简称IPTG)诱导表达,应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot)鉴定重组蛋白的表达形式及其抗原特异性。序列分析结果表明,扩增得到的lmo0549基因全长为2 034 bp,编码677个氨基酸,其信号肽序列是前23个氨基酸,在Lmo0549蛋白氨基酸序列中,从N端到C端分别包括5个富含亮氨酸的重复基序(LRR)、1段PKD重复序列和1个WxL结构域;同时还存在N-联糖基化位点10个、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点14个、蛋白激酶C磷酸化位点15个。同源性分析显示,LM-SB5 lmo0549基因编码的蛋白氨基酸序列与标准株李斯特菌EGD-e,(NC_003210.1)蛋白氨基酸序列的同源性为88.04%,且在单核细胞增生李斯特菌中具有较高的保守性。SDS-PAGE分析显示,表达的Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区具有与理论值33.8 ku相符的分子质量;蛋白质印迹法分析表明,重组蛋白Lmo0549与LM阳性血清可发生特异性免疫反应,为进一步探讨Lmo0549在LM侵入宿主细胞的分子作用机制奠定了前期基础。     

禽源大肠埃希菌ETT2毒力岛Duplex PCR检测

禽致病性大肠埃希菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的毒力基因较为复杂,其中ETT2(Escherichia coli type three secretion system 2)毒力岛在禽源大肠埃希菌鲜有报道。选择ETT2两端的ECs3703和ECs3737作为检测标志基因,参照文献合成2对引物,建立Duplex PCR方法用于快速检测携带ETT2的禽源大肠埃希菌。通过对参考菌株的扩增,建立特异的Duplex PCR快速检测方法。通过对187份临床样品的检测,发现其中77份(41.2%)样品存在ETT2阳性大肠埃希菌感染;通过对247株禽源大肠埃希菌临床分离株的检测,发现46.9%的禽源大肠埃希菌携带ETT2毒力岛。     

食品中单增李斯特菌荧光PCR检测方法的建立

以单增李斯特菌的hly A基因为靶序列,针对该序列保守区,设计一对特异性引物和探针。通过反应体系和反应程序的优化,建立起单增李斯特菌荧光PCR检测方法,并以单增李斯特菌和9种相关细菌考核该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果表明该方法特异性和重复性好,具有较低的灵敏度,最低可检测到5 cfu/m L。临床样品检测中,该方法与国标法结果一致,说明研究建立的单增李斯特菌荧光PCR方法是快速鉴定单增李斯特菌的有效方法,具有较大的应用和推广价值。     

弯曲菌多重PCR检测方法的建立及其初步应用

以16S rRNA、mapA和ceuE为靶基因,建立检测空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的多重PCR方法。特异性试验能分别扩增出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的特异性条带,其他参考菌株均未扩增出条带;敏感性试验表明,基于增菌培养和选择性培养的多重PCR方法对弯曲菌检测限为10 mL或10 g模拟污染样品,最低可检测0.925 pg.μL-1空肠弯曲菌DNA和1.050 pg.μL-1结肠弯曲菌DNA。以国家标准为参照,应用该方法对180份生鲜鸡肉样品进行检测,结果表明多重PCR方法具有快速、简便、特异性强和灵敏度高等特点,可克服传统生化鉴定和血清学方法的不足,为弯曲菌检测提供新的技术。