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【目的】α-酮戊二酸脱羧酶(α-ketoglutaric acid decarboxylase,α-KGD)是蓝细菌三羧酸循环途径中的一个关键酶。试验旨在优化集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白的原核表达方法,并对不同表达方法获得的重组sll1981蛋白进行活性测定。【方法】利用分子生物学技术构建含有sll1981基因的多种表达载体,通过SDSPAGE分析这些表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达和可溶性情况,利用Ni-NTA亲和层析分离纯化重组sll1981蛋白,然后通过酶偶联法测定重组sll1981蛋白的催化活性。【结果】含有sll1981基因的不同表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达良好,然而重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性差异较大。【结论】当pET28bsll1981质粒与pTf16分子伴侣质粒在大肠杆菌中共表达时重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性均为最佳。酶动力学测试表明集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白具有α-酮戊二酸脱羧酶功能。为进一步研究α-酮戊二酸脱羧酶的结构功能关系及催化机制提供重要基础。 相似文献
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用PCR方法扩增产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因(ALDC),得到0.78 kb的DNA片段,扩增片段重组到依赖T4 RNA聚合酶的高效表达载体pQE-30中,在大肠杆菌中得到高效表达,酶活性可高达180 U/mL发酵液,经稳定性测定,重组菌株在37 ℃连续培养至67代时仍保持酶活性。 相似文献
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《金陵科技学院学报》2016,(3)
L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)以L-天冬氨酸为底物,脱去α-羧基后生成β-丙氨酸。将结核杆菌中的panD基因克隆后连接到pET30a(+)载体上在E.coli BL21(DE3)中进行重组表达。通过对诱导乳糖浓度、温度等发酵条件的优化,得到最佳培养条件为:乳糖浓度10g·L~(-1),诱导温度30℃。最佳条件下工程菌株酶活力达到200U以上。 相似文献
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【目的】研究α-酮戊二酸(AKG)对经脂多糖(LPS)多次刺激后断奶仔猪肌肉能量代谢的影响及其分子机制。【方法】采用2×2因子试验设计,LPS刺激(有、无)和AKG添加量(0、1%)为2个主效应,共4个处理组。选取24头(6.79±0.32)kg的断奶仔猪(杜洛克×长白×大白),随机分配到4个处理组,每个处理设6个重复(猪)。LPS刺激组仔猪在试验的第10、13和15 天腹腔注射100 μg?kg-1 BW LPS,无LPS刺激组注射等量的生理盐水。第16 天仔猪麻醉后进行屠宰,取腓肠肌样品,反相高效液相色谱法检测腓肠肌细胞内腺苷酸水平,Western blotting检测腓肠肌AMP激活蛋白激酶(AMPK)和乙酰CoA羧化酶(ACC)表达及其磷酸化。【结果】()日粮添加1%AKG和LPS刺激对仔猪腓肠肌AMP含量和AMP/ATP的影响存在交互作用(P<0.05)。仔猪日粮中添加1% AKG能显著提高腓肠肌ADP水平(P<0.05),缓解了LPS刺激引起的AMP水平和AMP/ATP升高、ADP和能荷(EC)降低(P<0.05)。(2)LPS刺激和日粮中添加AKG对AMPK表达量和AMPK磷酸化水平(pAMPK/AMPK)均无影响。(3)日粮中添加1% AKG抑制了ACC的磷酸化;LPS刺激使ACC表达量升高(P<0.05),并促进ACC磷酸化(P<0.05)。【结论】LPS刺激增加肌肉能量损耗,日粮中添加1% AKG有利于肌肉维持正常的能量代谢;日粮添加AKG通过调控ACC的活性与表达影响肌肉能量代谢;AKG可能通过ACC信号影响肌肉能量代谢,进而改善LPS刺激下机体能量代谢状态。 相似文献
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为鉴定和分析aziU1基因的启动子PaziU1,将该基因上游183bp的DNA片段和组成型强启动子PermE*(作为阳性对照)分别克隆到启动子探针载体pIJ8660中,以增强型的绿色荧光蛋白基因(egfp)作为报告基因,通过检测菌丝体中绿色荧光的强弱,对PaziU1的启动子活性进行了定性和定量分析。PaziU1在3种不同的链霉菌Streptomyces sahachiroi、Streptomyces lividans ZX1和Streptomyces albus中均表现出启动子活性。PaziU1的启动子活性在初始培养的36h略低于PermE*,在培养48h后,PaziU1的表达活性高于PermE*。结果表明,Pazi U1与PermE*一样,是一个可以在链霉菌中组成型表达的强启动子。 相似文献
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该研究通过硫胺素( VB1)营养缺陷型负选择法,从中国淄博食用油污染的土壤中获得一株酵母属菌株 R6。该菌株具有累积胞外α-酮戊二酸(α-KG)的能力。生理学和生物化学实验表明该 R6菌株与已测试的 API 20 C AUX酵母鉴别系统中的胶红酵母具有共同特征。此外,R6菌株的18S rDNA 基因已经获得并测序,基于该序列以及同源菌属所得到的系统进化学分析表明菌株 R6与胶红酵母属成员具有99%的同源性。因此,菌株 R6被鉴别为胶红酵母属的一员。随后,本实验通过控制单一发酵变量以及高效液相色谱法(HPLC)检测优化了R6累积α-KG的发酵条件。当发酵培养基中添加的 VB1和 CaCO3的浓度分别为0.03 mg/L和60 g/L时,α-KG达到6.035 g/L的最高产量。天然营养缺陷型的 R6菌株的发现不仅丰富了通过发酵生产α-KG的微生物来源,而且为进一步的发酵调控奠定了基础,从而实现过量的α-KG的累积。 相似文献
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研究伞枝犁头霉D1利用蔗糖生产α-酮戊二酸的发酵条件优化.结果表明:1)最佳发酵培养基组成为:蔗糖40 g/L,NaNO3 1 g/L,KH2PO4 1.36 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,NaCl 2 g/L,玉米浆0.5 g/L,CaCO3 40 g/L,叶酸2 g/L.2)最佳培养条件为:250 mL摇瓶装液25%,培养温度37℃和转速200 r/min.在此条件下培养84 h,伞枝犁头霉产α-酮戊二酸量最大达14.0 g/L,产酸速率为0.17 g/(L·h),对蔗糖的转化率为34.9%.伞枝犁头霉D1能够有效利用蔗糖发酵产α-酮戊二酸,具有较好的科研价值和工业应用前景. 相似文献
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产淀粉酶高温菌在淀粉酶的生产中具有重要意义。从温泉中分离到1株可在60℃快速生长的淀粉酶产生菌A12,经16SrDNA序列比较和丙酸盐利用等实验将其鉴定为地衣芽孢杆菌。构建了地衣芽孢杆菌A12基因库,并从中克隆到一个α-淀粉酶基因amyA1,对其进行了测序分析,并在大肠杆菌中实现了表达。本研究为构建一个耐高温淀粉酶生产用工程菌奠定了基础。 相似文献
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《贵州农业科学》2015,(12)
为获得滇龙胆GrMDC基因序列,以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆GrMDC基因,并进行原核表达和组织特异性表达分析。结果表明:滇龙胆GrMDC基因(登录号KJ917169)全长1 275bp,GrMDC蛋白相对分子量为46.77kD,pI为5.97;该蛋白可能定位于细胞质,无信号肽,为亲水不稳定蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;GrMDC蛋白与长春花CrMDC蛋白相似性较高(88.12%),且亲缘关系最近;GrMDC基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为72.77kD(含GST标签26kD),与预期蛋白大小一致;GrMDC基因主要在根中表达。 相似文献
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改进型中草药921合剂结合α-酮戊二酸对断奶大鼠肠道免疫的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
研究了改进型中草药921合剂结合α 酮戊二酸(α ketoglutarate,AKG)作为饲料添加剂对体重为40.0±5g18日龄断奶大鼠小肠上皮淋巴集结数量、面积和十二指肠肠液中IgA的含量进行了测定。纯系断奶大白鼠被随机分为对照组、中草药组和中草药加AKG组,每组10只,分别饲喂1~2周,然后对上述内容进行研究。结果为:饲喂1周后,对照组、中草药组和中草药加AKG组小肠上皮淋巴结数量分别为16.4±1.23,14.2±0.63,15.1±0.68个(P>0.05);3组间十二指肠肠液中IgA含量分别为0.844±0.020,0.921±0.039,1.236±0.131g·L-1(P<0.01)。饲喂2周后对照组、中草药组和中草药加AKG组小肠上皮淋巴结数量分别为15.6±0.50,16.4±0.94,15.6±0.99个(P>0.05);3组间前段肠上皮淋巴集结面积分别为27.7±2.02,44.8±4.34,42.4±1.93mm2(P<0.01);中段分别为28.1±1.10,40.5±5.68,55.4±2.28mm2(P<0.01);后段分别为37.6±4.57,63.6±4.94,59.0±5.35mm2(P<0.01);3组间十二指肠肠液中IgA含量分别为0.256±0.015,0.493±0.030,0.601±0.047g·L-1(P<0.01)。中草药组和中草药加AKG组十二指肠IgA含量均显著高于对照组。研究表明:中草药结合AKG可以通过增加小肠上皮淋巴集结面积,增加肠道IgA的分泌,从而快速有效的改善肠道的生长和发育及黏膜 相似文献
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《(《农业科学与技术》)编辑部》2015,(5)
该研究通过硫胺素(VB1)营养缺陷型负选择法,从中国淄博食用油污染的土壤中获得一株酵母属菌株R6。该菌株具有累积胞外α-酮戊二酸(α-KG)的能力。生理学和生物化学实验表明该R6菌株与已测试的API 20 C AUX酵母鉴别系统中的胶红酵母具有共同特征。此外,R6菌株的18S r DNA基因已经获得并测序,基于该序列以及同源菌属所得到的系统进化学分析表明菌株R6与胶红酵母属成员具有99%的同源性。因此,菌株R6被鉴别为胶红酵母属的一员。随后,本实验通过控制单一发酵变量以及高效液相色谱法(HPLC)检测优化了R6累积α-KG的发酵条件。当发酵培养基中添加的VB1和Ca CO3的浓度分别为0.03 mg/L和60 g/L时,α-KG达到6.035 g/L的最高产量。天然营养缺陷型的R6菌株的发现不仅丰富了通过发酵生产α-KG的微生物来源,而且为进一步的发酵调控奠定了基础,从而实现过量的α-KG的累积。 相似文献
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从链霉菌Streptomyces sahachiroi ATCC 33158基因组中克隆到1个聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因orf18。生物信息学及进化树分析表明它可能属于rppA类Ⅲ型PKS基因。通过RT-PCR证实了该基因在野生型S.sahachiroi中是可以进行转录表达的。HPLC和LC-MS分析的结果表明orf18在S.lividans中异源表达时可产生1,3,6,8-四羟基萘(THN),并且发现该基因也可以在革兰氏阴性菌Pseudomonas stutzeri中异源表达并产生明显的棕红色色素。证明orf18编码的蛋白属于RppA类Ⅲ型PKS,可催化THN的合成,而产物THN在革兰氏阴性菌P.stutzeri中可进一步氧化及聚合形成棕红色色素。 相似文献
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《大连海洋大学学报》2015,(4)
为了研究α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,AKG)对杂交鲟Acipenser schrenckii♀×Acipenser baeri♂肠道形态、消化酶活力和抗氧化能力的影响,在22℃条件下用添加AKG的饲料饲喂体质量为(7.65±0.04)g的杂交鲟,试验分为4组,每组设5个平行,每个平行放25尾鱼,试验饲料分为大豆浓缩蛋白源、鱼粉与大豆浓缩蛋白复合蛋白源两种,每种蛋白源饲料均添加不同浓度(0和1%)的α-酮戊二酸,用4种试验饲料分别饲喂4组体质量为(7.65±0.04)g的杂交鲟鱼8周。结果表明:AKG能显著提高杂交鲟后肠绒毛高度(P0.05),不同蛋白源对肠道形态均无显著影响(P0.05),蛋白源和AKG对肠道形态无交互作用(P0.05);AKG能显著提高杂交鲟蛋白酶活性(P0.05),但对脂肪酶和淀粉酶无显著影响(P0.05),大豆浓缩蛋白源能显著提高蛋白酶和淀粉酶活性(P0.05),复合蛋白源对肠道消化酶活性无显著影响(P0.05),蛋白源和AKG对脂肪酶和淀粉酶活力有交互作用(P0.05);AKG能显著提高肠道中SOD活性并显著降低MDA含量(P0.05),但对GSH和CAT含量均无显著影响(P0.05),不同蛋白源对肠道抗氧化能力均无显著影响(P0.05),蛋白源和AKG对MDA含量有交互作用(P0.05),对其他抗氧化指标均无交互作用(P0.05)。研究表明,饲料中添加AKG可以促进杂交鲟肠道发育,提高肠道消化酶活性和抗氧化能力。 相似文献
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以普通小麦陕225为材料,同源克隆小麦脂肪酸α-双加氧酶基因(TaDOX)cDNA,全面分析其基因结构、染色体定位、进化关系及蛋白结构特征,并利用实时定量RT-PCR分析其在PEG和盐胁迫下的表达模式。克隆的cDNA片段长1 854bp,编码617个氨基酸残基的小麦脂肪酸α-双加氧酶。TaDOX基因组DNA长5 529bp,位于小麦5D染色体长臂,包含10个外显子。小麦、水稻等禾本科植物α-DOX序列高度同源,聚集在同一独立进化枝,而双子叶植物存在2类DOX蛋白,聚集在另外2个分枝中。TaDOX具有脂肪酸α-双加氧酶以α-螺旋为主的空间结构特征,包含血红素结合位点及保守氨基酸His310、Thr315、Tyr378、Arg558组成的活性中心。TaDOX主要在叶和根中表达,花序和种子中也有痕量表达;叶片中TaDOX的表达在PEG和盐胁迫条件均明显下降;根中TaDOX的表达在PEG胁迫条件下无显著变化,但在盐胁迫条件下表达水平急剧升高。 相似文献
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提取已鉴定的A型魏氏梭菌Clostridium welchii贵州分离株的染色体DNA,经酶切回收分子长2~4kb的DNA片段混合物,将其插入质粒载体pUCl9中,并转化至E.coli JMl09,通过Amp抗药性和显色反应的选择,再提取阳性重组细菌质粒进行探针检测、酶切分析和PCR鉴定,筛选出含魏氏梭菌α-毒素基因的重组大肠杆菌;经溶血与溶血抑制试验及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实,重组E.coli的表达产物符合α-毒素的生物学特性。 相似文献
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[目的]开发具有高表达活力的耐热耐酸新型真菌α-淀粉酶,研究其酶学性质和催化活性,探讨其潜在工业应用潜力.[方法]采用RT-PCR从嗜热真菌微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)中克隆耐热α-淀粉酶基因,并命名为RpAmy.以质粒pPIC9K为表达载体,将α-淀粉酶基因(RpAmy)转入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达宿主KM71,进行异源表达,并测定动力学参数和酶学性质,分析水解淀粉的产物.[结果]克隆得到嗜热真菌微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)耐热α-淀粉酶基因,其开放阅读框全长1416 bp,编码471个氨基酸,与米根毛霉α-淀粉酶的氨基酸序列相似性最高(56.0%).RpAmy在毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71中表达,最高酶活达到32100.0 U/mL,蛋白表达量为1.5 mg/mL;测定纯化后RpAmy比活力、Km和Vmax,分别为6745.9 U/mg、2.26 mg/mL、0.2875 mg/mL·min;最适pH和最适温度分别为pH 4.0、70℃;具有较宽的pH耐受性(4.0~9.0)和较高的温度耐受性(60℃);水解可溶性淀粉产物主要为麦芽糖(69.0%,w/w)和葡萄糖(22.0%,w/w).[结论]从微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)中克隆得到α-淀粉酶基因(RpAmy),其可在毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71中高效异源表达并得到α-淀粉酶RpAmy.该酶具有较好的耐酸耐热性质,并能水解淀粉产生高麦芽糖含量的糖浆,在工业应用方面具有很大的潜力. 相似文献