集胞藻PCC6803中α-酮戊二酸脱羧酶的原核表达分析

【目的】α-酮戊二酸脱羧酶(α-ketoglutaric acid decarboxylase,α-KGD)是蓝细菌三羧酸循环途径中的一个关键酶。试验旨在优化集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白的原核表达方法,并对不同表达方法获得的重组sll1981蛋白进行活性测定。【方法】利用分子生物学技术构建含有sll1981基因的多种表达载体,通过SDSPAGE分析这些表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达和可溶性情况,利用Ni-NTA亲和层析分离纯化重组sll1981蛋白,然后通过酶偶联法测定重组sll1981蛋白的催化活性。【结果】含有sll1981基因的不同表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达良好,然而重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性差异较大。【结论】当pET28bsll1981质粒与pTf16分子伴侣质粒在大肠杆菌中共表达时重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性均为最佳。酶动力学测试表明集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白具有α-酮戊二酸脱羧酶功能。为进一步研究α-酮戊二酸脱羧酶的结构功能关系及催化机制提供重要基础。     

产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆及其表达

用PCR方法扩增产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因（ALDC）,得到0.78 kb的DNA片段,扩增片段重组到依赖T4 RNA聚合酶的高效表达载体pQE-30中,在大肠杆菌中得到高效表达,酶活性可高达180　U/mL发酵液,经稳定性测定,重组菌株在37 ℃连续培养至67代时仍保持酶活性。     

结核杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶诱导表达条件研究

L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)以L-天冬氨酸为底物,脱去α-羧基后生成β-丙氨酸。将结核杆菌中的panD基因克隆后连接到pET30a(+)载体上在E.coli BL21(DE3)中进行重组表达。通过对诱导乳糖浓度、温度等发酵条件的优化,得到最佳培养条件为:乳糖浓度10g·L~(-1),诱导温度30℃。最佳条件下工程菌株酶活力达到200U以上。     

α-酮戊二酸对脂多糖刺激断奶仔猪肌肉能量代谢的影响

 【目的】研究α-酮戊二酸(AKG)对经脂多糖(LPS)多次刺激后断奶仔猪肌肉能量代谢的影响及其分子机制。【方法】采用2×2因子试验设计,LPS刺激(有、无)和AKG添加量(0、1%)为2个主效应,共4个处理组。选取24头(6.79±0.32)kg的断奶仔猪(杜洛克×长白×大白),随机分配到4个处理组,每个处理设6个重复(猪)。LPS刺激组仔猪在试验的第10、13和15 天腹腔注射100 μg?kg-1 BW LPS,无LPS刺激组注射等量的生理盐水。第16 天仔猪麻醉后进行屠宰,取腓肠肌样品,反相高效液相色谱法检测腓肠肌细胞内腺苷酸水平,Western blotting检测腓肠肌AMP激活蛋白激酶(AMPK)和乙酰CoA羧化酶(ACC)表达及其磷酸化。【结果】()日粮添加1%AKG和LPS刺激对仔猪腓肠肌AMP含量和AMP/ATP的影响存在交互作用(P＜0.05)。仔猪日粮中添加1% AKG能显著提高腓肠肌ADP水平(P＜0.05),缓解了LPS刺激引起的AMP水平和AMP/ATP升高、ADP和能荷(EC)降低(P＜0.05)。(2)LPS刺激和日粮中添加AKG对AMPK表达量和AMPK磷酸化水平(pAMPK/AMPK)均无影响。(3)日粮中添加1% AKG抑制了ACC的磷酸化;LPS刺激使ACC表达量升高(P＜0.05),并促进ACC磷酸化(P＜0.05)。【结论】LPS刺激增加肌肉能量损耗,日粮中添加1% AKG有利于肌肉维持正常的能量代谢;日粮添加AKG通过调控ACC的活性与表达影响肌肉能量代谢;AKG可能通过ACC信号影响肌肉能量代谢,进而改善LPS刺激下机体能量代谢状态。     

Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中启动子PaziU1的克隆及表达

为鉴定和分析aziU1基因的启动子PaziU1,将该基因上游183bp的DNA片段和组成型强启动子PermE*(作为阳性对照)分别克隆到启动子探针载体pIJ8660中,以增强型的绿色荧光蛋白基因(egfp)作为报告基因,通过检测菌丝体中绿色荧光的强弱,对PaziU1的启动子活性进行了定性和定量分析。PaziU1在3种不同的链霉菌Streptomyces sahachiroi、Streptomyces lividans ZX1和Streptomyces albus中均表现出启动子活性。PaziU1的启动子活性在初始培养的36h略低于PermE*,在培养48h后,PaziU1的表达活性高于PermE*。结果表明,Pazi U1与PermE*一样,是一个可以在链霉菌中组成型表达的强启动子。     

酵母 R6中α-酮戊二酸的筛选、鉴定和发酵性能的研究

该研究通过硫胺素（ VB1）营养缺陷型负选择法,从中国淄博食用油污染的土壤中获得一株酵母属菌株 R6。该菌株具有累积胞外α-酮戊二酸(α-KG)的能力。生理学和生物化学实验表明该 R6菌株与已测试的 API 20 C AUX酵母鉴别系统中的胶红酵母具有共同特征。此外,R6菌株的18S rDNA 基因已经获得并测序,基于该序列以及同源菌属所得到的系统进化学分析表明菌株 R6与胶红酵母属成员具有99%的同源性。因此,菌株 R6被鉴别为胶红酵母属的一员。随后,本实验通过控制单一发酵变量以及高效液相色谱法(HPLC)检测优化了R6累积α-KG的发酵条件。当发酵培养基中添加的 VB1和 CaCO3的浓度分别为0.03 mg/L和60 g/L时,α-KG达到6.035 g/L的最高产量。天然营养缺陷型的 R6菌株的发现不仅丰富了通过发酵生产α-KG的微生物来源,而且为进一步的发酵调控奠定了基础,从而实现过量的α-KG的累积。     

α-酮戊二酸对脂多糖免疫应激仔猪生长抑制的缓解作用

谷氨酰胺(Gln)是动物血液中最丰富的游离氨基酸之一,对仔猪的健康与生长具有重要意义,但由于Gln具有热不稳定性及溶解度低等缺点,影响在动物生产中的应用。α-酮戊二酸(AKG)作为谷氨酰胺的合成前体,由于其稳定性较好,并且进入机体后能迅速为肠道供能,使其得到广泛关注。文章阐述了α-酮戊二酸对免疫应激仔猪生长抑制的缓解作用及其在仔猪生产中的应用前景。     

伞枝犁头霉发酵蔗糖产α-酮戊二酸条件的优化

研究伞枝犁头霉D1利用蔗糖生产α-酮戊二酸的发酵条件优化.结果表明:1)最佳发酵培养基组成为:蔗糖40 g/L,NaNO3 1 g/L,KH2PO4 1.36 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,NaCl 2 g/L,玉米浆0.5 g/L,CaCO3 40 g/L,叶酸2 g/L.2)最佳培养条件为:250 mL摇瓶装液25％,培养温度37℃和转速200 r/min.在此条件下培养84 h,伞枝犁头霉产α-酮戊二酸量最大达14.0 g/L,产酸速率为0.17 g/(L·h),对蔗糖的转化率为34.9％.伞枝犁头霉D1能够有效利用蔗糖发酵产α-酮戊二酸,具有较好的科研价值和工业应用前景.     

α-酮戊二酸对低水氮下冬小麦产量相关性状的影响

[目的]为建立冬小麦抗逆应变的化学调控技术。[方法]以周麦22为材料,在大田条件下研究了外源喷施α-酮戊二酸对低水氮条件下小麦产量形成相关性状的影响。[结果]外源α-酮戊二酸增加了低水氮条件下冬小麦叶片SPAD值、全氮含量及氮素转运率,千粒重、产量及氮肥偏生产力明显提高。[结论]外源喷施α-酮戊二酸是一种改善低水氮胁迫下小麦生长的有效手段。     

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆与表达

产淀粉酶高温菌在淀粉酶的生产中具有重要意义。从温泉中分离到1株可在60℃快速生长的淀粉酶产生菌A12，经16SrDNA序列比较和丙酸盐利用等实验将其鉴定为地衣芽孢杆菌。构建了地衣芽孢杆菌A12基因库，并从中克隆到一个α-淀粉酶基因amyA1，对其进行了测序分析，并在大肠杆菌中实现了表达。本研究为构建一个耐高温淀粉酶生产用工程菌奠定了基础。     

滇龙胆甲羟戊酸二磷酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

为获得滇龙胆GrMDC基因序列,以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆GrMDC基因,并进行原核表达和组织特异性表达分析。结果表明:滇龙胆GrMDC基因(登录号KJ917169)全长1 275bp,GrMDC蛋白相对分子量为46.77kD,pI为5.97;该蛋白可能定位于细胞质,无信号肽,为亲水不稳定蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;GrMDC蛋白与长春花CrMDC蛋白相似性较高(88.12%),且亲缘关系最近;GrMDC基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为72.77kD(含GST标签26kD),与预期蛋白大小一致;GrMDC基因主要在根中表达。     

改进型中草药921合剂结合α-酮戊二酸对断奶大鼠肠道免疫的影响

研究了改进型中草药921合剂结合α 酮戊二酸(α ketoglutarate,AKG)作为饲料添加剂对体重为40.0±5g18日龄断奶大鼠小肠上皮淋巴集结数量、面积和十二指肠肠液中IgA的含量进行了测定。纯系断奶大白鼠被随机分为对照组、中草药组和中草药加AKG组,每组10只,分别饲喂1～2周,然后对上述内容进行研究。结果为:饲喂1周后,对照组、中草药组和中草药加AKG组小肠上皮淋巴结数量分别为16.4±1.23,14.2±0.63,15.1±0.68个(P>0.05);3组间十二指肠肠液中IgA含量分别为0.844±0.020,0.921±0.039,1.236±0.131g·L-1(P<0.01)。饲喂2周后对照组、中草药组和中草药加AKG组小肠上皮淋巴结数量分别为15.6±0.50,16.4±0.94,15.6±0.99个(P>0.05);3组间前段肠上皮淋巴集结面积分别为27.7±2.02,44.8±4.34,42.4±1.93mm2(P<0.01);中段分别为28.1±1.10,40.5±5.68,55.4±2.28mm2(P<0.01);后段分别为37.6±4.57,63.6±4.94,59.0±5.35mm2(P<0.01);3组间十二指肠肠液中IgA含量分别为0.256±0.015,0.493±0.030,0.601±0.047g·L-1(P<0.01)。中草药组和中草药加AKG组十二指肠IgA含量均显著高于对照组。研究表明:中草药结合AKG可以通过增加小肠上皮淋巴集结面积,增加肠道IgA的分泌,从而快速有效的改善肠道的生长和发育及黏膜     

酵母R6中α-酮戊二酸的筛选、鉴定和发酵性能的研究（英文）

该研究通过硫胺素(VB1)营养缺陷型负选择法,从中国淄博食用油污染的土壤中获得一株酵母属菌株R6。该菌株具有累积胞外α-酮戊二酸(α-KG)的能力。生理学和生物化学实验表明该R6菌株与已测试的API 20 C AUX酵母鉴别系统中的胶红酵母具有共同特征。此外,R6菌株的18S r DNA基因已经获得并测序,基于该序列以及同源菌属所得到的系统进化学分析表明菌株R6与胶红酵母属成员具有99%的同源性。因此,菌株R6被鉴别为胶红酵母属的一员。随后,本实验通过控制单一发酵变量以及高效液相色谱法(HPLC)检测优化了R6累积α-KG的发酵条件。当发酵培养基中添加的VB1和Ca CO3的浓度分别为0.03 mg/L和60 g/L时,α-KG达到6.035 g/L的最高产量。天然营养缺陷型的R6菌株的发现不仅丰富了通过发酵生产α-KG的微生物来源,而且为进一步的发酵调控奠定了基础,从而实现过量的α-KG的累积。     

Streptomyces sahachiroi ATCC 33158中一个Ⅲ型聚酮合酶基因的克隆及功能分析

从链霉菌Streptomyces sahachiroi ATCC 33158基因组中克隆到1个聚酮合酶（polyketide synthase,PKS）基因orf18。生物信息学及进化树分析表明它可能属于rppA类Ⅲ型PKS基因。通过RT-PCR证实了该基因在野生型S.sahachiroi中是可以进行转录表达的。HPLC和LC-MS分析的结果表明orf18在S.lividans中异源表达时可产生1,3,6,8-四羟基萘(THN),并且发现该基因也可以在革兰氏阴性菌Pseudomonas stutzeri中异源表达并产生明显的棕红色色素。证明orf18编码的蛋白属于RppA类Ⅲ型PKS,可催化THN的合成,而产物THN在革兰氏阴性菌P.stutzeri中可进一步氧化及聚合形成棕红色色素。     

α-酮戊二酸对杂交鲟肠道形态、消化酶活力和抗氧化能力的影响

为了研究α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,AKG)对杂交鲟Acipenser schrenckii♀×Acipenser baeri♂肠道形态、消化酶活力和抗氧化能力的影响,在22℃条件下用添加AKG的饲料饲喂体质量为(7.65±0.04)g的杂交鲟,试验分为4组,每组设5个平行,每个平行放25尾鱼,试验饲料分为大豆浓缩蛋白源、鱼粉与大豆浓缩蛋白复合蛋白源两种,每种蛋白源饲料均添加不同浓度(0和1%)的α-酮戊二酸,用4种试验饲料分别饲喂4组体质量为(7.65±0.04)g的杂交鲟鱼8周。结果表明:AKG能显著提高杂交鲟后肠绒毛高度(P0.05),不同蛋白源对肠道形态均无显著影响(P0.05),蛋白源和AKG对肠道形态无交互作用(P0.05);AKG能显著提高杂交鲟蛋白酶活性(P0.05),但对脂肪酶和淀粉酶无显著影响(P0.05),大豆浓缩蛋白源能显著提高蛋白酶和淀粉酶活性(P0.05),复合蛋白源对肠道消化酶活性无显著影响(P0.05),蛋白源和AKG对脂肪酶和淀粉酶活力有交互作用(P0.05);AKG能显著提高肠道中SOD活性并显著降低MDA含量(P0.05),但对GSH和CAT含量均无显著影响(P0.05),不同蛋白源对肠道抗氧化能力均无显著影响(P0.05),蛋白源和AKG对MDA含量有交互作用(P0.05),对其他抗氧化指标均无交互作用(P0.05)。研究表明,饲料中添加AKG可以促进杂交鲟肠道发育,提高肠道消化酶活性和抗氧化能力。     

小麦α-双加氧酶cDNA克隆及表达分析

以普通小麦陕225为材料,同源克隆小麦脂肪酸α-双加氧酶基因(TaDOX)cDNA,全面分析其基因结构、染色体定位、进化关系及蛋白结构特征,并利用实时定量RT-PCR分析其在PEG和盐胁迫下的表达模式。克隆的cDNA片段长1 854bp,编码617个氨基酸残基的小麦脂肪酸α-双加氧酶。TaDOX基因组DNA长5 529bp,位于小麦5D染色体长臂,包含10个外显子。小麦、水稻等禾本科植物α-DOX序列高度同源,聚集在同一独立进化枝,而双子叶植物存在2类DOX蛋白,聚集在另外2个分枝中。TaDOX具有脂肪酸α-双加氧酶以α-螺旋为主的空间结构特征,包含血红素结合位点及保守氨基酸His310、Thr315、Tyr378、Arg558组成的活性中心。TaDOX主要在叶和根中表达,花序和种子中也有痕量表达;叶片中TaDOX的表达在PEG和盐胁迫条件均明显下降;根中TaDOX的表达在PEG胁迫条件下无显著变化,但在盐胁迫条件下表达水平急剧升高。     

魏氏梭菌贵州分离株α-毒素基因的克隆与表达

提取已鉴定的A型魏氏梭菌Clostridium welchii贵州分离株的染色体DNA，经酶切回收分子长2～4kb的DNA片段混合物，将其插入质粒载体pUCl9中，并转化至E．coli JMl09，通过Amp抗药性和显色反应的选择，再提取阳性重组细菌质粒进行探针检测、酶切分析和PCR鉴定，筛选出含魏氏梭菌α-毒素基因的重组大肠杆菌；经溶血与溶血抑制试验及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实，重组E．coli的表达产物符合α-毒素的生物学特性。     

微小根毛霉耐热α-淀粉酶基因的克隆与高效表达

[目的]开发具有高表达活力的耐热耐酸新型真菌α-淀粉酶,研究其酶学性质和催化活性,探讨其潜在工业应用潜力.[方法]采用RT-PCR从嗜热真菌微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)中克隆耐热α-淀粉酶基因,并命名为RpAmy.以质粒pPIC9K为表达载体,将α-淀粉酶基因(RpAmy)转入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达宿主KM71,进行异源表达,并测定动力学参数和酶学性质,分析水解淀粉的产物.[结果]克隆得到嗜热真菌微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)耐热α-淀粉酶基因,其开放阅读框全长1416 bp,编码471个氨基酸,与米根毛霉α-淀粉酶的氨基酸序列相似性最高(56.0%).RpAmy在毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71中表达,最高酶活达到32100.0 U/mL,蛋白表达量为1.5 mg/mL;测定纯化后RpAmy比活力、Km和Vmax,分别为6745.9 U/mg、2.26 mg/mL、0.2875 mg/mL·min;最适pH和最适温度分别为pH 4.0、70℃;具有较宽的pH耐受性(4.0~9.0)和较高的温度耐受性(60℃);水解可溶性淀粉产物主要为麦芽糖(69.0%,w/w)和葡萄糖(22.0%,w/w).[结论]从微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)中克隆得到α-淀粉酶基因(RpAmy),其可在毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71中高效异源表达并得到α-淀粉酶RpAmy.该酶具有较好的耐酸耐热性质,并能水解淀粉产生高麦芽糖含量的糖浆,在工业应用方面具有很大的潜力.