北柴胡内生真菌分离鉴定及其生防促生活性分析

为揭示北柴胡植株内生真菌组织分布特点,探索具有拮抗活性和促生活性内生真菌资源,本试验采用组织块分离法对北柴胡植株根、茎、叶内生真菌进行分离并鉴定,通过活性测试,包括体外抑菌活性、产真菌细胞壁降解酶能力、分泌IAA能力、固氮活性、解钾活性、溶磷活性、产铁载体能力,筛选具有生防与促生作用的北柴胡内生真菌。结果表明,北柴胡内生真菌在茎中的分离率(84.14%)、多样性指数(1.31)最高,青霉菌属(Penicillium)与生赤壳属(Bionectria)为根、叶内生真菌优势属,链格孢属(Alternaria)和曲霉属(Aspergillus)为茎内生真菌优势属。在54株测试菌株中,BCS-428[深绿木霉(Trichoderma atroviride)]及其发酵液抑菌活性最高,BCS-591[尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)]及BCS-500[草酸青霉(Penicillium oxalicum)]具有较高的IAA分泌能力,分泌量分别为59.55 mg/L和76.16 mg/L。BCR-513[嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilus)]具有较强的解钾活性,...     

抗镉植物内生真菌的筛选及其促生能力研究

筛选具有抗镉促生能力的内生真菌,为植物-微生物联合修复农田镉污染提供优势菌株。分离秦岭铅锌尾矿区内优势植物杠柳(Periploca sepium Bunge)的内生真菌,利用加镉培养基筛选抗镉能力较高的内生真菌,分析其形态学和内转录间隔区基因序列(Internal transcribed sequence, ITS)特征,鉴定其所属菌属,研究其Cd~(2+)去除率及吲哚-3-乙酸(IAA)活性、铁载体活性、胞外过氧化氢酶(CAT)活性和溶磷解钾活性等促生潜力,验证内生真菌对小麦幼苗抗镉能力的提升作用。结果表明:筛选到5株可耐受30 000 mg/L Cd~(2+)的内生真菌,经鉴定,菌株GR1为Talaromyces sp.,菌株GR4为Colletotrichum sp.,菌株GR9为Purpureocillium sp.,而菌株GR7和菌株GR10均为Fusarium sp.。Cd~(2+)含量为1 000 mg/L时,菌株GR7的Cd~(2+)去除率最高。4株菌株有IAA活性,其中菌株GR4的IAA活性最高(99.417 mg/L)。菌株GR7的铁载体活性最高(84.64%)。菌株GR9的胞外CAT活性最高(10.01 U/mL)。菌株GR1发酵液中的有效磷含量最高(201.67 mg/L)。菌株GR4发酵液中的有效钾含量最高(105.11 mg/L)。5株抗镉内生真菌均能显著提高小麦幼苗的耐镉能力,与空白相比,添加GR1发酵液的小麦幼苗株高增加了80.22%,根长增加了61.26%,鲜质量增加了27.66%,干质量增加了60.87%,叶绿素含量增加了28.42%,可溶性糖含量增加了7.83%,可溶性蛋白含量增加了13.28%,整体促进效果较为显著(P0.05)。5株抗镉内生真菌均有抗镉促生潜力,可为农作物-微生物联合修复农田镉污染提供优势菌株,提高农田镉污染修复效率。     

山橙内生真菌的抑菌活性初步研究

[目的]从山橙(Melodinus suaveolens Champ.ex Benth)中分离对植物病原真菌具有拮抗活性的内生真菌,为研发新型高效生物农药提供理论依据.[方法]采用组织培养法对山橙进行内生真菌的分离与纯化,结合菌种形态学和18S rDNA序列比对对其内生真菌进行鉴定;采用平板对峙法和菌丝生长速率法测定内生真菌对香蕉枯萎病4号小种、香蕉炭疽病菌和火龙果溃疡病菌等13株供试植物病原真菌的抑菌活性.[结果]从山橙的根、枝和叶中分别分离得到4、5和11株共20株内生真菌,平板对峙测定结果显示其中的菌株M4对白腐盾壳霉菌、向日葵霜霉病菌、禾谷镰刀菌、茄子黄萎病菌、水稻稻瘟病菌和火龙果溃疡病菌等6株植物病原真菌的抑制率均在30.00%以上,表现出较好的抗菌活性.结合形态特征与18S rDNA序列分析鉴定,确定菌株M4为Phanerochaete sp.,其菌株发酵液在20 mg/mL浓度下对马铃薯黄萎病大丽轮枝菌、马铃薯黑白轮枝菌、禾谷镰刀菌、茄子黄萎病菌、西瓜枯萎病菌、马铃薯立枯丝核菌和香蕉枯萎病4号小种等7株病菌均具有一定的抑制作用,其中对禾谷镰刀菌的抑制效果最佳,抑制率为40.92%,显著高于对其他病原菌的抑制率(P<0.05).[结论]山橙内生真菌富含抑菌活性菌株,蕴藏着潜在的抑菌活性物质,具有良好的应用前景.     

陕西蓝田核桃内生真菌多样性与时空分布

为了解陕西蓝田核桃(Juglans regia L.)内生真菌生态多样性与分布特性,采用组织分离法对不同季节的核桃树的不同组织部位进行内生真菌分离,以形态学和分子生物学相结合的方法进行鉴定。共分离获得核桃内生真菌676株,隶属于47个属,其中交链孢霉属(Alternaria)为优势类群,占菌株总数的19.23%;茎叶核菌属(Ectostroma)和葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)相对较丰富,分别占菌株总数的8.73%和6.21%。核桃不同部位内生真菌的多样性以茎部最高,1年生茎和2年生茎分别占菌株总数的24.56%和24.41%。不同季节的核桃内生真菌中,秋季(2013年10月)的多样性最高,分布于19个属,占菌株总数的34.91%。不同组织部位的核桃内生真菌多样性因季节变化而异。     

产银杏内酯B内生真菌的分离与筛选

研究了银杏内生真菌与其宿主产生具生理活性物质银杏内酯B之间的关系,并对部分银杏内生真菌进行了形态学鉴定。结果表明:从银杏植株不同组织中共分离到109株内生真菌;在马铃薯葡萄糖液体培养基上发酵后对发酵液进行薄层层析,有16株菌的斑点和标品有相同的迁移率,用HPLC-UV方法对该16株菌发酵样品进行分析,其中有3株内生真菌(G10、Y30和Y40)的浓缩发酵液的保留时间和标品保留时间一致,确定菌株G10能产生银杏内酯B;菌株G10、Y30和Y40分别为卵形孢霉属(Oospora Wallr.)、枝链孢霉属(Sirodesmiumde Not)和青霉属(Penicillium LK.ex Fries)。     

四川汉源铅锌矿区植物内生真菌的遗传多样性初步研究

【目的】了解铅锌矿区植物内生真菌的分布特点和遗传多样性。【方法】采用传统组织块培养法对四川汉源铅锌矿区6种常见植物进行内生真菌分离,根据菌落形态特征挑选了27株代表菌株,采用随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹图谱分析技术进行了遗传多样性分析,并在RAPD分析的基础上测定了8株代表菌株的rDNA-ITS序列,利用MEGA 4.0构建了供试菌株的系统发育树。【结果】从6种植物的300个组织块中分离获得内生真菌186株,内生真菌的分离频率在0.43⁰.85之间,平均为0.62,所有植物茎内生真菌的分离频率最高,叶部次之,根部最低。RAPD分析表明,在76%的相似性水平处,27株供试菌株被分为8个遗传群。系统发育表明,这8个代表菌株分别分布于镰刀菌属(Fusarium),青霉属(Penicillium),座囊菌纲(Dothideomycetes),小不整球壳属(Plectosphaerella),漆斑菌属(Myrothecium),格孢腔菌属(Pleosporales),链格孢属(Alternaria)和拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)8个系统发育分支。【结论】铅锌矿区植物内生真菌具有一定的多样性,值得进一步研究。     

南方红豆杉紫杉醇产生菌的分离与鉴定

从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)根部树皮内表皮中分离得到69株内生真菌,通过HPLC检测发酵液中紫杉醇含量,共获得7种紫杉醇产生菌,同时,通过形态学分析以及ITS序列分析确定分别属于链格孢属(Alternaria)、葡萄孢盘菌属(Botryotinia sp.)、刺盘孢属(Colletotrichum)、拟茎点霉属(Phomopsis)和枝孢菌(Cladosporium),其中链格孢属真菌紫杉醇产量最高,平均为271.54μg/L,是目前见诸报道的产量最高的链格孢菌,亦是从红豆杉根部树皮中筛选出的紫杉醇产量较高的野生菌株之一。该菌株的发现为紫杉醇高产菌的选育提供了又一优良的种质资源。     

贵州道地药材杜仲内生真菌的分离及鉴定

[目的]开发有地域特色的杜仲内生真菌资源,为杜仲内生真菌多样性和内生真菌的开发利用提供参考。[方法]采用传统的组织培养法从毕节市杜仲中分离内生真菌,对得到的内生真菌进行形态学和真菌rDNA的居间序列(internal transcribed spacer,ITS)鉴定。[结果]从毕节市杜仲中分离得到93株真菌,经鉴定分为拟茎点霉属(Phomopsis sp.)、间座壳属(Diaporithe sp.)、黑孢属(Nigrospora sp.)、粪壳菌属(Sordariales sp)、黑附球菌(Epicoccum rnigrum)、小光壳属(Leptosphaerulina sp.)、锐顶炭角菌(Xylaria apiculata)、刺盘孢属(Colletotrichum sp.)和大白栓菌(Trametes lactinea)共9属,其中拟茎点霉属和间座壳属为优势菌属,分别占54.83%和26.88%。[结论]贵州杜仲内生真菌多样性丰富,杜仲内生真菌炭角菌属、大白栓菌为我国首次报道。     

茅苍术叶片可培养内生细菌多样性及其促生潜力

对江苏省道地药材茅苍术叶片可培养内生细菌的多样性及其固氮、解磷、解钾、产生长素的能力进行研究.依据菌落形态的不同,共分离得到52株内生细菌.能正常传代培养的45株内生细菌经ARDRA分析后归入14个聚类簇,簇内菌株的BOX-PCR指纹图谱相似度不高,在属水平上显示出茅苍术内生细菌丰富的多样性.各聚类簇代表菌株16S rDNA的序列分析表明分离得到的内生细菌与泛菌属、微杆菌属、短杆菌属、农杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属细菌亲缘关系相近,优势内生细菌与假单胞菌属细菌亲缘关系相近.45株能正常传代培养的内生细菌中,有10株能够在无氮培养基上正常生长,具固氮潜力.使用nifH基因通用引物对其基因组进行扩增后,除ALEB 33外,其它9株内生细菌均可获得与nifH基因片段大小相近的条带.分别使用NBRIP培养基和蒙金娜有机磷培养基筛选后获得19株和15株能够溶解磷酸钙和卵磷脂的内生细菌,其中ALEB 43溶解无机磷的能力最强,达(251.43±6.55) mg/L;ALEB 4A溶解有机磷的能力最强,达(23.63±1.46) mg/L.部分内生细菌溶解无机磷的能力与其产酸能力呈正相关,而菌株溶解有机磷的能力却无此相关性.通过硅酸盐培养基的筛选,获得具有解钾潜力的菌株24株.43株内生细菌能够将色氨酸转化为生长素,其中ALEB 44产生长素的能力最强,达(268.44±10.12) μg/mL.本研究首次揭示了江苏省道地药材茅苍术体内丰富的内生细菌资源及其促生长潜力,对进一步阐述茅苍术与内生菌之间的相互关系具有重要意义.     

健康草莓体内可分离培养微生物的多样性

研究草莓体内能够分离培养的微生物的群落组成和结构,对健康草莓稳态菌群的构建和保持具有重要意义.以健康草莓为研究样本,对其根、茎、叶内的真菌和细菌进行分离培养,分别利用真菌rDNA-ITS引物和细菌16S rRNA引物进行PCR扩增,然后基于测序及其生物信息学分析鉴定微生物种类.结果表明,从健康草莓根、茎、叶部获得了真菌1个门4个属中的14株菌株和细菌3个门6个属中的14株菌株,其中细菌内生菌的多样性高于真菌类群;3个器官中根部内生菌的多样性程度最高;芽孢杆菌(Bacillus)和葡萄孢属(Botrytis)是丰度较高的2个内生菌属.本研究初步明确了草莓不同部位可培养内生菌的分布特点和规律,为探索利用这些内生菌以促进草莓健康生长奠定了基础.     

雷公藤内生真菌对Fusarium nisikadoi NS-1雷公藤甲素合成的影响

为了解雷公藤内生真菌的雷公藤甲素合成能力以及内生真菌间互作对雷公藤甲素合成的影响,本试验从雷公藤中筛选出1株产雷公藤甲素的内生真菌NS-1,鉴定为Fusarium nisikadoi;通过NS-1与其它内生真菌共培养,发现青霉菌属(Penicilliumn)内生真菌NS-8能够显著促进NS-1的雷公藤甲素合成(P<0.05),是对照的1.6倍.以此为基础,通过制备和添加NS-8菌丝体提取物和发酵液诱导子,进一步研究内生真菌NS-8诱导子对NS-1雷公藤甲素合成的影响.结果表明,NS-8发酵液诱导子促进了NS-1的糖消耗速率,提高了NS-1生物量和培养液pH值,明显促进了NS-1胞外雷公藤甲素的积累,最高含量是对照的4.2倍;NS-8菌丝体提取物诱导子对培养液pH值的影响不显著,NS-1糖消耗速率略有下降,对NS-1生长有一定的抑制作用,胞外雷公藤甲素含量低于对照.两种诱导子对NS-1胞内雷公藤甲素合成均未呈现明显的促进作用.因此,NS-8主要通过其代谢产物强化NS-1雷公藤甲素的合成.     

灯盏花内生真菌分离及其产黄酮内生真菌的初步研究

【目的】本研究对昆明市寻甸县人工栽培的大田灯盏花的根、茎、叶、花的内生真菌进行分离鉴定,旨在筛选产黄酮的内生真菌菌株。【方法】采用纯培养方法分离植物内生真菌,利用形态鉴定及显色反应筛选产黄酮内生真菌。【结果】共获得内生真菌40株,经显微形态观察40株内生真菌初步分类鉴定为14个属。通过黄酮类物质特异颜色反应,筛选到7株内生真菌产黄酮类物质,这7株内生真菌经初步鉴定为交链孢属(Alternaria sp.)、镰孢霉属(Fusarium sp.)、痕格孢属(Sirosporium sp.),根中内生菌产黄酮最高质量浓度为2.625 mg/L。【结论】灯盏花不同部位内生真菌的数量、分布和种群存有差异性,从根部分离到的内生真菌产黄酮类质量浓度最高。     

广东化橘红内生真菌多样性分析

通过组织分离方法对广东省化州市橘红种植园内所采的化橘红（Exocarpium citri Grandis）果、枝、叶组织内的内生真菌多样性进行研究,并采用形态与分子生物学相结合的方法鉴定菌株. 结果显示,从化橘红果、枝、叶600个组织块中,共分离得到404株内生真菌. 依据形态鉴定及ITS序列分子鉴定,初步鉴定379株内生真菌,并将其分为16个分类单元,经鉴定归于镰刀菌属(Fusarium)、炭疽菌属(Colletotrichum)、色二孢菌属(Lasiodiplodia)、间座壳属(Diaporthe)、光黑壳属(Preussia)、稻黑孢菌属(Nigrospora)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、弯孢属(Curvularia)、隔孢伏革属(Peniophora)、叶点霉属(Phyllosticta)、枝孢属(Cladosporium)、球腔菌属(Mycosphaerella)、假尾孢属(Pseudocercospora)、附球菌属(Epicoccum)、拟层孔菌（Fomitopsis）和毛霉属Mucor）,其中炭疽菌属与间座壳属是化橘红的优势菌株,其相对频率分别为44.6% 和34.2%,远远高于其他类群. 内生真菌在枝组织中的分离率为91%. 研究结果表明化橘红内生真菌分布具有一定的组织特异性,为进一步从化橘红内生真菌中筛选活性中药成分提供了新思路.     

水黄皮内生菌的分离及其杀虫菌株的筛选

为筛选水黄皮内生菌中对水稻害虫有毒杀作用的菌株,从健康水黄皮植物的根、茎、叶和种子中进行菌株分离,并对分离出的菌株的形态、培养特征、生理生化及其他生物学特性进行研究;通过16S r DNA及ITS序列的系统发育学对其分析和鉴定。结果表明:用玻片浸渍法和喷雾法筛选出杀虫活性物质菌株,共获得细菌88株、放线菌12株、真菌3株。经初筛及复筛,内生菌麦角菌[Clavicepspurpurea(St F1)]和蜡样芽胞杆菌[Bacillus cereus(Se B3)]的发酵液粗提物分别对稻飞虱(Rice planthopper)、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenee)致死率达85%以上。水黄皮内生菌株Se B3和St F1的粗提代谢物对稻纵卷叶螟和稻飞虱有明显地毒杀作用,为开发新的生物源农药提供了可能的生物质。     

3种沙生药用植物内生真菌的分离鉴定及其拮抗菌株筛选

采用3种消毒时间对沙冬青、老瓜头、甘草3种沙生药用植物内生真菌进行分离.结果表明:消毒3min来消除非内生菌的影响,效果较好;同一植株分离出内生真菌的数量,以根部最多,其次是茎部,叶部最少.合并形态相同的分离物,分离出的124株内生真菌除24株无孢菌属外,经初步鉴定分属于13个属,卵形孢霉属(Oospora)和串珠霉属(Monilia)各占18.63%;交链孢霉(Alternaria)占12.96%;间毛孢霉属(Septosporium)占10.53%;镰孢霉属(Fusarium)占9.72%;而头孢霉属(Cephalosporium)、束丝菌属(Ozonium)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、地霉属(Geotrichum)、亚大茎点菌属(Macrophoming)、丝核菌属(Rhizoctonia)分离数均小于5%.以4种植物病原菌为靶标菌,筛选出5株高活性拮抗菌株,抑菌带宽度达14.99mm.     

濒危药用植物绶草内生真菌的分离与鉴定

以绶草的根、茎、叶为材料,采用组织分离法和3种不同的培养基分离绶草的内生真菌.结果表明,PDA改良培养基(PDA培养基内加20 mg/L绶草生境土壤浸提液、20 mg/L绶草根汁液、30 mg/L氯霉素)的分离效果最好.从绶草的根、茎、叶中共分离得到60株内生真菌,经显微鉴定,已鉴定的菌株54株,为3目4科13属,优势属为丝核菌属、青霉属、曲霉属、链格孢属;不同的组织部位所分离得到的内生真菌在种类和数量上都存在差异,茎中分离12属33菌株,根中分离7属18菌株,叶中分离4属9菌株.其中茎中内生真菌多样性最为丰富,且优势菌群不明显,以后对绶草的内生真菌研究时应尽量采用茎为组织器官分离内生真菌;根中镰刀霉属、曲霉属为优势属;叶中内生真菌种群较单一,主要为链格孢属.     

海桐内生真菌菌群结构及多样性

【目的】为了解海桐内生真菌资源组成及其生态分布特征。【方法】采用组织分离和形态分类的方法对海桐内生真菌进行分离和鉴定。【结果】海桐内生真菌菌群由子囊菌(78.55%)、接合菌(1.21%)及无孢菌群(20.21%)构成,分属于5纲,12目,17科,23属。在纲的水平上,以座囊菌纲(Dothideomycetes)的相对多度为最高,占38.04%;在目的水平上,以格孢腔菌目(Pleosporales)的相对多度为最高,占29.95%;在科的水平上,以格孢菌科(Pleosporaceae)的相对多度为最高,占16.19%;在属的水平上,以交链孢属(Alternaria)的相对多度为最高,占16.19%。内生真菌在果实中分布的菌群和菌株为最高,分别占58.33%和42.51%;在根中分布的菌群和菌株为最少。叶片和果实之间的内生真菌菌群组成的相似度最高(Cs=0.571),以根与果实之间的相似度为最低(Cs=0.381)。除根和叶片、根和果实之间在内生真菌菌群组成上存在显著差异之外(P0.05),在根与枝条、枝条和叶片、枝条和果实、叶片和果实之间无明显差异(P0.05)。【结论】海桐内生真菌资源组成丰富,且内生真菌在海桐不同组织中的分布存在一定差异。     

兔眼蓝莓幼果内生真菌多样性及其抑菌活性鉴定

采用组织分离法和对峙培养法研究兔眼蓝莓幼果内生真菌多样性及其对6种植物病原真菌的拮抗作用,筛选具有抑菌作用的内生真菌。结果表明:从兔眼蓝莓幼果中共分离得到25株内生真菌,利用菌株rDNA-ITS序列进行blastn比对,将25株菌株划分为12属19种,相似度为97%～100%。其中,子囊菌门真菌共9属14种共20株,担子菌门有3属5种。间座壳属真菌为子囊菌门菌株的优势属,占子囊菌门菌株的25%。兔眼蓝莓幼果内生真菌Shannon-Wiener多样性指数(H)为2.287 0,Pielou均匀度指数(J)为0.920 3,Margalef丰富度指数(R)为3.417 3。在25株兔眼蓝莓幼果内生真菌中,裂褶菌属菌株G6对5种病原菌抑制率在40%以上,G18对4种病原菌抑制率在45%以上,抑制效果较好。     

诱导子对雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素积累的影响

[目的]雷公藤甲素是雷公藤主要药用活性成分之一,具有抗肿瘤、免疫抑制和抗炎等多种作用.应用植物细胞培养技术生产雷公藤甲素具有重要意义,而诱导子是提高植物细胞培养中次生代谢产物积累的有效途径之一.研究通过探究非生物和生物诱导子对雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素积累的影响,以期提高雷公藤甲素产量,为雷公藤悬浮细胞规模化生产雷公藤甲素等药用活性物质提供基础.[方法]以水杨酸(SA)、LaCl3以及雷公藤内生真菌NS-5、NS-17作为诱导子,研究不同类型及不同浓度诱导子添加对雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素积累及细胞活力、细胞生长、总糖消耗、PAL活性的影响.[结果]SA、LaCl3和内生真菌NS-5、NS-17诱导子均可促进雷公藤悬浮细胞培养物中雷公藤甲素的积累.非生物诱导子的效应大小受其浓度的影响,0.1 mg/L的SA诱导作用最好,可提高细胞活力,促进细胞生长,总糖消耗增加,升高PAL活性,雷公藤甲素产量最高是对照的3.5倍.随着浓度的降低,LaCl3对雷公藤甲素的诱导作用增强,20 mg/L LaCl3诱导下的最高含量是对照的2.0倍,同时20 mg/L LaCl3也提高了PAL活性和总糖消耗,但对细胞活力和细胞生长影响不大.内生真菌诱导子的效应大小即与诱导子种类和添加时间有关.细胞培养第4天添加NS-5、NS-17菌丝体提取物,第8天添加任一内生真菌诱导子均提高了雷公藤甲素的积累,其中NS-5菌丝体提取物的诱导效果相对最强,细胞培养第8天添加时雷公藤甲素产量最高,是对照的2.4倍,但雷公藤甲素的积累与细胞生长及PAL活性无明显的关联.[结论]诱导子的添加能够提高雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素的积累,诱导效应的大小与诱导子种类、添加浓度及添加时间有关.本研究中的0.1 mg/L SA、20 mg/L LaCl3及内生真菌NS-5菌丝体提取物显示了良好的诱导效果,在利用细胞培养技术进行雷公藤甲素生产中具有较好的应用前景.     

一株银杏内生裂褶菌的鉴定及其产黄酮的初步研究

为了解银杏内生真菌产黄酮情况,对从贵州大学校园银杏树叶中分离到的一株内生真菌GZUY201进行鉴定及产黄酮的研究。菌株鉴定利用形态学和分子生物学相结合的方法,并通过HPLC法测定其产黄酮的含量。鉴定菌株GZUY201为裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.),菌株发酵液和菌丝体产黄酮苷元槲皮素量可达40.8 mg.L-1和101.7 mg.g-1。银杏内生裂褶菌可产黄酮苷元槲皮素,可作为生产银杏黄酮的候选菌株。