波尔山羊胚胎克隆的研究

以波尔山羊早期胚胎卵裂球作为核供体进行核移植,比较受体卵母细胞来源以及不同发育阶段胚胎的卵裂球对核移植重构胚的融合率的影响,研究Vero细胞对重构胚体外发育的影响,检测重构胚发育成为个体的能力。结果表明:以体内成熟和体外成熟卵母细胞做核移植受体,重组卵的融合率分别为85.7%和88.7%,二者之间差异不显著(P>0.05);以来源于8,16,32细胞阶段的卵裂球做核供体,重组卵的融合率分别为91.6%,86%,89.2%,三者之间差异不显著(P>0.05);融合后的重构胚与Vero细胞单层共培养,卵裂率65.5%和桑椹胚率32.7%均高于单纯TCM199培养的53.1%和10.6%(P<0.05);移植18枚融合后的重构胚于2只受体山羊输卵管,结果未获得妊娠;移植经体内培养得到的3枚桑椹胚于受体山羊子宫内,获得妊娠1只,总体的妊娠率为33%(1/3),怀孕的受体羊维持妊娠到期,产下1只母羔,初生重3.45 kg,一周岁时体重达到42.5 kg。通过自然交配产下一对波尔山羊羔。     

来源和质量不同对山羊卵母细胞体外成熟率的影响

比较了卵母细胞级别对体外成熟率的影响,以及促卵泡素(FSH)处理山羊对卵母细胞采集的数量和质量的影响。结果表明:卵母细胞级别对体外成熟率有显著影响,不论是来源于FSH处理卵巢还是屠宰场卵巢,均是A、B级卵母细胞的成熟率高于C级卵母细胞,差异极显著(P<0.01)。但是A、B级卵母细胞之间差异不显著;卵巢来源对卵母细胞采集的数量和质量有显著影响,A、B级卵母细胞在获卵总数中所占的比例,平均每个卵巢获卵母细胞数及A、B级卵母细胞数,均是FSH处理卵巢高于屠宰场卵巢,差异显著(P<0.05);卵巢来源对卵母细胞体外成熟率有显著影响,来自于FSH处理卵巢的卵母细胞体外成熟率高于屠宰场卵巢(81.6%比67.6%),差异极显著(P<0.01)。     

鼠、兔核质杂交及早期胚胎发育的研究

以2~8细胞期鼠胚细胞为供体核,选用注射hCG后15h、17h的兔卵母细胞为受体胞质,施加1.6 kv/cm、160、两次脉冲的电场条件,间隔20min,融合液为含Ca、Mg的0.3mol/L甘露醇,适于鼠、兔种间EOBC的融合激活。小鼠2—细胞、4—细胞期胚细胞与兔去核卵母细胞融合率高于8—细胞期胚细胞,分别为83%、80%及62.5%,桑囊胚发育率差异不显著。体细胞共同培养系统和Taurine能显著提高鼠、兔核质杂交胚的体外发育能力。     

小鼠不同卵龄卵母胞细纺锤体位置及对去核效率的影响

探讨小鼠不同卵龄卵母细胞纺锤体位置与去核效率之间的关系。用Spindle-View观察小鼠不同卵龄卵母细胞纺锤体位置,然后对其进行去核操作。观察发现卵龄10,12h的纺锤体处于I,II,III区的比率分别为95%,3%,2%;33%,33%,23%。两组进行盲吸去核,去核率分别为90%和22%。在Spindle-View下去核卵龄10h的卵母细胞去核率为95%,其中有56%(n=59)的卵母细胞去不到1/6的卵胞质就可去核,而卵龄12h的卵母细胞去核率为87%,其中有76%(n=85)的卵母细胞吸去1/3的卵胞质才可去核。小鼠卵母细胞不同卵龄对纺锤体位置和核移植程序中去核效率有显著影响。     

卵巢质量及培养条件对郏县红牛卵泡卵母细胞体外成熟的影响

利用屠宰场采集的郏县红牛卵巢,研究卵巢质量及培养条件对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:A类卵巢平均获得的卵母细胞数(2.0枚)明显低于B类卵巢获得的卵母细胞数(5.4枚),从A类卵巢上获得的卵母细胞成熟率(55.00%)、卵裂率(37.50%)显著或极显著低于B类卵巢上获得的卵母细胞成熟率(80.00%)(p<0.05)、卵裂率(60.17%)(p<0.01);将随机分成三组的卵母细胞分别培养20h(Ⅰ组)、24h(Ⅱ组)、28h(Ⅲ组),三组成熟率(77.77%、78.57%、74.43%)之间无显著差异(p>0.05),但卵裂率Ⅰ组、Ⅱ组(51.79%、58.16%)明显高于Ⅲ组(36.98%)(p<0.05),Ⅰ组、Ⅱ组差异不显著(p>0.05);以M-199为基础液,比较单独添加ECS和FCS与激素配合的情况下,两种血清种类对卵母细胞成熟的影响,结果表明卵母细胞成熟率(73.33%、75.00%)、卵裂率(52.21%、54.35%)均无显著差异(p>0.05)。     

影响克隆牛生产效率之因素研究

为了提高牛体细胞克隆的效率,比较了不同融合电压对核移植胚发育的影响,其中1.7kv/cm电场强度,获得了较高的融合率、卵裂率和囊胚率,分别为67.14%,76.59%和29.16%。比较了血清饥饿处理体细胞对核移植效率的影响,血清饥饿处理体细胞后,融合率、卵裂率和囊胚率分别为68.91%,74.79%和28.26%,与非血清饥饿处理的相比没有明显差异(分别为60.96%,71.91%和20.31%,P>0.05)。而且胚胎移植后的怀孕率和产犊率也没有差异(分别为29.17%,8.33%和33.33%,16.66%,P>0.05)。另外,通过加强克隆牛的产后护理,可以提高克隆牛的成活率。总之,优化生产克隆牛的各环节因素,可以从整体上提高克隆牛的生产效率。     

山羊转t-PA突变体基因的体细胞核移植研究

比较了用转t-PA突变体基因的胎儿成纤维细胞和卵丘细胞作供体时核移胚的发育情况。结果表明：卵丘细胞作供体时,核移胚的卵裂率（82.9%）和桑葚胚率（55.9%）均高于胎儿成纤维细胞卵裂率（75.7%）和桑葚胚率（48.7%）,但差异不显著（P＞0.05）;卵丘细胞作供体时的囊胚率（19.7%）则高于胎儿成纤维细胞（11.0%）,差异显著。(P<0.05)。比较了饥饿处理与否对胎儿成纤维细胞作供体时转基因核移胚的发育情况。结果表明：供体细胞饥饿后,其核移胚的卵裂率（75.6%）与供体不饥饿的卵裂率（75.8%）差异不显著;供体细胞饥饿后,其核移胚的桑葚胚率（46.5%）和囊胚率（11.0%）高于供体不饥饿的桑葚胚率（39.3%）和囊胚率（9.0%）,但差异不显著。比较了SOFaa和CR1aa分别添加10%FBS和bFF后,转基因核移胚的发育情况。结果表明：用CR1aa液培养时,添加10%bFF,其囊胚率（9.1%）高于添加10%FBS（4.2%）（P＞0.05）;用SOF液培养时,添加10%bFF,其囊胚率（11.2%）高于添加10%FBS（5.5%）（P＞0.05）。说明用SOF液优于CR1aa液。     

牛兔异种体细胞以兔卵母细胞为核受体的牛体细胞克隆研究

随着同种动物克隆后代的不断降生,人们又开始尝试异种动物体细胞核移植。用兔的卵母细胞作为核受体进行牛的体细胞核移植,研究表明,颗粒细胞作为供核体与兔去核卵母细胞的融合率(60.5%,57.9%)稍高于皮肤成纤维细胞的融合率(52.2%,48.4%),但两者间差异并不显著。颗粒细胞与皮肤成纤维细胞均采用饥饿培养和接触抑制培养两种不同的方式进行诱导处理,融合卵在电激活后能够卵裂并发育的情况差异显著(72.6%对51.4%;70.4%对52.2%)。有少数重构胚发育至囊胚,证明在哺乳动物异种重构胚早期发育中,异种细胞核与细胞质间是相容的。     

卵泡颗粒细胞维持山羊卵母细胞减数分裂抑制状态的研究

通过在卵母细胞体外成熟过程中添加不同浓度的卵丘细胞或其外围壁层颗粒细胞进行共培养,对山羊卵母细胞成熟过程中卵泡颗粒细胞对卵母细胞减数分裂抑制作用及作用机制进行了探索.结果表明,成熟液中添加105和106个/mL卵丘细胞或外围壁层颗粒细胞的卵母细胞体外成熟率与对照组相比差异不显著(P>0.05),但添加5×106个/mL(41.2%)和107个/mL(24.6%)卵丘细胞或外围壁层颗粒细胞组的成熟率显著降低(P<0.05);添加5×106和107个/mL卵丘细胞组和颗粒细胞组卵丘不能正常扩展,卵母细胞核状态观察,停留在GV期;Rp-cAMP(Rp-cyclic adenosine monophosphothioate)膜渗透性cAMP对抗剂,诱导了107个/mL的卵丘细胞组(71.6%)和外围壁层颗粒细胞组(71.3%)的卵母细胞体外成熟率与对照组(72.O%)差异不显著(P>0.05).在山羊卵母细胞体外成熟过程中,添加一定浓度的卵丘细胞及其外层的颗粒细胞可以提高卵母细胞胞质内的cAMP的水平,抑制卵母细胞减数分裂的启动,使卵母细胞停留在GV期.     

褪黑激素对蓝狐卵泡发育的影响研究

为探索褪黑激素对蓝狐卵泡发育的影响,为研究蓝狐卵巢卵母细胞的利用提供依据。试验分别对埋植褪黑激素蓝狐的卵巢和发情期卵巢的形态及卵泡直径进行测量和比较,并采集卵母细胞进行体外成熟培养,每12 h观察并记录培养结果。结果表明：埋植褪黑激素蓝狐卵巢的体积和重量与发情期相比差异极显著(P<0.01);其各级卵泡直径均小于发情期,其中次级卵泡差异显著(P<0.05);体外成熟培养48 h后的卵丘扩散率显著小于发情期(P<0.05)。     

不同联合激活方法对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响

为摸索牛体细胞核移植最优的联合激活方法,利用体外成熟22~24h的去核卵母细胞作为受体细胞质,牛耳部成纤维细胞作为供体细胞,注射到透明带间隙。在电融合参数为电场强度25N/C,脉冲宽度10μs,2次脉冲的融合条件下,对不同联合化学激活方式进行比较。结果显示在电融合参数不变的条件下,6-DMAP+CB的激活方式,融合率最高但差异不显著,后期发育的卵裂率(74.1%)和囊胚率(27.8%)也最高。笔者初步得到了较适合牛体细胞核移植的联合激活方法,为今后牛的体细胞核移植胚胎的发育和研究奠定了基础。     

外源性孕酮对牛卵母细胞体外核成熟的影响

了研究外源性孕酮对牛卵母细胞体外核成熟的作用,通过向成熟培养液中添加10 μg/mL FSH +10 μg/mL LH（对照组）和0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL的外源性孕酮,对牛卵丘卵母细胞复合体进行体外成熟培养,在培养8 h后用醋酸地衣红染色观察各自的生发泡破裂率,然后在成熟22 h统计第一极体率,体外受精后7~8天统计囊胚率。结果表明,对照组卵母细胞的生发泡破裂率(75.0%)和极体率(79.6%)均明显高于添加不同浓度孕酮的各处理组(P<0.05),而囊胚率各组之间均无显著差异(P>0.05)。因此,外源性孕酮不能促进牛卵母细胞的核成熟,单独添加外源性孕酮不能起到与内源性孕酮相同的作用。     

促卵泡素与促黄体素对猪卵母细胞体外成熟的影响

探讨了促性腺激素(FSH、LH)对猪卵母细胞体外成熟的影响,最终找到了其合理的使用剂量。在成熟液中添加LH浓度分别为1,5,10 IU/mL时,与没有添加FSH与LH的对照组(15.9%)相比,成熟率有显著提高,成熟率分别为49.1%,30.0%,36.3%。LH浓度为1 IU/mL的实验组成熟率最高,显著高于对照组(p<0.05);然后以成熟液中只添加1 IU/mL LH为对照组,实验组分别添加1,5,10 IU/mL FSH。试验结果表明:添加FSH浓度为5和10 IU/mL时其成熟率分别为40.1%,27.6%,低于对照组(49.0%)。添加FSH浓度为1 IU/mL时其成熟率(49.1%)高于对照组(49.0%),但差异不显著。两组试验同时得出,随着LH与FSH添加浓度逐渐增加,成熟率呈下降趋势。通过本试验结果得出,在体外成熟培养猪卵母细胞时,各添加1 IU/mL LH与FSH时,得到最佳的成熟效果。     

不同类型供体细胞对牛体细胞重构胚发育能力的影响

(1西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨陵 712100;2陕西省畜牧兽医总站,陕西西安710016)     

小鼠卵母细胞去核时间对卵丘细胞核移植的影响

对超数排卵的小鼠分别在注射HCG后14~16, 16~18, 18~20和20~22 h采小鼠卵母细胞用于 核移植, 观察小鼠卵母细胞的去核时间在体细胞核移植中的作用。结果显示, 在注射hCG后14~16, 16~18, 18~20和20~22 h, 小鼠卵母细胞去核效率分别为80.09 %(338/422), 73.12 %(283/387), 55.02 %(230/418)和48.74 %(193/396); 重构胚激活率分别为 66.20 %(190/287), 75.43 %(175/232), 84.78 %(156/184)和85.14 %(126/ 148); 重构胚的囊胚发育率分别为13.94 %(40/287), 7.33 %(17/232), 3.80 %(7/184)和1.35 %(2/148)。试验证实小鼠卵母细胞在注射hCG后14~16 h进行去核较为适宜。