茶树CsbHLH2基因克隆及表达分析

植物bHLH（碱性螺旋环螺旋）转录因子是植物体内一类重要的转录因子,在植物的生长发育以及胁迫应答过程中发挥着重要的调控作用。本研究以茶树品种陕茶一号为材料,采用同源克隆法从陕茶一号叶片cDNA中克隆了1个bHLH转录因子CsbHLH2。生物信息学分析表明,CsbHLH2开放阅读框（ORF）为714βbp,编码1个297个氨基酸的蛋白,预测分子量58.4βkD,等电点为5.14,氨基酸序列比对显示该蛋白与其他高等植物的bHLH蛋白具有较高同源性。拟南芥原生质体亚细胞定位表明,CsbHLH2编码蛋白定位在细胞核上。实时荧光定量PCR结果分析表明,CsbHLH2基因在茶树不同组织部位中均有表达,但是在幼叶中表达量最高;不同激素处理结果显示,CsbHLH2受SA、ETH、MEJA诱导。     

茶树MADS-box转录因子基因的克隆与非生物胁迫响应分析

本研究基于茶树转录组数据库,以茶树龙井43为试验材料,通过RT-PCR方法从该茶树的cDNA中克隆得到1个CsMADS1基因。序列分析表明:茶树CsMADS1基因开放阅读框长度为657 bp,编码218个氨基酸,是典型的植物MADS-box家族转录因子。序列多重比对显示,该序列与多个相关物种的MADS-box序列一致性为65.65%,含有高度保守的MADS结构域和半保守的K结构域。氨基酸理化性质、亲疏水性、亚细胞定位预测、无序化分析,以及二级和三级结构分析显示,CsMADS1转录因子是亲水性蛋白,可能定位于细胞核中,无序化程度明显,以α-螺旋结构为主,并与人MEF2蛋白具有相似的三级结构。利用实时荧光定量PCR方法分析了茶树龙井43中CsMADS1基因在非生物胁迫下的表达。结果表明,茶树中CsMADS1基因对高温、低温、干旱和高盐等不同非生物胁迫有响应,且表达存在差异。     

大麦转录因子基因 HvNAC1的克隆及功能初探

NAC转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一,在植物的生长发育及植物参与生物与非生物胁迫过程中起重要作用。本研究通过分析感染大麦温和花叶病毒(Barley mild mosaic virus,BaMMV)的大麦转录组测序结果,获得表达上调的基因 HORVU5Hr1G011650,基因注释为 HvNAC1。通过生物信息学分析发现该基因全长915 bp,编码304个氨基酸,分子量为33.3 kDa,理论等电点为9.21,在14～141位氨基酸之间含有NAC转录因子家族保守结构域。系统进化分析发现,该基因与小麦、拟南芥中的NAC转录因子同源性较高。组织表达分析发现,该基因在大麦的不同生长时期均有表达,在结实后期和外颖壳中表达量较高。农杆菌介导的烟草亚细胞定位实验表明,该基因定位于细胞核中。在酵母实验中,发现 HvNAC1具有完整的转录因子活性。     

香蕉MaERF-1基因的克隆、序列分析及表达载体构建

从香蕉中克隆了1个乙烯响应因子(ERF)Ma ERF-1。序列分析表明,该基因存在1个完整的开放阅读框(ORF)729 bp,编码243个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明,Ma ERF-1所编码的蛋白与其他植物中ERF编码的蛋白具有较高的一致性。其中与马来西亚野生香蕉同源性最高达98%,与油棕、菠萝、海枣、葡萄、荷花、烟草的Ma ERF编码的氨基酸序列的同源性分别为65%、60%、59%、54%、53%、51%。Ma ERF-1编码的蛋白质分子量为26 139.03 u,理论等电点p I为7.81,其亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中,多于疏水性氨基酸。通过PCR和酶切反应鉴定成功构建该基因的表达载体。     

小桐子磷脂二酰甘油酰基转移酶(JcPDAT1) cDNA的克隆与功能鉴定

使用兼并PCR结合RACE技术从能源植物小桐子种子中克隆了一个PDAT基因的cDNA全长,命名为JcPDAT1 (GenBank登陆号为HQ827796)。JcPDAT1全长2 869bp,包含一个长为2 013bp的开放阅读框,编码670个氨基酸。多序列比对和进化分析表明该基因编码蛋白与其他植物PDAT高度同源,具有典型的PDAT结构域。Realtime PCR结果表明JcPDAT1在种子、叶和根里面都有表达,且在种子发育过程中大量表达。酵母互补实验证实该基因编码蛋白具有PDAT酶活性。在与酿酒酵母突变体H1246?的互补实验中发现, TLC层析（薄层层析法）和尼罗红染色结果都显示JcPDAT1的表达使H1246?恢复合成TAG,说明JcPDAT1具有PDAT的功能活性。       

茶树牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CsGGDPS的克隆及表达分析

以铁观音芽叶为材料,验证从茶树转录组数据库中筛选到的1条牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGDPS)的编码全长序列c DNA。该c DNA全长1 661 bp,含有1个1 137 bp完整的开放阅读框,命名为Cs GGDPS。该基因编码378个氨基酸,氨基酸序列具有类异戊二烯合成酶家族的5个保守域和2个特征功能域;序列分析显示,该c DNA与其他植物GGDPS高度保守,与三七(Panax notoginseng)的亲缘关系最近。Cs GGDPS属于不稳定、亲水蛋白,可能定位到叶绿体中,不存在跨膜结构,无信号肽,发生磷酸化的位点可能有20个;二级结构主要由α-螺旋构成,三级结构与拟南芥GGPPS11匹配度最高。实时荧光定量PCR结果表明,在茶树发育过程和不同叶位Cs GGDPS的表达量随芽叶成熟度的增加呈上升趋势,随着做青过程的进行,Cs GGDPS的表达量逐渐升高;Cs GGDPS在父本黄旦、母本铁观音和子一代金观音中均有表达,但表达量存在差异。     

小麦逆境胁迫基因TaSKIP的克隆、定位及初步表达分析

非生物逆境是小麦生长、发育及产量形成的主要限制因子之一。为揭示小麦抗逆胁迫响应机制,并为培育转基因抗逆种质奠定基础,本研究利用同源克隆的方法从普通六倍体小麦中国春中克隆出TaSKIP基因并进行序列分析及基因定位,同时对TaSKIP基因在PEG6000胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,共克隆得到3个TaSKIP基因,其中2个基因被定位于6A和6D染色体上。序列分析表明,TaSKIP-6A编码区长为1 827bp,编码608个氨基酸,TaSKIP-B和TaSKIP-6D编码区长均为1 824bp,编码607个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,小麦TaSKIP蛋白与水稻、玉米和大麦等禾本科植物SKIP蛋白的同源性均大于88%,而且含有相同的SKIP/SNW结构域。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRTPCR)检测结果表明,TaSKIP在模拟干旱胁迫条件下表达量上调,暗示该基因在小麦非生物逆境胁迫响应中起重要作用。     

香蕉MaPIP2-2基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

水通道蛋白（AQPs）是细胞间和细胞内水分运输的主要通道, 对于植物细胞的水分稳态和胁迫响应具有重要作用。本研究从香蕉中克隆了一个水通道蛋白基因MaPIP2-2。序列分析结果表明,该基因的开放阅读框（ORF）为846 bp,编码281个氨基酸。多序列比对和进化树分析结果表明,该基因编码的蛋白与其它植物中水通道蛋白具有较高的一致性,并且与拟南芥AtPIP2-2和AtPIP2-3的亲缘关系最近。亚细胞定位表明该基因定位在细胞膜上。实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因能够在转录水平响应甘露醇、低温、NaCl胁迫和ABA信号。这些结果表明MaPIP2-2可能参与了非生物逆境胁迫应答,为进一步研究MaPIP2-2基因的功能鉴定了基础。     

文心兰ACC氧化酶基因OnACO1克隆与表达分析

以文心兰切花品种"黄金2号"(Oncidium Gower Ramsey‘Gold2’)为材料,通过RT-PCR和RACE技术,从文心兰的花中分离得到了1个ACO基因成员的cDNA,命名为OnACO1(GeneBank登录号为JQ822088)。该基因全长为1 424 bp,包括972 bp的ORF,172 bp的5′-UTR和280 bp的3′-UTR,编码324个氨基酸,其氨基酸序列与石斛兰等兰科植物的ACO氨基酸序列有较高的同源性。构建原核表达载体pGEX-OnACO1,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,在SDS-PAGE中显示出了特异性表达条带,与预测的蛋白大小一致。荧光定量PCR分析表明OnACO1基因的表达具有组织特异性,主要在蕊柱中表达,并且乙烯对该基因的表达有上调作用。     

水稻ABC1基因家族的鉴定及在非生物胁迫下的表达分析

ABC1(Activity of bc1 complex)家族属于蛋白质激酶家族,其成员普遍存在于原核和真核生物中.已有研究表明,几个植物ABC1基因参与非生物胁迫应答.为了解ABC1基因在水稻中的结构和功能,采用生物信息学方法分别在水稻和拟南芥上鉴定出15个和17个ABC1基因,并进行了系统发育和表达分析.结果表明,该家族在单、双子叶植物分离之前就已经发生了分化,其基本特征已经形成;单、双子叶植物分离之后,该家族在水稻和拟南芥中均以物种特异的方式进行了扩增.内含子/外显子结构分析显示多数直系同源基因之间外显子大小接近,而内含子差别较大,水稻含有更多大的内含子;内含子获得是近期伴随水稻ABC1家族进化的重要事件.多序列比对显示,ABC1结构域具有1个保守的氨基酸片段和4个保守的氨基酸残基.在线亚细胞定位预测9个水稻ABC1蛋白定位在叶绿体上.实时定量RT-PCR分析表明,水稻ABC1基因主要在叶片中表达,并且受多种非生物胁迫因素包括H2O2、脱落酸、低温、干旱、黑暗和高盐的调控.说明水稻ABC1家族不仅在逆境胁迫应答中发挥重要作用,可能还与水稻特定的生理过程有关.     

拟南芥AtLURP1基因启动子在转基因烟草和水稻中的功能分析

克隆拟南芥LURP1基因上游1515 bp的启动子调控序列并命名为AtLURP1p,将其与GUS报告基因融合,构建成植物表达载体,分别遗传转化烟草和水稻,获得LURP1p::GUS的烟草和水稻转基因植株及其相应的T2代株系,分别研究LURP1p对水稻稻瘟病、辣椒青枯病侵染及SA、MeJA、ABA等几种重要的植物激素信号分子处理的应答.结果表明:(1)转基因烟草和水稻在几种激素,包括SA、MeJA、ABA的诱导处理下,GUS基因均可以被诱导表达;(2)转基因烟草在细菌性病菌青枯病的侵染下,GUS可被诱导表达并表现出持续表达的趋势,转基因水稻在稻瘟病的侵染下,其GUS基因也被诱导表达,并表现出后期持续上调的趋势.这些研究结果表明,拟南芥LURP1的应答逆境信号通路也存在于烟草和水稻等植物,该启动子可用作诱导型启动子广泛地应用于不同植物抗病基因工程.     

辣椒CaMAPK7启动子顺式作用元件及其表达分析

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在植物生长、发育和适应环境中起着十分重要的作用,但对该家族多数成员的表达调控机制认识仍十分有限。前期实验已分离获得辣椒一个MAPK家族成员Ca MAPK7,并发现该基因的表达受病原菌、高温等逆境的诱导,但其表达调控机制仍不清楚。本研究进一步分离了Ca MAPK7的启动子序列(p Ca MAPK7),发现其TATA框位于-165 bp与-170 bp之间,此外还发现W-box,HSE,TCA,LTR,ERE等多种与生物及非生物逆境胁迫应答相关的顺式作用元件。通过构建该启动子与报告基因GUS融合表达载体p Ca MAPK7::GUS,利用农杆菌介导的本氏烟草叶片瞬间表达系统分析发现p Ca MAPK7可应答青枯菌接种及水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、油菜素内酯(BR)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)等外源激素处理,表明Ca MAPK7应答青枯菌、外源激素处理主要是通过该启动子介导的转录调节实现的。     

外源赤霉素信号对甘蔗分蘖及其内源激素的影响

前期研究发现,外源GA信号影响了甘蔗分蘖进程。为了解GA信号对甘蔗不同分蘖时期叶片内源激素含量的影响,以综合性状优良的甘蔗主栽品种‘桂糖42号’为材料,采用不同外源GA信号调节剂对蔗种进行浸种处理,并以清水处理为对照（CK）,分别测定分蘖初期、盛期和末期+1叶（主苗+分蘖苗）中内源激素吲哚乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）、赤霉素（gibberellins,GA）、乙烯（ethylene,ETH）、细胞分裂素（cytokinin,CTK）、脱落酸（abscisic acid,ABA）和油菜素内脂（brassinosteroids, BR）的含量,并分析它们之间的相关关系。结果表明：外源GA₃（gibberellic acid 3;GA生物合成促进剂）对蔗种浸种处理后,增加了分蘖期甘蔗分蘖叶片中IAA、GA和CTK的总体含量,提高了分蘖前期ETH含量和后期ABA含量;多效唑（paclobutracol, PP₃₃₃;GA生物合成抑制剂）处理后却增加了分蘖前期内源GA和ABA含量,提高了后期分蘖叶片中ETH含量,同时降低了CTK和BR含量。进一步的相关性分析发现,利用外源赤霉素信号促进剂处理蔗种后,甘蔗叶片内源激素IAA与GA、CTK和BR、CTK与GA均呈显著正相关;而ABA与GA呈显著负相关,与ETH呈显著正相关。可见,外源GA信号影响了甘蔗分蘖期叶片内源激素系统,促进生长的激素与抑制生长的激素达到动态平衡状态,最终导致了甘蔗分蘖的差异。甘蔗分蘖与植物内源激素含量密切相关,可通过施用外源激素来影响内源激素的含量,调控激素之间的动态平衡,达到提高甘蔗分蘖形成及其成茎的目的。     

巴西橡胶树氰丙氨酸合成酶基因HbCAS的克隆与表达分析

氰丙氨酸合成酶（β-cyanoalanine synthase,β-CAS）是植物氰化物解毒的关键酶,在调节植物生长发育及逆境胁迫中扮演重要角色。本研究从巴西橡胶树中克隆氰丙氨酸合成酶基因HbCAS,并对其进行分析。结果表明：HbCAS基因开放阅读框长为1113 bp,编码370个氨基酸,其理论分子量为40.15 kDa,等电点为8.90,属于色氨酸合成酶超家族。实时荧光定量PCR分析结果显示,HbCAS基因在橡胶树各种组织中均有表达,其中在胶乳中的表达量最高。同健康树相比,HbCAS基因在死皮树中的表达显著下调。过氧化氢及乙烯利、茉莉酸甲酯、水杨酸及脱落酸等多种激素均能调控HbCAS基因的表达。同时,HbCAS基因的表达也受干旱、低温、甲基紫精、高盐等多种非生物胁迫调节。本研究结果揭示HbCAS基因可能在橡胶树死皮发生、活性氧信号、激素调节及多种非生物胁迫应答中起重要作用。     

大豆GmCYP82C4基因克隆与表达分析

细胞色素P450 CYP82家族基因为双子叶植物特有,参与生长代谢和逆境生理调控。为了探究大豆P450 CYP82的基因功能,克隆大豆P450同源基因GmCYP82C4,得到该基因编码区1584bp,它编码527个氨基酸,编码的蛋白质具有保守的血红素结合域。生物信息学分析表明,GmCYP82C4蛋白与大豆中GmCYP82A3同源性最高,其次为豌豆的PsCYP82A1。亚细胞定位结果显示,GmCYP82C4定位于细胞质膜。实时荧光定量结果表明,GmCYP82C4在大豆幼苗根中表达量最高,能够响应低温、伤害和大豆疫霉胁迫,并受到脱落酸、茉莉酸甲酯、乙烯和水杨酸信号调控。由此推测GmCYP82C4可能通过激素信号途径调控大豆对胁迫的响应。     

寡糖诱导向日葵抗锈病的信号转导途径

为了解寡糖诱导向日葵抗锈病过程中的信号转导途径,利用寡糖、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）预先喷雾处理向日葵叶片,1d后接种锈菌,通过对植株体内脂氧合酶（LOX）活性及SA含量的测定,并通过RT-PCR对SA、JA信号途径的标记基因PR5和PDF1.2等表达水平进行测定,初步确定诱导抗性表达的信号转导途径。结果表明：经寡糖诱导后,向日葵叶片内LOX活性降低,SA含量上升,且诱导水杨酸途径标记基因PR5表达量增加。结果说明寡糖诱导向日葵抵抗锈病主要与SA介导的信号途径有关。     

胡椒4-香豆酸：辅酶A连接酶Pn4CL基因的克隆及表达分析

根据胡椒4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate:coenzyme A ligase, 4CL）基因的部分序列设计引物,运用RACE方法获得其家族成员的1个全长cDNA,命名为Pn4cl,长度2130 bp,开放阅读框1638 bp,编码545个氨基酸。预测Pn4CL分子量为59.57 kDa,理论等电点为5.70。该基因含有AMP-binding（AMP-binding enzyme）、CaiC[Acyl-CoA synthetase (AMP-forming) /AMP-acid ligaseⅡ]、PLN02246、AFD-class I等结合域,具有植物4CL所共有的保守结构域。系统进化分析表明,Pn4CL与北细辛的同源性最高,同时与木兰分支类植物的4CL聚类在一起,与菊分支的进化距离较近,与蔷薇分支的进化距离较远。亚细胞定位表明,该蛋白定位在细胞膜上。Real-time RT-PCR结果表明,该基因受外援激素SA和MeJA诱导表达,同时接种辣椒疫霉菌后,Pn4CL基因的表达量在抗/感2种胡椒中均出现先增加后减少的现象,并且在抗病种质中表达量较高。研究结果为Pn4CL的功能研究提供了理论依据。     

玉米根部萜类合酶基因对干旱与激素处理的表达差异分析

选用两个具有抗性差异的玉米自交系B73与Mo17,分别对其根部进行干旱、脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)以及茉莉酸甲酯与乙烯利联合(MeJA/EP)处理,定量检测4个与防御相关的萜类合酶基因An2、ZmTPS6、ZmTPS8以及ZmTPS26的表达情况。结果表明,4个基因在B73与Mo17应对干旱和ABA处理时基因表达差异明显。在Mo17中,干旱胁迫以及ABA处理显著诱导4个基因的表达;在B73中,干旱处理导致An2、ZmTPS6和ZmTPS8基因表达下调,在ABA处理下时,只有ZmTPS6被显著上调;MeJA与MeJA/EP处理在B73与Mo17中都能上调4个基因的表达,但在Mo17中的诱导程度更剧烈。B73与Mo17的根部在响应胁迫时存在显著的萜类代谢差异,可能为其抗性差异原因之一。     

香蕉中2条MaMLO基因的克隆及表达分析

MLO基因是一类植物特有的抗病基因,为了研究香蕉MLO基因在香蕉抗枯萎病中的作用,利用RACE技术从香蕉中克隆获得了香蕉2条MLO基因,分别命名为MaMLO1和MaMLO2。序列分析表明,MaMLO1的开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸;MaMLO2的开放阅读框为1 689 bp,编码562个氨基酸。系统进化树分析表明,MaMLO1与已登录的香蕉MLO1(XP_009413424)亲缘关系较近,MaMLO2与已登录的香蕉MLO6(XP_009411538)亲缘关系较近。组织特异性研究表明,这2个基因在香蕉各器官中均有表达,但MaMLO2在根中的表达量最大。不同激素处理下的研究表明,MaMLO1受ABA、乙烯和水杨酸诱导上调表达,受茉莉酸诱导下调表达;MaMLO2受ABA、乙烯、水杨酸和茉莉酸4种激素诱导上调表达。在感病品种中2个基因均是下调表达,在抗病品种中均是上调表达。结果表明,克隆到的2条MLO在感病品种中没有参与到香蕉抗枯萎病的过程,而在抗病品种中参与了香蕉抗枯萎病的过程。     

马蓝IGPS基因的克隆、表达分析及原核表达

吲哚-3-甘油磷酸合酶（indole-3-glycerol phosphate synthase,IGPS）是广泛参与生物体内色氨酸、生长素等吲哚化合物合成途径中重要的关键酶之一。为了研究BcIGPS在马蓝吲哚类生物碱合成中的作用,基于马蓝转录组数据,通过RT-PCR技术从马蓝中克隆得到IGPS基因序列,命名为BcIGPS;利用生物信息学分析BcIGPS序列特性;运用qPCR分析BcIGPS在马蓝不同器官及外源诱导处理下的时空表达情况;构建pET-32a-BcIGPS原核表达载体,并优化诱导表达条件。结果表明：BcIGPS（GenBank登录号：MT210517）全长为1176 bp,包含1个开放阅读框（ORF）,编码392个氨基酸,具丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）磷酸化位点31个,无跨膜结构,无信号肽,亚细胞定位于叶绿体中。BcIGPS含有product（indole）活性结构域和IGPS、TrpC特异性位点。qPCR分析结果显示,BcIGPS基因在不同器官的相对表达丰度依次为：叶>茎>花>根;其响应茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）、乙烯利（ETH）外源诱导信号的诱导,经MeJA和ETH处理后,分别在24 h和36 h最高,为初始水平的5.53、6.87倍;在SA处理下,BcIGPS表达响应最为强烈,呈先骤升后骤降的变化趋势,在12 h最高达初始水平的33.13倍;ABA处理后,其表达量变化不显著。所构建的pET-32a-BcIGPS原核表达载体在大肠杆菌BL21中表达,其最适条件为37 ℃、0.4 mmol/L IPTG培养3 h,BcIGPS重组蛋白主要以包涵体形式存在,且蛋白分子量与预测相符。