对猪小腔卵泡孤雌激活胚胎发育力的初步探索

为探讨直径为2 mm以下和2～6 mm猪卵泡卵母细胞的体外培养分裂率与囊胚率差异,采用相同体外成熟培养条件,来培养从不同直径的2种卵泡中所抽出的卵母细胞,在卵母细胞成熟培养后44～48 h,对卵母细胞进行化学激活和体外培养,观察胚胎体外发育能力;在培养48 h时进行分裂数据统计,培养168 h时统计囊胚个数。结果发现,2 mm以下猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均分裂率与2～6 mm猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均分裂率差异显著,分别为62.46%、81.76%(P0.05);2 mm以下猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均囊胚率与2～6 mm猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均囊胚率差异不显著,分别为11.71%、15.30%。说明正常卵泡、小腔卵泡的卵母细胞在体外成熟后,孤雌激活胚分裂率依次降低,孤雌胚胎的分裂能力随卵泡直径的增大而增强;正常卵泡、小腔卵泡的卵母细胞体外成熟后,孤雌激活胚囊胚率随卵泡直径的增大有一定增高,但变化不显著。     

BCB染色液对绵羊不同直径卵泡卵母细胞的筛选作用

为探讨亮甲酚蓝(BCB)染色液对绵羊不同直径卵泡卵母细胞的筛选作用,对筛选后的卵母细胞进行孤雌激活,统计不同组间成熟率、卵裂率及囊胚率的差异。将卵泡直径分为2mm、2~5mm、5mm共3组,经26μmol/L的BCB染色90min后,结果显示:(1)直径5mm卵泡中的卵母细胞阳性率极显著高于5mm以下卵泡组(P0.01);(2)卵泡直径5mm中BCB+组卵母细胞孤雌激活后的体外培养效率显著高于其余2组;(3)不同试验组卵母细胞孤雌激活后获得的囊胚总细胞数在BCB+组卵母细胞中,直径2~5mm组与5mm组间没有显著差异(P0.05),但极显著高于直径2mm组(P0.01);BCB-卵母细胞在各组间没有显著差异(P0.05);未经染色的卵母细胞中,直径2~5mm组与5mm组间没有显著差异(P0.05),但显著高于直径2mm组(P0.05);此外,2mm的卵母细胞,BCB+组极显著高于对照组和BCB-组(P0.01),在直径2~5mm组和5mm组,BCB+组、对照组和BCB-组均差异极显著(P0.01)。以上结果说明,直径2mm以上卵泡的卵母细胞用BCB染色液筛选后更适合体外培养。     

不同直径卵泡对绵羊卵母细胞体外发育能力的影响

以屠宰场绵羊卵巢为材料,采用抽吸法收集小卵泡、中卵泡、大卵泡卵母细胞,研究不同卵泡直径对卵母细胞回收效果、比例分布以及对卵母细胞直径、谷胱甘肽(GSH)含量和体外发育能力的影响。结果表明,3种卵泡卵母细胞比例分布差异极显著(P0.01);3种卵泡卵母细胞的回收率无显著差异(P0.05),但中、大卵泡卵母细胞可用率极显著高于小卵泡卵母细胞(P0.01);小卵泡卵母细胞的直径极显著小于中、大卵泡卵母细胞(P0.01);中、大卵泡卵母细胞成熟培养24 h后GSH含量显著高于小卵泡卵母细胞(P0.05);经孤雌激活体外培养后,中、大卵泡卵母细胞的成熟率分别极显著(P0.01)、显著(P0.05)高于小卵泡卵母细胞,中、大卵泡卵母细胞囊胚率极显著高于小卵泡卵母细胞(P0.01);中卵泡卵母细胞囊胚细胞总数显著高于小卵泡卵母细胞(P0.05),但与大卵泡卵母细胞差异不显著(P0.05)。因此,直径≥2 mm的卵泡的卵母细胞适合体外培养和体外胚胎的生产。     

卵泡大小及卵泡液对牛卵母细胞体外受精后发育的影响

 以屠宰场牛卵巢为材料，研究了卵泡大小和卵泡液对牛卵母细胞体外成熟、受精和培养后发育潜力的影响。试验1：按照卵泡大小将卵丘卵母细胞复合体（COCs）分为4个试验组：＞8 mm组、2～8 mm组、腔前卵泡（PF）卵母细胞组和混合（将前3种卵母细胞混合）组。结果表明，卵泡大小直接影响卵母细胞受精后的发育，同时，源自不同大小卵泡的卵母细胞混合培养，可以促进未成熟的腔前卵泡内卵母细胞的发育。试验2：将源自优势卵泡（＞8 mm）、小卵泡（2～8 mm）和混合（所有卵泡液混合）的牛卵泡液（BFF），按照10%添加到成熟培养液中，3个试验组的卵裂率和囊胚率均高于没有添加BFF的对照组(P<0.05)，但添加10%的优势卵泡液使卵母细胞和胚胎发生粘连，易于造成丢失。试验3：与未添加BFF的对照组相比，成熟培养液中分别加入10%、20%和40%的混合BFF，均可明显促进卵母细胞受精后的发育(P<0.05)，但20%组和40%组出现卵母细胞及胚胎粘连。因此，成熟培养液中添加10%的混合BFF较为适宜。     

血管内皮生长因子对水牛卵母细胞体外受精的影响

[目的]探讨血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）对水牛卵母细胞体外受精的影响,为优化水牛卵母细胞体外培养体系及提高水牛体外胚胎生产效率奠定基础.[方法]以带有3层以上卵丘细胞的卵丘—卵母细胞复合体（COCs）为材料,分别在水牛卵母细胞体外成熟液和受精液中添加重组人VEGF165,研究VEGF对水牛卵母细胞体外成熟、体外受精和早期胚胎发育的影响.[结果]在成熟液中添加10ng/mLVEGF,水牛卵母细胞的第一极体排出率由57.3％提高到72.3％,差异显著（P＜0.05,下同）;体外受精后的受精卵分裂率由41.0％显著提高到53.3％.在受精液中添加10 ng/mL VEGF,水牛体外受精的受精卵分裂率由41.9％提高到63.0％,差异极显著（P＜0.01,下同）,囊胚形成率由17.0％显著提高到32.6％.在成熟液和受精液中同时添加10ng/mLVEGF,水牛体外受精的受精卵分裂率和囊胚形成率由43.4％和19.0％极显著提高到64.3％和27.2％,囊胚细胞数由89.5显著提高到106.8.[结论]VEGF能促进水牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎的发育,因此可将VEGF用于水牛卵母细胞体外受精体系的优化,提高水牛体外胚胎生产效率.     

山羊小腔卵泡卵母细胞的体外成熟和体外受精

采集繁殖和非繁殖季节山羊卵巢，回收大腔（３～６ｍｍ）和小腔（＜２ｍｍ）卵泡卵母细胞，进行体外成熟和受精，结果如下：①繁殖季节的大腔和小腔卵泡卵母细胞体外成熟率（６８．４％，２７．５％）均显著（Ｐ＜０．０５）高于非繁殖季节（５２．５％，２０．６％）；②１和１．５周岁龄羊与成年羊相比，前两者的小腔卵泡卵母细胞采集数显著（Ｐ＜０．０５）多于后者（２５．６，２２．５：１５．ｌ），但卵母细胞体外成熟率无显著差异（Ｐ＜０．０５）；③随卵母细胞直径增加，其体外成熟率呈显著上升趋势；④与加新生犊牛血清和生殖激素在颗粒细胞悬浮液中培养相比，加发情山羊血清和激素在颗粒细胞单层上培养可显著（Ｐ＜０．０５）提高小腔卵泡卵母细胞体外成熟率（２０．８％：３４．５％）；⑤将体外成熟的小腔卵泡卵母细胞与体外获能精子进行受精，其受精率为３５．７％（５１／１４３）。     

活体采卵时间间隔对牛克隆胚胎发育的影响

采用活体穿刺技术（ovum pick up,OPU）,分别间隔3／4（1周2次）、5、7、10、14d对同一批荷斯坦奶牛进行穿刺采卵,根据优势卵泡直径和所有卵丘细胞-卵母细胞复合体的状态确定采卵时卵泡所处的发育阶段,从而确定卵泡波的发育动态变化。并以间隔不同时间采卵获得的卵母细胞成熟后进行体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）制备克隆牛胚胎。重构胚体内培养7d后,通过比较克隆囊胚的发育率判定卵母细胞质量的差异,从而确定最佳的采卵时间间隔。结果显示：①穿刺采集所有直径超过3min的卵泡后,可起始1个新卵泡波,大约5d后从属卵泡开始进入凋亡阶段,7d后进入晚期凋亡阶段,第7～10d又起始1个新的卵泡波,第14d时第2个卵泡波中的从属卵泡起始凋亡。②间隔不同时间组克隆囊胚发育率存在差异,间隔3／4d（1周2次）为23．1％,间隔5d组为15．0％,间隔7d组为10．9％,间隔10d组为4．9％,间隔14d组为29．0％。结果显示：间隔不同的时间采卵,卵泡所处的发育状态存在差异。并对卵母细胞质量具有显著的影响。     

活体采卵时间间隔对牛克隆胚胎发育的影响

采用活体穿刺技术（ovum pick up,OPU）,分别间隔3／4（1周2次）、5、7、10、14d对同一批荷斯坦奶牛进行穿刺采卵,根据优势卵泡直径和所有卵丘细胞-卵母细胞复合体的状态确定采卵时卵泡所处的发育阶段,从而确定卵泡波的发育动态变化。并以间隔不同时间采卵获得的卵母细胞成熟后进行体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）制备克隆牛胚胎。重构胚体内培养7d后,通过比较克隆囊胚的发育率判定卵母细胞质量的差异,从而确定最佳的采卵时间间隔。结果显示：①穿刺采集所有直径超过3min的卵泡后,可起始1个新卵泡波,大约5d后从属卵泡开始进入凋亡阶段,7d后进入晚期凋亡阶段,第7～10d又起始1个新的卵泡波,第14d时第2个卵泡波中的从属卵泡起始凋亡。②间隔不同时间组克隆囊胚发育率存在差异,间隔3／4d（1周2次）为23．1％,间隔5d组为15．0％,间隔7d组为10．9％,间隔10d组为4．9％,间隔14d组为29．0％。结果显示：间隔不同的时间采卵,卵泡所处的发育状态存在差异。并对卵母细胞质量具有显著的影响。     

培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响

[目的]提高卵母细胞体外成熟质量,优化猪早期胚胎体外培养体系。[方法]以改良TCM199,NCSU-23培养液为基础液,分别添加10%的猪卵泡液（PFF）和10%的优质胎牛血清（FBS）进行卵母细胞体外成熟培养,以成熟率、孤雌胚胎体外发育率等为指标,研究不同培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响。[结果]猪卵母细胞在TCM199,TCM199＋FBS和TCM199＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（54.2±3.5）%、（68.5±3.2）%和（69.3±3.7）%,在NCSU-23,NCSU-23＋FBS和NCSU-23＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（51.6±3.3）%、（63.2±3.1）%和（65.5±3.5）%,添加10%的FBS和PFF在0.05水平上显著提高了卵母细胞成熟率;6组不同成熟培养液得到的成熟卵母细胞在孤雌激活后囊胚发育率差异不显著,但TCM199＋PFF组的囊胚细胞数（36.5±4.8）在0.05水平上显著高于TCM199和NCSU-23组的囊胚细胞数（18.7±3.2和15.5±2.4）。[结论]改良TCM199,NCSV-23培养液中添加10%PFF和10%FBS可显著促进猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育。     

基于均匀设计优化延边黄牛卵母细胞体外成熟及核移植后卵裂体系

[目的]应用均匀设计对延边黄牛卯母细胞体外成熟及核移植后的卵裂体系进行优化。[方法]用抽吸法回收卵母细胞,在不同条件下进行卵母细胞的体外成熟培养,然后对成熟卵母细胞进行核移植、融合、激活以及胚胎的体外培养。采用均匀设计法,选用U10（10^3）均匀设计,比较了不同的卵巢保存温度、成熟培养时间以及卵泡直径大小对牛卵母细胞体外成熟率及卵裂率的影响。[结果]延边黄牛卵母细胞体外成熟的最佳条件为：在卵巢保存温度为26℃或31℃的条件下,选取直径为8．0mm的卯母细胞成熟培养24h;卵母细胞核移植后卵裂的最佳条件为：在卯巢保存温度为26℃的条件下,选取直径为6．0mm或8．0mm的卵母细胞培养24h。[结论]该结果对延边黄牛或其他种黄牛的育种及种群扩繁具有一定的参考意义。     

MIF在不同直径猪卵泡的表达变化规律

为分析巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)在不同直径健康猪卵泡上的表达变化规律,将收集到的90个健康母猪卵巢,通过ELISA检测不同直径卵泡液中MIF质量浓度,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测颗粒细胞中MIF基因mRNA和蛋白的表达水平,采用免疫荧光检测MIF在颗粒细胞中的分布情况。结果显示:1)中等直径卵泡(3～4mm)液中MIF的质量浓度(54.17±7.86ng/mL)显著高于大卵泡(6mm,32.29±1.47ng/mL)和小卵泡(1～2mm,38.89±0.98ng/mL)(P0.05);2)中等直径卵泡颗粒细胞中MIF基因mRNA和蛋白质表达量也显著高于大卵泡和小卵泡的表达量(P0.05);3)MIF也在不同直径卵泡颗粒细胞中的细胞核和细胞质表达,但多集中于细胞质中。综上,随着猪卵泡发育过程,MIF在中等直径卵泡中表达量最高。本研究为母猪卵泡发育和排卵提供新的线索。     

EGF和β-巯基乙醇对羔羊卵母细胞体外受精和体外发育的影响

[目的]为优化幼畜卵母细胞体外培养体系提供理论基础。[方法]研究在成熟液中添加EGF和β-巯基乙醇对绵羔羊卵母细胞受精和卵裂、囊胚情况的影响,并与成年绵羊卵母细胞进行比较。[结果]在成熟液中添加不同浓度的EGF对羔羊卵母细胞卵裂率和囊胚率无显著影响(P0.05)。添加不同浓度的β-巯基乙醇可以提高羔羊卵母细胞囊胚率,其中添加100μmol/Lβ-巯基乙醇有显著影响(P0.05),但对卵裂率影响不显著(P0.05)。羔羊卵母细胞卵裂率和囊胚率均显著低于成年羊(P0.05)。添加100μmol/L的β-巯基乙醇能显著提高羔羊卵母细胞正常受精率(P0.05),且与成年羊卵母细胞受精率差异不显著(P0.05)。未添加β-巯基乙醇多精入卵率显著高于成年羊(P0.05),而添加100μmol/L的β-巯基乙醇多精入卵率与成年羊差异不显著(P0.05)。成熟液中不添加β-巯基乙醇时未受精率(20.0%)高于成年羊组(12.3%)和β-巯基乙醇(13.5%),但差异不显著(P0.05)。[结论]添加100μmol/L的β-巯基乙醇能显著提高羔羊卵母细胞发育能力,提高正常受精的比例并减少多精子受精的发生,但羔羊卵母细胞发育能力仍显著低于成年羊。     

颗粒细胞和培养微滴大小对牛卵母细胞体外受精后胚胎发育的影响

以屠宰场牛卵巢为材料,研究了颗粒细胞单层(GCM)和培养微滴大小对牛卵母细胞体外成熟、受精和培养后发育潜力的影响。试验1从卵泡抽取卵丘卵母细胞复合体(COCs),并根据卵母细胞外面卵丘细胞的层数将其分为3类,分别在体外成熟(IVM)和早期胚胎的体外培养(IVC)培养液中添加GCM,与不添加的对比;添加GCM对1级卵母细胞的卵裂率、6~8细胞发育率和囊胚率无明显影响,但添加GCM的2级、3级卵母细胞,受精后的卵裂率、6~8细胞发育率和囊胚率分别高于未添加组(P<0.05)。试验2将取自每头牛的约20枚卵母细胞,分别置于不同大小的微滴(30μl,50μl,100μl和200μl)中培养、受精,30μl和50μl组的囊胚发育率明显高于100μl和200μl组。     

发情期蓝狐卵泡发育的显微结构观察(英文)

[目的]对发情期蓝狐卵巢的组织结构和卵泡发育过程的变化进行研究。[方法]采集10只发情期蓝狐的左侧卵巢共计10枚,利用光学显微镜对卵巢的组织结构和卵泡的发育过程进行观察,同时利用目镜测微尺和显微照相技术分别对30个原始卵泡、30个初级卵泡、15个生长卵泡、15个囊状卵泡、15个成熟卵泡及各级卵泡中的卵母细胞进行测量和拍照。[结果]蓝狐卵巢由生殖上皮、白膜、皮质和髓质构成。皮质内分布着大量的间质细胞及不同发育阶段的卵泡,位于卵巢的外周;髓质位于皮质下层,分布着较多的血管。卵泡发育过程中,各级卵泡和卵母细胞的直径差异较大(卵泡为45.45~974.55μm,卵母细胞为30.23~147.27μm),在初级卵泡阶段出现透明带物质。卵泡闭锁发生于卵泡生长的各个时期,主要表现为卵母细胞的皱缩,细胞核固缩;颗粒细胞松散、退化。[结论]为揭示雌性蓝狐的生殖机理提供了组织学依据。     

发情期蓝狐卵泡发育的显微结构观察

[目的]对发情期蓝狐卵巢的组织结构和卵泡发育过程的变化进行研究。[方法]采集发情期蓝狐的左侧卵巢共计10枚,利用光学显微镜对卵巢的组织结构和卵泡的发育过程进行观察,同时利用目镜测微尺和显微照相技术分别对30个原始卵泡3、0个初级卵泡、15个生长卵泡、15个囊状卵泡、15个成熟卵泡及各级卵泡中的卵母细胞进行测量和拍照。[结果]蓝狐卵巢由生殖上皮、白膜、皮质和髓质构成。皮质内分布着大量的间质细胞及不同发育阶段的卵泡,位于卵巢的外周;髓质位于皮质下层,分布着较多的血管。卵泡发育过程中,各级卵泡和卵母细胞的直径差异较大（卵泡为45.45～974.55μm,卵母细胞为30.23～147.27μm）,在初级卵泡阶段出现透明带物质。卵泡闭锁发生于卵泡生长的各个时期,主要表现为卵母细胞的皱缩,细胞核固缩;颗粒细胞松散、退化。[结论]为揭示雌性蓝狐的生殖机理提供了组织学依据。     

CB·氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养中的作用

[目的]研究CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中的作用,为优化相关技术体系提供依据。[方法]卵母细胞经体外成熟培养,采用不同孤雌激活方法(Ele.+CB组、CB组、Ele.组、对照组),研究CB在激活中的作用。激活后采用PZM3培养液,并去除氨基酸成分,探索氨基酸对体外培养胚胎的作用。[结果]CB+Ele.组的卵裂率显著地高于其他3组(P<0.05),囊胚率为32.7%,囊胚细胞数为61.4,而其他3组均未出现囊胚。电激活(脉冲电压100 V/mm,脉冲时程100μs,脉冲次数1次)联合CB处理,可激活卵母细胞体外发育至囊胚,CB有助于提高卵裂率、囊胚率。添加氨基酸的培养液中的卵母细胞的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著提高(P<0.05),表明氨基酸能提高猪孤雌激活胚胎培养效果。[结论]添加CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中能提高胚胎的培养效果。     

水牛受精卵胞质内注射转基因的初步研究

[目的]旨在探讨通过向水牛受精卵胞质内注射外源DNA实现转基因的可行性。[方法]水牛卵母细胞体外成熟20～22 h后随机分为2组:①在体外受精7～10 h或18～20 h后向卵胞质内注入约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA溶液;②分别注入单个精子与约7.5 pl 50μg/ml含线性EGFP片段的DNA混合物,观察外源基因在胚胎发育过程中的表达情况。[结果]受精卵胞质内注射的早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率与ICSI-Tr差异不显著(P0.05),且IVF 7～10 h时注射的分裂率、早期胚胎基因表达率均显著高于18～20 h(P0.05)。[结论]水牛IVF受精卵胞质内注射外源基因能获得转基因胚胎,且IVF后7～10 h注射的效果优于IVF后18～20 h注射。     

生长分化因子9在兔卵巢中的免疫组织化学定位

［目的］探讨生长分化因子9（GDF9）在兔卵巢卵泡发生过程中的调控机制。［方法］采用免疫组织化学方法测定GDF9蛋白在兔卵巢中的表达定位情况。［结果］GDF9在原始卵泡中没有表达;在初级卵泡、次级卵泡和有腔卵泡卵母细胞及有腔卵泡颗粒细胞、透明带及卵泡液中均检测到GDF9蛋白;在黄体中也有GDF9的表达。［结论］GDF9不仅是卵母细胞分泌因子,而且是颗粒细胞的分泌因子,其表达随兔卵巢中卵泡发生呈时空动态变化,在兔卵巢卵泡发生过程中发挥了重要作用,参与了黄体活动的调节。