鳗鲡疱疹病毒对欧洲鳗鲡的致病性研究

为了明确鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AngHV)的致病性,本实验采用一株从鳗鲡“脱黏败血综合征”病料中分离的AngHV(NA16108),研究了其对欧洲鳗鲡幼鳗的致病性。结果显示,注射AngHV的鳗鲡体表出现黏液脱落、鳍条出血、红头等症状;鳃部出现黏液增多、出血,肝脏褪色、肿大,脾脏和肾脏肿大等病变;进一步的组织病理学观察发现,鳗鲡的体表黏液及黏膜上皮细胞脱落,次级鳃瓣增生、呼吸细胞肿胀坏死,脾脏细胞坏死、黑色素细胞聚集,肾小管管壁上皮细胞坏死、管腔变窄等病理症状;这与鳗鲡“脱黏败血综合征”的发病特征一致。致死率分析显示,从第4天开始攻毒组鳗鲡开始出现死亡,第7天和第14天的累计死亡率分别达到26.7%和56.7%;荧光定量PCR检测显示,在攻毒鳗鲡肝脏、脾脏、肾脏、肠道、鳃和皮肤黏液中均可检测到AngHV;另外,用鳗鲡卵巢细胞系(eel ovary cell line, EO)从攻毒鳗鲡主要内脏器官中重新分离出AngHV,表明鳗鲡发生了AngHV的系统侵染。研究表明,AngHV是鳗鲡“脱黏败血综合征”的致病病原,这为深入开展该病的发病机制及防控研究奠定了基础。     

养殖欧洲鳗鲡体表溃疡病病原菌的分离、鉴定及药敏试验

从福建诏安患病的人工养殖欧洲鳗鲡体内分离到1株致病菌,人工回归感染实验显示分离的菌株能使欧洲鳗鲡致病死亡,且临床症状与自然病例相似。分离菌具有β-溶血性;可在含盐量4%的培养基上生长;革兰氏染色呈阴性,短杆状,具有运动性;其生化反应特性与其他水生动物源的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)相同;16S rRNA基因序列分析结果显示:分离菌株在系统发育树上与A.hydrophila属同一分支,相似性达99.8%。根据分离菌株的形态、生理生化特性,结合16S rRNA序列测定(GenBank登录号为JN391411)与系统发育分析,将其鉴定为嗜水气单胞菌(A.hydrophila)。药敏试验结果表明分离菌对头孢噻肟钠、氟苯尼考、复方新诺明、奥复星、头孢吡肟、头孢孟多、左氟沙星等高度敏感。     

鳗鲡疱疹病毒的生物学及理化特性

为了明确鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AngHV)的生物学及理化特性,本实验利用一株从欧洲鳗鲡"脱黏败血综合征"病料中分离的AngHV病毒株,研究了其增殖特性及其对主要鱼类细胞系的感染敏感性,进一步分析了其对热、酸碱、氯仿和乙醚等理化因子的耐受性。结果发现,AngHV感染的鳗鲡卵巢细胞系(eel ovary cell line, EO)内可见典型的疱疹病毒样颗粒,细胞出现时序性细胞病变;AngHV可在EO细胞系内稳定传代,较适宜扩繁温度为25～27°C,不能在鲤上皮瘤细胞系(epithelioma papilloma cyprinid cell line, EPC)、草鱼卵巢细胞系(grass carp ovary cell line, CO)、胖头逓肌肉细胞系(fathead minnow cell line, FHM)、大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(chinook salmon embryo cell line,CHSE-214)、虹鳟性腺细胞系(rainbow trout gonad cell line, RTG-2)及蓝鳃太阳鱼细胞系(bluegill ...     

锦鲤疱疹病毒天津株的分离与鉴定

为分析近年来天津地区养殖鲤(包括锦鲤)暴发性死亡的病因,利用病原菌分离、细胞培养、电镜观察、组织病理切片、人工感染实验、PCR和荧光定量PCR检测、基因分型等方法对患病鱼及病原进行了研究。结果显示,在患病鱼体表未发现大量寄生虫;在肝、脾、肾等内脏组织中未能分离到细菌;在鳃组织中发现大量的圆形病毒颗粒;使用患病鱼组织滤液感染锦鲤鳍条原代细胞,可观察到典型的细胞病变效应(CPE),注射患病鱼组织滤液和产生病变的细胞上清液可分别导致健康锦鲤93.3%和86.7%的死亡率;通过病理组织切片观察,主要病变组织为鳃、肝脏和肾脏。采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测方法进行PCR检测发现KHV呈阳性,且KHV在鳃组织中含量最高,肾脏次之,脑组织中最少。结合TK基因全长序列建立系统进化树和基因型分析,证实此次分离到的KHV为亚洲型毒株,属于I++II–基因型,将其命名为KHV-TJ1601株。这是我国华北地区首次报道KHV I++II–基因型的存在,可为KHV的进化分析和疫苗制备提供基础资料。     

鲤科疱疹病毒Ⅱ型射阳株的分离与鉴定

对患"鳃出血"病的异育银鲫(Carassius auratus gibelio)病灶组织进行分离,并通过回归感染试验、细胞分离鉴定、电镜观察以及PCR几种方法结合来鉴定。结果显示:健康异育银鲫注射组织滤液5 d后开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为80%,对照组没有死亡。对患病鱼内脏组织经超薄切片,电子显微镜观察发现组织内有大量的病毒颗粒,成熟的病毒粒子直径大小170~200 nm,与疱疹病毒Ⅱ型病毒粒子相符。滤液经疱疹病毒Ⅱ型特异性的PCR检测,获得阳性目的片段,同时将无菌处理的病样滤液接种胖头鲤细胞(FHM),培养1 d后出现明显的细胞病变(CPE),单层细胞网状收缩,坏死细胞聚集。收集细胞培养液,进行病毒特异性的PCR检测,并检测到436 bp的阳性片段。结果表明:从江苏射阳某"鳃出血"病异育银鲫养殖鱼塘分离到的病毒为疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)病毒。     

鲤疱疹病毒2型武汉株的分离与鉴定

采用细胞培养、超薄切片电镜观察、巢式PCR检测以及病毒DNA克隆与测序分析等技术, 从湖北武汉一循环水养殖系统中患出血病异育银鲫(Carassius auratusgibelio)体内分离鉴定了一株鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)病毒, 命名为鲤疱疹病毒2型武汉株(CyHV-2-WH)。患病鱼组织匀浆液接种锦鲤鳍条细胞系(Koi-Fin)可产生典型的细胞病变效应。用患病鱼组织匀浆液与细胞培养物分别人工感染异育银鲫, 均可重复出与自然发病相同的症状, 死亡率达100%。患病鱼脾与肾脏组织超薄切片电镜观察结果显示, 病毒为具囊膜的球形病毒, 囊膜直径为170~200 nm, 病毒衣壳直径为110~120 nm, 病毒在细胞核内复制、组装。采用CyHV-2的特异引物对病鱼样本和感染细胞培养物样本进行巢式PCR检测, 均能扩增出357 bp的目的条带, 将该扩增产物进行测序与比对分析后发现, 其与GenBank中已报道的CyHV-2毒株的DNA解旋酶基因高度同源(99.44%以上), 与鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)也有较高的同源性(81.55%)。系统进化分析结果显示, CyHV-2-WH株与JS2012、H.Fukuda、YC110907等CyHV-2病毒株属同一分支。

     

养殖欧洲鳗鲡脱粘病的研究

９９６年６月～１０月,对养殖欧洲鳗鲡的脱粘病进行了病原菌分离、人工感染、病原菌生理、生化特性和药物敏感性的测定,观察其病理组织变化。结果认为病原菌为革兰氏阴性、具动力的弧状菌;氧化酶、过氧化氢酶、甲基红反应、吲哚试验、Ｖ－Ｐ反应阳性;对Ｏ１２９敏感、非Ｏ１群霍乱血清凝集阳性;还原硝酸盐;耐盐范围０～６;对氯霉素、四环素、壮观霉素等敏感。鉴定该病原菌为非Ｏ１群霍乱弧菌。主要病理变化为肝细胞肿胀、核固缩,肝脏、肾脏组织内形成坏死病灶区,肠、胃发炎,肠粘膜层坏死、脱落,部分心肌纤维坏死。     

鳗鲡冠状病毒样病毒的细胞分离与培养

实验选用４种鱼类传代细胞,对首次发现的鳗鲡“狂游病”的病原－鳗鲡冠状病毒样病毒进行了细胞分离与培养。本研究在鲤上皮乳头状瘤细胞中复制了鳗鲡冠状病毒样病毒粒子,并经病毒细胞培养物的电镜负染和超薄切片法检查得到了证实。     

锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定

2013年4月,广东省一锦鲤养殖场暴发不明病因疾病,濒死锦鲤在塘边游动缓慢直至死亡,死亡率高达100%。现场采样发现,发病锦鲤体长25 cm,眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑点,解剖发现内脏器官包括肝、脾、肾肿大。细菌分离结果显示,内脏器官肝脏和肾脏中未分离到细菌。提取自然发病鱼的肝、脾、肾、鳃组织DNA作为模板,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测引物进行PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物。NCBI的Blast搜索结果显示,扩增序列与KHV胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因核苷酸序列同源性为99%。病鱼内脏组织研磨过滤除菌后,腹腔注射20尾锦鲤,可复制出与自然发病相似的症状,并于7 d内全部死亡。取病鱼的鳃和肾脏研磨过滤除菌后进行细胞感染实验,结果显示,组织滤液感染CCB细胞后,盲传5代可以观察到典型的细胞病变效应(CPE)。将出现典型CPE的CCB细胞进行超薄切片制备和电镜观察,电镜下病毒呈对称20面体,直径约100 nm。将出现典型CPE的细胞进行间接免疫荧光实验,可以观察到特异性荧光。根据TK基因全长序列建立系统进化树,证实该毒株为KHV亚洲型毒株,暂命名为KHV-GZ1301株。研究结果可为KHV起源进化、分类以及疾病防控提供重要材料。     

美洲鳗鲡致病性鲍曼不动杆菌的分离、鉴定及致病性分析

为确定海南某鳗鲡养殖场患病美洲鳗鲡大量死亡的原因,从患病美洲鳗鲡肝脏和脾脏中分离获得1株优势菌株AB01,回归感染证实该菌株为导致此次美洲鳗鲡患病的病原菌。经生理生化鉴定、16S rDNA基因序列比对及系统发育分析,判定菌株AB01为鲍曼不动杆菌。致病性分析结果显示,菌株AB01对美洲鳗鲡的半致死浓度为4.63×106CFU/mL。组织病理学观察显示,患病美洲鳗鲡的肝脏、脾脏均发生不同程度的病变,其中,肝脏中部分肝索排列紊乱,细胞肿胀,胞核溶解,胞质疏松,结构模糊,有大量大小不等的空泡;脾脏中胞质多处稀疏,伴有大面积损伤。药敏检测显示,鲍曼不动杆菌AB01对头孢噻吩、头孢唑啉、阿奇霉素、丁胺卡那霉素、利福平、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星敏感,对氟苯尼考、氨苄西林等9种抗生素中度敏感,对氨曲南和四环素等20种抗生素有多重耐药性。     

欧洲鳗鲡MyD88基因的克隆及其免疫功能分析

髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,My D88)是TLR(toll-like receptor)信号通路的关键接头蛋白,在先天性免疫中发挥重要作用。实验首次克隆了欧洲鳗鲡My D88基因c DNA全长序列,命名为Aa My D88,其全长为1 539 bp,开放阅读框为846 bp,编码282个氨基酸。该蛋白三维丝带空间结构图与人类的My D88十分相似,具有My D88家族典型的死亡结构域和TIR(toll-like/IL-1 receptor)结构域,其中TIR结构域中含有3个序列高度保守的box1、box2和box3。同源性分析显示,欧洲鳗鲡My D88氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为76.3%,与其他鱼类相似性为67.5%~73.2%,与哺乳动物相似性较低,为61.6%~62.6%。欧洲鳗鲡My D88在系统进化树中与其他鱼类My D88聚为一支,哺乳类以及两栖类My D88分别聚为一支。实时荧光定量PCR检测发现,Aa My D88基因在欧洲鳗鲡各组织器官中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,心脏、肠、脾脏以及肾脏中也有较高的表达,而肌肉和鳃中的表达水平较低;欧洲鳗鲡经山羊Ig G肌肉注射后,肾脏Aa My D88基因在第7天表达量有显著性提高,14 d后恢复至正常水平,而脾脏Aa My D88基因表达水平从第7~21天持续显著上调,于第7天达到峰值,其表达量为肾脏的1.7倍;欧洲鳗鲡鳍细胞系经poly I:C处理后,Aa My D88基因表达水平在3 h显著降低,6~48 h均有显著升高,于12 h达到峰值。LPS处理后的欧洲鳗鲡鳍细胞系Aa My D88基因表达水平在3 h显著降低,6和12 h显著升高,于12 h达到峰值,24 h后恢复至正常水平。poly I:C处理组My D88基因表达水平在12~48 h均显著高于LPS处理组。研究表明,My D88在欧洲鳗鲡抵御外源微生物的免疫应答反应中发挥重要作用。     

西伯利亚鲟海豚链球菌的分离鉴定及毒力基因检测

2013年8-9月,四川雅安汉源湖养殖的西伯利亚鲟发生一种以体表溃疡、内脏出血和心外膜囊肿为特征的传染病.为明确其病因,本研究从自然发病鱼的肝、脾和肾进行了病原菌的分离、人工感染、分离菌的表型特征和分子生物学特征的检测.结果从患病鱼体内分离到一株G+链状球菌(Ab130920),人工感染实验证实了其病原性,生理生化特性与海豚链球菌(ATCC29178)基本一致;16S rDNA序列(GenBank登录号:KJ162337)与GenBank中S.iniae 16S rDNA序列同源性最高,在以16S rDNA序列及其GenBank中同源性较高的相关序列构建的系统发育树上,分离菌与海豚链球菌聚为一支;同时,在基于S.iniae lctO基因的特异性PCR检测中,从分离株基因组DNA扩增出预期大小的870 bp条带,进而鉴定分离菌Ab130920为S.iniae.在对cpsD、simA、sagA、pdi和scpI等5种S.iniae毒力基因的多重PCR检测中,分离菌均扩增出相应大小的特异性片段,表明其为一毒力较强的菌株,与人工感染实验的高致病性结果相佐证;药物敏感性检测发现其对阿莫西林、强力霉素、氟苯尼考等抗菌药物敏感,但对新生霉素、利福平、氧氟沙星耐药.     

鳗源嗜水气单胞菌主要外膜蛋白基因克隆及其表达

A pair of primers were designed according to the published nucleotide sequence of a putative outer membrane protein gene (omp) of Aeromonas hydrophila . With the specific primers, a target fragment about 1.1 kb was amplified from Aeromonas hydrophila ML316 via PCR .The target fragment was inserted into the linearized pGEM-T easy vector. After enzyme restriction and sequencing analysis,the nucleotide data had been further analyzed by DNAman and ClutalW software. The analysis results showed that the cloned DNA fragment had a longest open reading frame (ORF) of 1035 nt,it predicted to be encoded a 344 aa protein with the molecular weight of 36 kD. Hydrophobicity analysis suggested that the protein was highly hydrophilic, especialy at the first 24 aminoacid, this region could function as signal peptide. The homologious comparison proved the cloned gene had 96% homology to the sequence of the omp gene, and the alignment of the amino acid sequence was 98% . The recombinant plasmid was constructed with the target gene and the expressing vector pGEX-4T-1 and then was transformed into E. coli BL21（DE3）by BamH and Sal I .The fusion protein was expressed under the IPTG inducing condition,and exhibited about 62 kD in size,very close to the predicted molecular weight of GSTMOMP, furthermore,the fusion protein was specifically recognized by antiserum which raised against the major outer membrane protein of AHML316. Considering all these together, it proved that the cloned gene represented the major outer membrane protein gene of AHML316, and the expressed gene products shared identical antigenicity with the natural main outer membrane protein,and also provided technical support for developing an advanced gene engineering vaccine against Aeromonas hydrophila.     

患腹水病牙鲆病原菌分离、鉴定及病原菌的特性

为确定引起河北北戴河地区养殖牙鲆患腹水病死亡的病原,本实验从患腹水病牙鲆体内分离到3株优势菌,对分离株进行生理生化鉴定和16S rRNA序列比对来确定分离株的生物学地位,进一步通过毒力基因(toxR、vhhA、vhhB)鉴定及组织病理学分析其病理特征,并通过人工回感实验分析分离株毒性。结果显示,通过生理生化实验及16S rRNA序列比对,确定此次从患病牙鲆中分离到的3株菌株均为哈维氏弧菌;经鉴定,3株分离株毒力基因(toxR、vhhA、vhhB)结果均为阳性,病理组织切片结果显示,该分离株对牙鲆多器官(肠、肾脏、脾脏和肝脏)均可造成不同程度的病理损伤,呈全身性感染;人工回感实验显示,菌株BDHYPFS-Y1G对牙鲆的半致死浓度为LD50=5.88×106 CFU/mL,低于自然状态毒性;药敏实验表明,3株分离株均对呋喃妥因高度敏感。本实验确认了此次牙鲆腹水病的病原菌,并初步研究了病原菌致病性以及药物敏感性,以期为牙鲆工厂化养殖疫病防控提供科学依据。     

水族箱气单胞菌的鉴定及致病特性分析

为了确定南京市某渔场发病鱼感染的病原,本研究采集患鱼脏器,采用平板培养、生化实验和特异性gyrB基因扩增测序等方法进行细菌的分离鉴定;利用PCR技术检测分离株毒力基因的分布,分析其生物学特性,并进一步通过动物实验确定菌株致病力.结果分离到1株水族箱气单胞菌,命名为LK-25.该菌株携带5种主要毒力基因:气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、细胞兴奋性肠毒素(alt)、温敏胞外蛋白酶(epr)和丝氨酸蛋白酶(ahp),其溶血性和溶蛋白能力较强,对斑马鱼的半数致死量为1.02×103 CFU/尾,确定为强毒株.进化树分析表明,水族箱气单胞菌与嗜水气单胞菌达卡亚种亲缘关系较近.本研究在国内首次报道发现水族箱气单胞菌,为进一步预防该菌所引起的相关疾病的发生和传播提供理论基础.     

美洲鳗鲡及其养殖水体分离耐药菌的多样性和耐药性分析

为了更有针对性地防控水产动物细菌性病害的发生和流行,本实验对美洲鳗鲡及其养殖水体耐药细菌的种属特征及耐药情况开展了相关研究。首先采集美洲鳗鲡不同部位(表皮、鳃、肠道)及其养殖水体的样品,经5种抗菌药物平板筛选耐药菌株,然后采用K-B纸片扩散法检测细菌对抗菌药物的耐药性,同时测定耐药菌株的16S rDNA序列,进而分析耐药菌的种属分布和多重耐药性。结果显示,经耐药平板筛选分离纯化得到108株细菌,分别属于气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、不动杆菌属等20个属;其中,93.5%的菌株对3种(含)以上的抗菌药物具有耐药性,86.1%的菌株对3类(含)以上的药物具有抗性。对阿莫西林的耐药率高达90.7%,对四环素、利福平以及磺胺类和酰胺醇类药物类的耐药率为60%~80%,对头孢噻肟、新霉素以及喹诺酮类的耐药性弱(低于20%)。美洲鳗鲡肠道(0.40)、表皮(0.41)、鳃部(0.42)及水样(0.47)菌群的多重耐药指数显示各生态样品耐药程度较为严重,尤以水样为最。各菌属中,柠檬酸杆菌属(0.58)和克雷伯菌属(0.61)的多重耐药指数最高,而不动杆菌属(0.21)则相对较低。美洲鳗鲡及养殖水体普遍存在多重耐药菌株,对此应引起足够的重视;水产动物及养殖环境耐药细菌对某些水产用药如诺氟沙星、新霉素等耐药率低,可将其做为水产动物细菌性疾病治疗的首选药物。