三明野生蕉β-1,3-葡聚糖酶Mugsp7基因克隆及其在低温处理下的表达分析

以三明野生蕉组培苗为材料,通过RT-PCR技术克隆获得β-1,3-葡聚糖酶基因Mugsp7（β-1,3-glucanase）的 cDNA 和 gDNA 序列,并对该基因进行生物信息学分析和不同低温下的实时荧光定量PCR表达分析,并进一步测定8 ℃处理1、2、3、4和5 d后三明野生蕉叶片β-1,3-葡聚糖酶活性。结果表明：Mugsp7的 gDNA 长 1132 bp,开放阅读框（ORF）长984 bp,具有一个148 bp的内含子,共编码 327 个氨基酸。cDNA、gDNA 的登录号分别为 KU363808和KU363809。生物信息学分析表明,Mugsp7 属于酸性、亲水、稳定性蛋白,不具有信号肽,与小果野蕉、大叶藻、玉米、大麦、水稻等位于同一分支,与小果野蕉亲缘关系较近分为一类。实时荧光定量PCR表明,不同低温处理和8 ℃低温不同时间处理下,Mugsp7 呈现不同表达模式,且三明野生蕉叶片β-1,3-葡聚糖酶活性的测定分析也进一步表明,Mugsp7 能进一步响应低温胁迫。因此,推测 Mugsp7 在三明野生蕉抗寒响应中发挥重要作用。     

胡椒PnCAD基因的克隆和表达分析

木质素在植物体中具有运输水分、支撑植株和加强植物体免受侵害等功能,是苯丙烷代谢途径的重要产物之一。其中肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）是该途径中重要的限速酶。本研究在胡椒转录组测序的基础上,用RACE法进行克隆,对PnCAD基因全长进行生物信息学分析,并对其蛋白进行理化性质、亚细胞定位和系统进化树等分析;最后运用实时荧光定量PCR进行分析。结果表明：克隆得到CAD基因的全长cDNA,长度为1364 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）为1071 bp,编码356个氨基酸,预测相对分子量为3.879 kDa,等电点为6.27,属于亲水性蛋白;含有3个N-糖基化特征序列和9个磷酸化位点,可能处于细胞质内。结构域分析发现,胡椒CAD蛋白含有NAD(P)结合位点、多个催化锌和结构锌结合位点。系统进化树分析表明,胡椒CAD与细辛CAD6亲缘关系最近,胡椒和细辛的同源性最高为76%,均隶属于比较原始的双子叶植物。通过荧光定量分析发现,黄花胡椒在辣椒疫霉菌侵染下表达量升高,在8 h达到最高值,约为对照的10倍;之后在24 h时出现小幅度升高,约为对照组的6倍,之后下降。‘热引1号’胡椒的表达量在侵染8 h时达到最低,之后缓慢上升。总体来说,所有时间下黄花胡椒基因表达量均高于‘热引1号’胡椒,且差异显著。本研究结果可为今后研究胡椒抗非生物胁迫功能提供参考,为PnCAD基因的功能研究提供理论依据。     

福州宦溪野生蕉（Musa spp.，AB group）2个PSAG成员的克隆及生物信息学分析

植物光系统Ⅰ反应中心亚基V (photosystem Ⅰ reaction center subunit V,简称PSAG或PS Ⅰ-G)是光合系统Ⅰ的主要组件.具有维持PSⅠ复合体稳定性的重要作用,并与抗盐密切相关.本研究以福州宦溪野生蕉(Musa spp.AB group)叶片为材料,采用同源克隆的方法,首次分离到PSAG基因的2个成员:PSAG1、PSAG2(GenBank登录号分别为JX317082、JX317083),分别为800、827 bp,分别编码150、160个氨基酸;PSAG1、PSAG2的基因组序列分析表明2个成员均没有内含子.生物信息学分析表明:PSAG1、PSAG2具有PSⅠ的X亚基超家族(photosystem Ⅰ reaction center subunitX psaK)保守结构域,是不具有信号肽的跨膜蛋白,具有亲水性:PSAG1、PSAG2均有4个位点发生磷酸化.宦溪野生蕉PSAG在进化过程中形成了特殊的结构特征,即PSAG1和PSAG2没有内含子,并且在不同物种间保守区具有高度的一致性,为保持PSAG功能的稳定性提供了重要保证.     

一种广东野生蕉的染色体分析

分析九龙山野生蕉(M.balbisiana)的染色体数目、核型及核型模式图。结果表明:其核型类型为"2A"型,染色体主要由中部着丝点染色体组成,核型公式为:K(2n)=22=18m+4sm(2SAT),几乎对称,为较原始类型。并结合核型数据讨论其分类地位。     

马银花愈伤组织RoWUS基因及其启动子的克隆与表达分析

WUSCHEL(WUS)基因是植物干细胞的标志基因。采用同源克隆法结合RACE技术从马银花愈伤组织中克隆得到Ro WUS c DNA全长序列,采用染色体步移法克隆得到该基因的启动子序列,登录号分别为KF365488、KF861578。马银花Ro WUS c DNA全长1 123 bp,编码302个氨基酸;DNA序列2 001 bp,包含2个内含子和3个外显子;启动子序列3 122 bp。生物信息学分析表明:Ro WUS亚细胞定位于细胞核,是不稳定的亲水蛋白,无信号肽,具有跨膜结构,包含homeodomain功能位点。系统进化树分析结果表明:Ro WUS单独形成一个分支,与葡萄、大豆和苜蓿的亲缘关系最近。对Ro WUS的启动子进行分析表明,该启动子除了含有丰富的TATA-box和CAAT-box等基本元件以外,还含有多个光响应元件、逆境胁迫响应元件、激素应答元件和其他功能元件。q PCR结果表明:Ro WUS基因在马银花愈伤组织不同生长时期中呈先上升后下降的趋势,在第5个继代周期时表达量最高。外源赤霉素和脱落酸浓度为15 mg/L时表达量最高,说明Ro WUS基因在该浓度时对赤霉素和脱落酸的响应最强。     

花生中UDP-glucosyltransferase基因的克隆及在非生物胁迫下的表达研究

通过RACE技术从花生叶片cDNA中克隆到了UDP-glucosyltransferase基因,命名为AhUGT83A1-like （Genbank注册号为KF411463）。该基因全长为1 530bp,ORF为1 380bp,编码460个氨基酸。序列比对与进化分析结果表明,该序列有保守的UDPGT结构域,并且与其它植物的UGT蛋白同源性较高。荧光定量PCR结果表明,AhUGT83A1-like基因在高盐和低温处理的花生根和叶片中均上调表达;在干旱处理时,根中表达也受到显著上调,但叶片中表达量则有明显下降。以上结果表明AhUGT83A1-like可能参与了花生对干旱、低温和高盐的抗性调控。ABA处理结果表明,AhUGT83A1-like在花生根中对ABA响应明显,但在叶片中对ABA没有明显响应,表明该基因在花生根中对非生物胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式发挥作用的。?     

龙眼DlICE1基因克隆及低温胁迫表达分析

本研究以龙眼胚性愈伤组织为材料,根据龙眼转录组数据库,采用RACE-PCR和RT-PCR技术获取龙眼DlICE1 cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析与低温胁迫下表达分析。结果表明,龙眼DlICE1 cDNA全长为2327 bp,其中开放式阅读框（ORF）序列长1614 bp,共编码537个氨基酸。生物信息学分析表明,龙眼DlICE1编码的蛋白质属于不稳定的弱酸性蛋白,不具有典型的信号肽,且不属于分泌蛋白;亚细胞定位表明其位于细胞核内,与甜橙的同源蛋白亲缘关系最近;实时荧光定量PCR表明,龙眼DlICE1能够有效响应低温胁迫,低温诱导其表达量提高。研究结果显示,龙眼DlICE1基因参与龙眼胚性愈伤组织抗寒过程。     

三明野生香蕉Ran家族基因DNA序列克隆与生物信息学分析

Ran是一类广泛存在于真核生物中的极为保守的小G蛋白。本研究从三明野生香蕉中分离得到15条Ran家族基因DNA序列,并对基因结构、序列特征和进化关系等进行分析。结果表明,三明野生香蕉Ran家族基因与小果野蕉Ran家族基因高度同源,且具有大量多态性位点。三明野生香蕉Ran蛋白与其他植物Ran蛋白高度同源,带有GTP水解结构域、RanGAP结合结构域和酸性尾巴等Ran蛋白的典型结构域,与拟南芥AtRan3亲缘关系最近。三明野生香蕉中存在大量的Ran家族基因,预示着Ran可能具有重要的作用。本研究结果可为研究三明野生香蕉Ran家族基因的生物学功能奠定基础。     

茄子冷诱导转录因子CBF的分离及分析

利用白菜CBF基因序列搜索茄子基因组DNA序列和茄子EST序列,然后参考这些序列设计开放型阅读框两端的特异引物,以茄子叶片cDNA为模板克隆获得了该基因的cDNA序列。经生物信息学分析证实该序列是CBF基因,命名为SmCBF（登录号：KY780486.1）。该基因编码211个氨基酸,包含AP2功能域和DNA结合位点,属于AP2超基因家族。用PlantCARE分析SmCBF基因启动子序列的顺式作用元件,发现了1个MYC识别位点和1个MYB结合位点,说明该基因受到MYC和MYB的调控。采用Real-time PCR研究了SmCBF基因在低温诱导茄子中的表达情况,结果显示该基因随着低温处理时间延长表达量逐渐升高,在6 h达到最高值,说明低温诱导该基因表达。     

福州旗山野生蕉(Musa spp.,AB Group)试管苗Mn-SOD基因克隆及生物信息学分析

以旗山野生蕉(Musa spp.,AB group)试管苗幼嫩叶片为材料,利用RT-PCR结合RACE技术克隆获得野生蕉试管苗Mn-SOD基因c DNA序列。结果表明:旗山野生蕉Mn-SOD的c DNA全长序列共831 bp,其中5′UTR为137 bp,3′UTR为151 bp,3′端含有17个poly(A)尾。开放阅读框(ORF)共有543个碱基组成,编码181个氨基酸。蛋白理化性质预测结果显示:Mn-SOD蛋白分子量为20 108.8 u,等电点7.92,属于碱性蛋白。     

大豆GmNCED1基因的克隆及表达模式分析

本研究以抗逆性强的大豆旱碱一号为材料,首次从中克隆了编码9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）的GmNCED1基因全长cDNA片段,该基因编码区含有1 836个核苷酸,编码611个氨基酸。通过同源性比对分析发现GmNCED1与花生、菜豆等双子叶豆科植物NCED的同源性高达84%以上。同时,利用荧光定量PCR分析发现高盐、低温、干旱、外源ABA以及NAA处理均可以诱导该基因在大豆叶片及根中表达。本研究初步揭示GmNCED1基因在植物逆境胁迫中的作用,为基因工程育种提供优质的候选基因。     

福州宦溪野生蕉（Musa spp.，AB group）CHUP1基因克隆及其生物信息学分析

CHUP1(chloroplast unusual positioning 1)参与了叶绿体移动信号转导过程,对植物避免光伤害及提高光合效率方面具有重要作用,并且与植物抗寒性有密切关系.本研究以福州宦溪野生蕉(Musa spp.AB group)叶片为材料,采用同源克隆的方法,分离出CHUP1基因cDNA和DNA序列,GenBank登录号分别为JX123753、JX880084,命名为Mu-CHUP1.Mu-CHUP1 cDNA全长3232 bp,ORF 2931 bp,编码976个氨基酸.福州宦溪野生蕉Mu-CHUP1 cDNA序列与小果野蕉(M.acuminata,AA Group)全基因组测序中的CHUP1 cDNA序列的相似性为84.71％;福州宦溪野生蕉Mu-CHUP10RF的DNA序列含8个内含子、9个外显子,而小果野蕉全基因组测序中的CHUP1基因组DNA序列则有11个内含子、12个外显子,两者相差较大.生物信息学预测分析表明,Mu-CHUP1磷酸化位点多达62个,并且含有3个保守结构域,可能与其行使多样性的功能有关.     

野生蕉不同颜色果皮miRNA表达谱及靶基因分析

本文以闽侯野生蕉（阿宽蕉,Musa itinerans）果皮为研究对象,对不同颜色（绿色和紫色）果皮进行转录组测序,旨在探讨miRNA在野生蕉不同颜色果皮转录后水平中发挥的作用及其可能参与的调控通路,为芭蕉属植物果皮颜色分子调控机制的研究奠定基础。取野生蕉同一果梳上不同颜色（紫色和绿色）的果皮为材料,利用高通量测序和生物信息学分析,获得野生蕉不同颜色果皮组织的miRNA表达谱,筛选不同颜色果皮差异表达的miRNA并预测相关靶基因,通过靶基因分析,获得与调控野生蕉果皮颜色可能相关的信号通路。结果从不同颜色野生蕉果皮中共获得34.11兆条原始读长,经过滤后得到28.73兆条clean reads,从中鉴定出132个已知的miRNA序列和122个新的miRNA;筛选出36个差异表达miRNA,其中10个在紫色果皮中上调表达,26个在绿色果皮中上调表达。表达量最高的miRNA为mit-miR167,而差异倍数最大的为mit-miR172a-3p-2。差异表达miRNA共预测出1164个靶基因可能参与野生蕉果皮颜色调控,并主要在DNA结合、离子跨膜运输活动等功能和植物病原互作等途径富集。其中,有7个基因直接与苯丙烷生物合成途径相关,主要受到miR156和miR482家族的调控。同时,选取6个差异表达miRNA进行定量验证,结果表明,3个miRNA在绿色果皮中上调表达,3个miRNA在紫色果皮中上调表达,定量结果与高通量测序的结果一致。本文通过高通量测序获得了野生蕉果皮miRNA表达谱,并通过生物信息学分析得到可能和调控野生蕉果皮颜色性状相关的miRNA和代谢通路。综上所述,野生蕉果皮颜色可能受到多种miRNA的调控,并涉及多个代谢通路,这有助于进一步了解果皮花青素转录后水平的调控过程,并对进一步的功能验证奠定基础。     

龙眼GPX基因的克隆、原核表达及其在体胚发生过程中的表达分析

采用RT-PCR 与RACE相结合的方法,从龙眼胚性愈伤组织中克隆了长947 bp含有完整开放阅读框的龙眼DlGPX cDNA序列（GenBank登录号为EU364813）和长度为1 736 bp的DNA序列（GenBank登录号为EU680970）。其编码1个含有168个氨基酸的蛋白质。DlGPX基因中含有5个内含子,均符合真核生物内含子通用的GT-AG 法则。生物信息学分析显示：该蛋白为亲水的酸性蛋白质,定位于叶绿体;与其他植物的GPX有较高的同源性。将该基因构建成原核表达载体,经IPTG诱导表达了１个分子量约为23 ku的蛋白。利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术研究该基因在龙眼体胚发生发育过程中的表达情况,结果显示,从松散型胚性愈伤组织到不完全胚性紧实球形结构阶段,DlGPX mRNA的转录水平逐渐升高,在胚性紧实球形结构阶段降到最低水平,子叶形胚阶段又上升到与不完全胚性紧实球形结构阶段相当的水平。     

中国水仙NtMYB1基因的克隆及表达分析

为研究调控花青素合成机制,利用RT-PCR和RACE技术从中国水仙‘金盏银台’（Narcissus tazetta var. chinensis‘Jinzhan Yintai’.）的花瓣和副冠中克隆得到一个MYB基因的cDNA序列,命名为NtMYB1,在GeneBank上登录号为KC763973。序列分析表明,NtMYB1基因全长842 bp,其中开放阅读框长681 bp,编码226个氨基酸,推测的蛋白分子量为25.2 ku,理论等电点为7.94。NtMYB1具有明显的R2R3-MYB结构域,且在R3结构域的下游含有一个相对保守的PDLNLDLSIG氨基酸基序。同源性分析表明,其编码的氨基酸序列与陆地棉、甜樱桃的MYB蛋白相似性分别达到65％和63％。利用实时荧光定量PCR技术检测NtMYB1基因在中国水仙花不同发育时期和部位的表达水平,分析结果表明,NMYB1基因在中国水仙成花不同时期均有表达,但表达量具有明显差异,其中NtMYB1基因在花蕾期的相对表达量约为花苞期的40倍,且其表达量在花瓣要高于副冠。推测NtMYB1可能参与调控花青素合成基因的转录沉默。     

甘蔗MYB转录因子基因ScMYB52-1的克隆及表达特性分析

MYB转录因子家族成员广泛参与植物的各种生物学过程,在调控植物适应非生物逆境过程中起关键作用。为分离甘蔗（Saccharum spp.）逆境响应MYB基因并研究其功能,本文应用3°RACE的方法,从甘蔗品种ROC22中克隆到一个R2R3-MYB转录因子基因,命名为ScMYB52-1。生物信息学分析表明,该基因cDNA序列长度为1072 bp,开放阅读框（ORF）长度为696 bp,5°非翻译区长54 bp,3°非翻译区长322 bp。该ORF编码231个氨基酸,推导蛋白的分子量为26.65 kDa,含有2个串联的MYB结构域。ScMYB52-1推导蛋白与模式植物拟南芥中的MYB家族蛋白的进化树聚类分析结果表明,ScMYB52-1蛋白与AtMYB52和AtMYB54的亲缘关系较近;进一步的多序列比对分析结果表明,上述三者蛋白质N端的MYB结构域序列高度一致,且三者的预测蛋白质三级结构类似,表明它们可能具有类似的功能。实时荧光定量PCR结果显示,ScMYB52-1在甘蔗组培苗的根中对PEG处理总体上不敏感,在叶中仅在3 h时短暂上调;ScMYB52-1在叶中受外源ABA和NaCl胁迫的诱导,在处理0.5 h均迅速上调表达,表达量分别为对照的3.35倍和2.75倍,并在处理期维持高于对照的水平;在根中受外源ABA和NaCl胁迫的抑制,在处理0.5 h时就开始下调表达,在处理24 h时表达量分别下调为对照的12%和40%,并在处理周期内总体上维持低于对照的水平。亚细胞定位分析表明,ScMYB52-1-GFP重组蛋白定位在烟草叶肉细胞的细胞核中。酵母双杂交自激活活性鉴定结果表明,ScMYB52-1蛋白无自激活活性。以上结果表明ScMYB52-1参与了甘蔗对高盐胁迫的应答,并可能受ABA信号通路的调控,在叶和根中存在差异的调控机制。本研究结果为进一步理解该基因在甘蔗非生物逆境适应过程中的功能及分子调控机制提供了初步的信息。     

花生转录因子LEC1的表达特性分析

LEC1是调控植物胚形成和发育的重要转录因子.本研究根据已获得的花生AhLEC1基因序列,利用原核表达分析和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术初步验证其在花生中的生物学功能.结果表明:①原核表达分析显示,获得了分子量为25 kD左右的目的蛋白条带,与预期大小一致.②组织表达分析显示,AhLEC1基因在花生的花及果...     

龙眼果肉自溶相关基因DlMC4的克隆和表达分析

果肉自溶是影响龙眼采后果实贮运、货架寿命和贮藏品质的重要因素。本研究通过同源序列比对及PCR技术在龙眼果肉中克隆获得与龙眼自溶相关基因cDNA序列,命名为DlMC4。同源比对及系统进化树分析结果表明,DlMC4与荔枝LcMC氨基酸序列的相似性最高。定量结果表明:在采后常温贮藏期间,果肉自溶指数随DlMC4基因表达量的上升逐步升高,且DlMC4基因在自溶指数较高的‘东壁’果肉中表达量高于自溶指数较低的‘石硖’果肉。果肉中Caspase-4酶活性的分析结果表明,2个品种的DlMC4基因表达与其酶活性和果肉自溶指数呈显著正相关。据此推测,采后贮藏后期果肉中DlMC4基因的上调表达可能对其果肉自溶起促进作用。     

路易斯安那鸢尾LiNramp2基因克隆与定量表达分析

利用RACE技术克隆了路易斯安那鸢尾LiNramp2基因全长cDNA序列,其大小为1 786 bp,预测编码519个氨基酸,蛋白质具有11次跨膜结构域,与其他Nramp蛋白同源性达80%以上,说明LiNramp2同其他同源基因保守性很高。定量表达结果显示,LiNramp2在路易斯安那鸢尾叶片和雄蕊中表达量较高,在雌蕊中表达量最低,根和茎表达量差别不大。随着铅处理时间增加,LiNramp2基因在根系表现缓慢下降,在叶片中表现先升高后下降的趋势,但差异不显著。     

甘蔗二氨基庚二酸异构酶基因的克隆与表达分析

以水稻ABA99594序列为探针, 使用电子克隆技术, 获得甘蔗二氨基庚二酸异构酶基因（Diaminopimelate epimerase, DAPE）的1条cDNA全长序列,命名为ScDAPE。经RT-PCR扩增和序列分析验证后, 该基因序列与电子克隆结果一致, 基因全长1 168 bp, 包含1个816 bp的开放阅读框, 编码271个氨基酸残基, 生物信息学分析预测该基因编码蛋白定位于内质网膜, 为可溶性酸性蛋白, 无信号肽, 二级结构元件多为无规卷曲, 含有2个保守功能域, 主要功能为氨基酸合成。电子表达分析结果显示, 该基因在甘蔗侧芽、 花序、 叶片和顶端分生组织中均有表达, 花序中的表达量最高, 且该基因的表达受温度调控。荧光定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗根、 蔗髓、 蔗皮、 侧芽、 叶片、 叶鞘中均有表达, 且在根中的表达量最高。此外, 该基因的表达受水杨酸（salicylic acid, SA）、 脱落酸（abscisic acid, ABA）、 茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）、 模拟干旱（PEG）、 高盐（NaCl）和氯化镉（cadmium chloride, CdCl2）的胁迫诱导, 其中受水杨酸胁迫后表达量最高, 约为对照组的12.4倍, 其次为聚乙二醇, 约为对照组的2.72倍, 推测该基因的表达与甘蔗抗病性和抗渗透胁迫有关。研究结果为甘蔗中不同DAPE基因的克隆和功能验证以及甘蔗ScDAPE基因在甘蔗基因工程中的应用奠定了一定的基础。