文心兰ACC氧化酶基因OnACO1克隆与表达分析

以文心兰切花品种"黄金2号"(Oncidium Gower Ramsey‘Gold2’)为材料,通过RT-PCR和RACE技术,从文心兰的花中分离得到了1个ACO基因成员的cDNA,命名为OnACO1(GeneBank登录号为JQ822088)。该基因全长为1 424 bp,包括972 bp的ORF,172 bp的5′-UTR和280 bp的3′-UTR,编码324个氨基酸,其氨基酸序列与石斛兰等兰科植物的ACO氨基酸序列有较高的同源性。构建原核表达载体pGEX-OnACO1,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,在SDS-PAGE中显示出了特异性表达条带,与预测的蛋白大小一致。荧光定量PCR分析表明OnACO1基因的表达具有组织特异性,主要在蕊柱中表达,并且乙烯对该基因的表达有上调作用。     

大豆胞囊线虫热激蛋白基因Hsp70的克隆与原核表达

采用RT-PCR技术结合基因组步移技术,从大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)中克隆了热激蛋白70基因(Hsp70)的全长cDNA序列(Hg-Hsp-70),全长1 953 bp,GenBank登录号为FJ816100.1。碱基序列分析结果表明,该序列含有9个外显子与8个内含子,与其它线虫具有较高的同源性。氨基酸序列分析表明,该基因编码650个氨基酸,相对分子量为70.7 kD,具有2个Hsp70基因家族的签名序列,与其它线虫的该基因氨基酸序列具有很高的同源性。构建了原核表达载体Hsp70pEASY-E1,采用IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果表明,当IPTG终浓度为0.2～1.2 mmol.L-1时均能显著诱导表达;以终浓度0.8 mmol.L-1的IPTG诱导5 h蛋白表达量达到最大值。     

枇杷试管苗2个CAT基因成员的克隆及表达分析

以早钟6号枇杷试管苗叶片为试验材料,采用同源克隆方法从叶片mRNA中分离得到CAT基因的2个成员Ej-CAT1和Ej-CAT2,Ej-CAT1 cDNA序列全长1 738 bp,包括1 479 bp ORF和257 bp 3′-UTR;Ej-CAT2序列全长1 742 bp,包含1 479 bp ORF及261 bp 3′-UTR。2个CAT基因成员的核苷酸序列相似性为98.04%,其开放阅读框推导的氨基酸序列具有97.32%的相似性。生物信息学分析结果表明:2个蛋白均编码492个氨基酸,是亲水蛋白,不含信号肽,不存在螺旋卷曲结构,是非跨膜蛋白,亚细胞定位于过氧化物酶体;Ej-CAT1及Ej-CAT2蛋白分别有18、17个功能位点,22、19个磷酸化位点。CAT基因在枇杷试管苗离体保存过程中不同时期具有不同的表达量,整体趋势呈"W"形状,在离体保存1个月时表达量最高,保存7个月时表达量最低。CAT表达量变化可能跟枇杷试管苗的生长发育模式有关。     

杉木天冬酰胺合成酶基因的克隆与表达分析

为了解天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,AS)基因在杉木生长发育及逆境中的作用机制,以杉木种子及其萌发的幼苗为材料,利用RT-PCR和RACE技术获得杉木ASN基因的c DNA序列(Cl ASN1)和基因组序列,并对该基因在不同生长发育阶段和逆境胁迫下的表达模式和Asn含量变化进行分析。结果表明:Cl ASN1基因c DNA全长1 609 bp,编码443个氨基酸;生物信息学分析结果表明,该基因为含跨膜结构的不稳定亲水蛋白,无信号肽,定位于过氧化物酶体,具有多样的磷酸化位点;进化树分析结果显示,该基因与北美云杉和樟子松亲缘关系最近;Cl ASN1基因组序列全长3 210 bp,含10个外显子和9个内含子;q PCR结果表明,该基因从浸种24 h到幼苗期表达量呈上升趋势,且在干旱胁迫、铝胁迫和光暗处理下均可诱导表达;除铝胁迫24 h和持续光照24 h外,Cl ASN1表达模式与Asn含量的变化趋势相同,此结果表明Cl ASN1基因通过催化Asn的合成参与杉木幼苗的生长发育及胁迫响应。      

2个番木瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR扩增获得了2个番木瓜果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因cDNA和DNA全长序列,将其命名为CpPGIP1和CpPGIP2.CpPGIP1基因全长为984 bp,编码325个氨基酸；CpPGIP2基因全长为1 025 bp,编码326个氨基酸.2基因均没有内含子序列,核苷酸序列有66.54％的相...     

龙眼古树胚性愈伤组织Dlwrky44基因的克隆及分析

参考龙眼转录组数据库信息,以莆田宝庵寺的龙眼古树“宝树”幼胚诱导的胚性愈伤组织作为试验材料,获得了龙眼古树wrky44基因的全长序列,命名为Dlwrky44,登录号为JF709012,共2313 bp,其中3′UTR458 bp,poly A尾长25 bp,5′UTR 735 bp,并包含1个1119 bp的开放阅读框,编码373个氨基酸.根据推导的氨基酸序列进行生物信息学分析结果表明:D1WRKY44蛋白是不稳定、亲水蛋白;无信号肽和跨膜结构,亚细胞定位于细胞核中;具有2个WRKY结构域,并具有核定位信号,在wrky家族中属第1类.系统进化树分析结果表明:龙眼古树DlWRKY44蛋白与柽柳亲缘关系最近.对龙眼古树EC Dlwrky44基因在不同低温胁迫条件下(0、5、10、15、20、25℃)处理12h的表达进行了分析,结果表明:Dlwrky44基因的表达量随着温度的逐渐降低,表达量逐渐升高,当温度升到15℃时,表达量达到最高.     

茶树牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CsGGDPS的克隆及表达分析

以铁观音芽叶为材料,验证从茶树转录组数据库中筛选到的1条牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGDPS)的编码全长序列c DNA。该c DNA全长1 661 bp,含有1个1 137 bp完整的开放阅读框,命名为Cs GGDPS。该基因编码378个氨基酸,氨基酸序列具有类异戊二烯合成酶家族的5个保守域和2个特征功能域;序列分析显示,该c DNA与其他植物GGDPS高度保守,与三七(Panax notoginseng)的亲缘关系最近。Cs GGDPS属于不稳定、亲水蛋白,可能定位到叶绿体中,不存在跨膜结构,无信号肽,发生磷酸化的位点可能有20个;二级结构主要由α-螺旋构成,三级结构与拟南芥GGPPS11匹配度最高。实时荧光定量PCR结果表明,在茶树发育过程和不同叶位Cs GGDPS的表达量随芽叶成熟度的增加呈上升趋势,随着做青过程的进行,Cs GGDPS的表达量逐渐升高;Cs GGDPS在父本黄旦、母本铁观音和子一代金观音中均有表达,但表达量存在差异。     

玉米热激蛋白ZmHSP70-12基因的克隆及表达分析

热激蛋白70(HSP70)是原核和真核细胞中普遍存在的一种高度保守的分子伴侣。从玉米中克隆1个HSP70家族成员。该基因cDNA序列全长为1 992 bp,开放阅读框为2 352 bp,编码663个氨基酸,蛋白质分子量约75.0 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明,该基因编码蛋白含ATPase位点和HSP70保守结构域,与拟南芥AtHSP70-12序列高度相似,命名为ZmHSP70-12。蛋白亚细胞定位显示,ZmHSP70-12蛋白在内质网中表达。实时荧光定量PCR分析表明,ZmHSP70-12对非生物胁迫高温、干旱均具有明显的应答反应,推测ZmHSP70-12是玉米中与胁迫逆境相关的基因。     

花生CAX相互作用蛋白4(CXIP4)基因克隆表达分析及载体构建

钙离子是细胞信号传导中重要的第二信使。CAX interacting protein(CXIP)是一类能够激活Cation exchanger(CAX)的钙离子转运活性蛋白,在离子转运体系中起重要作用。本研究利用RACE方法获得花生CAX相互作用蛋白4(CXIP4)基因的cDNA和DNA全长序列。该基因cDNA序列的全长包括966bp的开放阅读框,编码321个氨基酸。DNA全长为966bp,不含有内含子序列。推测的蛋白质分子量为36706.24Da,等电点为9.62。使用荧光定量技术(qRT-PCR)分析了该基因在花生品种日花1号植株中的组织表达和青枯菌胁迫条件下的表达变化规律,并构建了该基因的过表达载体、反义表达载体以及原核表达载体,为进一步研究花生中该基因的功能及其在花生抗青枯病中的作用奠定基础。     

番木瓜酪氨酸氨基转移酶基因CpTAT的分离与分析

番木瓜酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)是维生素E合成途径中的一个关键酶。在已有番木瓜果实成熟差异基因片段序列的基础上,采用RACE技术克隆了TAT基因的全长c DNA序列,命名为Cp TAT。该基因全长包含5′非编码区98 bp,3′非编码区232 bp,开放性阅读框1 266 bp,编码421个氨基酸。序列分析表明,该基因为谷草转氨酶超家族成员,催化活性位点为第253位的赖氨酸,编码蛋白与毛果杨、野草莓、桃、拟南芥和水稻的TAT蛋白同源性分别为83.69%、81.09%、80.76%、78.87%、54.67%。荧光定量分析表明,Cp TAT基因在根中的表达量最高,在茎和果实中的表达较低,在叶中的表达量最低。与对照相比,外源乙烯处理能诱导番木瓜果实中Cp TAT基因表达量升高,而1-MCP处理则抑制了该基因表达,在果实衰老期表达量升高,该基因可能在番木瓜果实成熟衰老中起作用。