细菌纤维素合成菌纳塔葡糖酸醋杆菌遗传操作方法的建立

[目的]建立纳塔葡糖酸醋杆菌遗传操作系统,为采用基因工程方法改造该类菌株,提高纤维素产量,提升纤维素品质提供参考依据。[方法]通过优化培养基确定菌株电转化感受态制备条件,采用质粒或者线性化片段在不同电压下进行转化,优化最佳转化条件。[结果]采用添加了1%纤维素酶的C2培养基进行1次摇瓶转接,可有效制备纳塔葡糖酸醋杆菌电转化感受态;采用携带同源臂及Kan抗性基因的环状质粒或者线性化片段均实现了对纳塔葡糖酸醋杆菌葡萄糖脱氢酶基因(GDH)的同源双交换基因敲除;GDH基因的敲除降低了工程菌株发酵产纤维素膜过程的葡萄糖酸产生,提高了细菌纤维素的最终产量及品质。[结论]成功建立了纳塔葡糖酸醋杆菌遗传转化方法和基因敲除方法。     

山西老陈醋优势醋酸菌的分离鉴定

试验以山西老陈醋醋厂发酵正常的醋醅为试验样品,对其中的醋酸菌采用了变色圈法进行分离,再经过初筛、复筛,根据产酸量高低得到了5株优势醋酸菌(AbT,Af10,Af5,Au13,Af20)。通过对这5株优势菌株的个体形态、培养特征、生理生化特性的研究,将其鉴定为醋酸杆菌属中的巴氏醋杆菌(Ab7)、醋化醋杆菌(Af10)、液化醋杆菌(Af5)、汉氏醋杆菌(Au13)和恶臭醋杆菌(Af20)。通过本试验的研究可为山西老陈醋的进一步发展奠定菌种基础。     

两种纯化苏云金杆菌HD-73毒素蛋白方法的比较研究

以苏云金杆菌HD 73伴胞晶体为活性蛋白,经胰蛋白酶酶解后分别用阴离子交换柱分离纯化法和等电点纯化法进行纯化,纯化后得到的样品进行SDS-PAGE分析,结果表明,两种分离纯化都获得67kDa的毒素蛋白,但是离子交换柱纯化法样品消耗量大,得率低;而等电点沉淀法样品消耗少,得率高。     

凉州熏醋中高产乙偶姻菌株的分离筛选及发酵特性初探

本试验以凉州熏醋酿造醋醅为材料,以经典的微生物分离纯化技术,从醋醅材料中分离筛选芽孢杆菌和酵母菌。通过应用Voges-Proskauer(V-P)反应和分光光度法对筛出菌株发酵产乙偶姻能力进行考察以得到高产乙偶姻的功能菌株,结合菌落形态及生理生化定性试验确定菌株类别。对高产菌株进行发酵动态跟踪,以获得其发酵特性。结果表明,从醋醅中共筛选获得了5株芽孢杆菌和8株酵母菌,其中芽孢杆菌和酵母各有5株和7株可以发酵产乙偶姻,以酵母J2产量最高,为8.55 g/L。经鉴定得知该菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。动态跟踪该菌株的发酵特性,其在发酵40 h时乙偶姻产量最高。     

一种纯化苏云金杆菌Cry1Ac蛋白的方法

Cry蛋白的纯化技术在很大程度上制约了其结构与功能的研究.为此,提出了一种以等电点沉淀方法纯化苏云金杆菌Cry1Ac的原毒素,用分子筛层析纯化其活性毒素的方法.结果表明:Cry1Ac的原毒素在pH值5.05条件下沉淀纯化效果好;以纯化的原毒素激活进行分子筛层析,收集其最大峰便可获得较高浓度的活性毒素;该方法不仅纯化效果...     

菌糠饲料的发酵菌株筛选、营养成分及抑菌性能分析

为了探讨发酵菌糠在饲料中的应用价值,试验选取6株乳酸菌菌株(嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌)进行了菌糠的发酵试验,测定了发酵菌糠的总酸、酸溶蛋白含量、乳酸菌总数及感官品质,并分析了菌糠发酵前后营养成分和抑菌性能的变化.结果表明:6株乳酸菌中,植物乳杆菌的发酵效果最佳,总酸...     

牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体的制备

为了评价牛坏死杆菌外膜蛋白43K OMP的免疫原性,试验利用大肠杆菌原核表达系统对牛坏死杆菌43K OMP基因进行表达,纯化目的蛋白免疫兔,制备牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体,并对其进行鉴定。对基因序列进行预测分析后,针对大肠杆菌稀有密码子优化合成该基因序列,克隆至pET-32a原核表达载体上,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达及镍柱进行纯化,获得重组蛋白大小约为59 ku。重组蛋白经Western blotting鉴定后免疫兔,制备多克隆抗体。Western blot检测牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体与43K OMP重组蛋白具有很好的免疫原性。研究成功制备了牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体,为以43K OMP蛋白为基础的疫苗研究奠定基础。     

酸奶中葡糖杆菌的快速分子检测

葡糖杆菌是污染酸奶的常见菌种,随着人们健康意识的提高,酸奶的安全问题越来越受到人们的关注和重视。本文通过聚合酶链式反应验证引物的可行性及灵敏度后,使用凝胶成像分析系统进行图像分析,以快速检测酸奶中的葡糖杆菌。     

用发酵酸法提取营养酸模叶蛋白的工艺

分别用德氏乳杆菌发酵淀粉糖化液和泡菜水作为母酸,对营养酸模榨汁液进行发酵制备发酵酸,用来沉淀叶蛋白。用由德氏乳杆菌制成的发酵酸沉淀叶蛋白,其粗蛋白的质量分数为59．22％～61．25％,提取率为35．3％～43．5％;用由泡菜水制成的发酵酸沉淀叶蛋白,其粗蛋白的质量分数为56．32％～59．48％,提取率为40．00％～44．97％。     

侧孢短芽孢杆菌B8抑菌物质的理化性质及其分离纯化

从烟草根际土壤中分离到1株生防细菌侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)B8,为了将B8应用于植物病害生物防治,对菌株B8产生的抑菌物质粗提物理化性质进行研究,并采用薄层层析、Pharmadex LH-20柱层析和高效液相色谱对抑菌物质进行分离纯化。试验结果表明:侧孢短芽孢杆菌B8抑菌物质粗提物具有较好的热稳定性,可耐受100℃的高温;其p H值适应范围较宽,在p H值4~10时都有较好的活性,在中性条件下活性最强;对紫外光和日光灯照射不敏感,可长时间保存;侧孢短芽孢杆菌B8产生的抑菌物质为蛋白类,经SDS-PAGE电泳确定蛋白分子量约为11.2k Da;质谱分析结果表明纯化蛋白在NCBI蛋白数据库中没有明确的匹配结果,推测此抑菌蛋白可能是在NCBI蛋白数据库中没有登录的1种新物质。     

橡胶HbJAZ1基因的原核表达与纯化分析

为了鉴定巴西橡胶树中存在与JAZ蛋白特异性结合的蛋白,利用pGEX-6p-1载体构建橡胶JAZ（HbJAZ1）与GST（Glutathione S-transferase）融合表达载体,并成功转化大肠杆菌进行原核表达,同时利用谷胱甘肽-琼脂糖填料成功纯化gcHbJAZ1-GST融合表达蛋白。在纯化实验中,发现HbJAZ1融合表达蛋白在大肠杆菌原核表达中是难溶蛋白,大多存在于裂解菌液的沉淀物中。     

白桦悬浮细胞蛋白质组学分析体系的构建

[目的]建立一套适合白桦悬浮细胞蛋白质组学分析的双向电泳体系.[方法]以白桦悬浮细胞为研究对象,采用改进的三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法提取悬浮细胞蛋白,使用17 cm、pH 4.0～7.0的IPG胶条,9.0μg/μl的上样量进行双向电泳.[结果]可得到蛋白质点数目多、分辨率高和重复性好的双向电泳图谱.PDQuest软件分析考马斯亮蓝染色后的凝胶,共得到约1 000个蛋白点.从这些蛋白点中随机选取3个蛋白点经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析后,搜索NCBInr数据库对蛋白进行鉴定.结果显示,这3个蛋白分别为S-腺苷甲硫氨酸合成酶、transposase for IS1330和PadR家族转录调控蛋白.[结论]为利用蛋白组学分析诱导子提高次生代谢物的积累机制奠定基础.     

鸡卵泡膜细胞中膜联蛋白A2互作细胞蛋白的筛选及其功能分析

【目的】从鸡卵泡膜细胞蛋白中筛选和鉴定与膜联蛋白A2（ANXA2）相互作用的细胞蛋白并进行功能分析,为深入研究ANXA2调控鸡卵泡发育的作用机制提供理论依据。【方法】制备开产后30周龄贵州黄鸡的卵泡膜细胞,提取卵泡膜总蛋白后利用His Pull-Down联合质谱技术（LC-MS/MS）从卵泡膜细胞中筛选出与鸡ANXA2互作的细胞蛋白,然后通过GO数据库和KEEG数据库分别进行GO功能富集分析及KEEG信号通路注释分析,并利用STRING Version 11.0绘制蛋白互作网络图。【结果】通过His Pull-Down联合LC-MS/MS共鉴定获得41个鸡ANXA2互作细胞蛋白,GO功能富集分析发现这些互作细胞蛋白在分子功能、生物学进程和细胞组成均发挥作用。其中,在分子功能方面主要涉及蛋白结合（占58.06%）、催化活性（占19.35%）、核糖体结构（占16.13%）及细胞骨架结构组成（占6.45%）,在生物学进程方面主要参与细胞骨架（占19.35%）、刺激反应（占19.35%）、翻译（占16.13%）、代谢过程（占12.90%）、细胞迁移（占12.90%）、蛋白折叠（占9.68%）和蛋白运输（占9.68%）,而细胞组分显示以定位于细胞膜的蛋白为主（占32.26%）。鸡ANXA2蛋白互作细胞蛋白参与的KEEG信号通路主要有应激反应、代谢、翻译、信号转导、免疫系统和蛋白定位等。鸡ANXA2互作细胞蛋白互作网络可分为3条,即CNN2-FN1-MYH9-MYH10-ACTN1-CSRP1、ANXA1-ANXA2-ENO1-PRDX4-GPI-ATP5B-PRDX3-HSPA8-TUBB2A和CCT7-CCT4-GNB2L1-ATP5A1-RPS3-RPS3A-RPL23A-RPL22-RPS7;互作细胞蛋白间存在复杂的互作关系,其中又以膜联蛋白A1（ANXA1）与烯醇化酶-1（ENO1）及ANXA2的互作关系最明显。【结论】鸡ANXA2互作细胞蛋白主要参与细胞骨架形成、应对刺激和翻译等生物学过程,涉及应激反应、代谢、翻译、信号转导、免疫及蛋白定位等信号通路。其中,PRDX3、PRDX4、MYH9和TCSC可能通过与ANXA2蛋白相互作用而参与鸡卵巢相关疾病的发生,而ANXA1与ANXA2相互作用可能在鸡卵泡的发育及排卵过程中发挥重要调节作用。     

用康奈尔体系评定饲料营养价值

选取反刍动物常用饲料样品6种,应用康奈尔净碳水化合物和蛋白质体系(CNCPS)提出的碳水化合物和蛋白质分类方法,分别测定了饲料的粗蛋白(CP)、非蛋白氮(NPN)、可溶性粗蛋白(SCP)、酸性洗涤不溶蛋白(ADIP)、中性洗涤不溶蛋白(NDIP)及酸性洗涤纤维(ADF)、中性洗涤纤维(NDF)、木质素和淀粉。并根据康奈尔体系提出的计算方法计算了饲料粗蛋白中的非蛋白氮(PA)、快速降解蛋白质(PB1)、结合蛋白质(PC)、中度降解蛋白质(PB2)、慢速降解蛋白质(PB3)和碳水化合物中的不可利用纤维(CC)、可利用纤维(CB2)、淀粉、果胶(CB1)和糖类(CA)。比较了CNCPS评定饲料营养价值较常规方法的优点,建议建立常规饲料CNCPS评定的数据库,广泛采用CNCPS来评定饲料营养价值。     

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明VP2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。结果表明,重组质粒E.coliBL21（DE3）在35℃,1.0 mmol/mL IPTG诱导6 h时条件下蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳检测的纯化目的蛋白约为90 kDa,与预计大小一致。VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

龙眼多糖清除自由基活性的研究

从清除1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（O2^-·）三个方面,探讨纯化方法对龙眼多糖清除自由基活性的影响．以抗坏血酸为对照,利用分光光度法分别测定龙眼粗多糖（CLPS）、Sevag法脱蛋白制得的龙眼粗多糖半纯品（SLPS）、TEA法脱蛋白制得的龙眼粗多糖半纯品（TLPS）、经DEAE-Cellulose52离子交换柱层析纯化得到的龙眼多糖纯品（LPS-2）对DPPH·OH和O2^-·的清除能力．结果显示：多糖纯度越高,清除DPPH·活性也越强,其清除活性由强到弱依次为：LPS-2〉TLPS〉SLPS〉ELPS;对于·OH和O2^-·,SLPS清除活性最强,ITS-2清除活性最弱,说明杂蛋白质抑制了多糖清除·OH、O2^-·活性,而糖蛋白中的蛋白质则起到促进作用．     

水稻条纹病毒编码的NS2蛋白的亚细胞定位分析

通过RT-PCR克隆获得水稻条纹病毒（RSV）编码的蛋白NS2和拟南芥柯浩体蛋白Atcoilin的cDNA,将两者分别与表达载体pEarley102（带青色荧光蛋白,CFP）和pEarley101（带黄色荧光蛋白,YFP）同源重组.将构建好的重组载体分别转化到农杆菌EHA105中,通过农杆菌接种法将两者共同注射到本氏烟叶片表皮细胞中进行表达.在共聚焦显微镜下观察,NS2-CFP与Atcoilin-YFP能重叠在一起,表明RSV NS2定位于柯浩体.     

茶多糖的提取与分离纯化技术研究新进展

茶多糖是一类相对分子质量较大的,具有一定活性的水溶性复合杂多糖。根据对茶多糖的紫外、红外及气相色谱的分析,茶多糖由糖类、果胶及蛋白质等物质组成。为了更清晰地了解茶多糖的研究现状并对茶多糖进一步开发和研究,主要对近年来茶多糖的提取方法、分离纯化和分子组成等方面进行了综述,并对研究中存在的问题进行了分析,对其开发前景进行了展望。     

楸树花粉壁蛋白质提取及特异性

为了进一步研究楸树Catalpa bungei自交不亲和特性,以楸树不同产地植株云台山楸树（CB-1）,老山楸树（CB-2）和滇楸Catalpa fargesi f. duclouxii （CF）的花粉为对象,利用普通研磨法及超声波破碎法,研究了适合于花粉壁蛋白质提取的方法。同时采用考马斯亮蓝染色法及聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS?鄄PAGE）比较了不同树种花粉蛋白质质量分数及其主要蛋白质组分。结果表明:超声波破碎法适于花粉壁蛋白质的提取,最佳超声参数为功率400 W,超声时间 3 s次－1,间歇时间 6 s次－1,3个回合,工作120次,相隔5 min回合－1。蛋白质提取液三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）的pH 7.8最佳。不同树种的花粉壁蛋白质质量分数表现为滇楸最高,云台山楸树和老山楸树较低。蛋白质组分研究表明:各树种花粉共有蛋白质有26个,特异蛋白质为连楸53.8 kD,35.0 kD,23.4 kD,26.5 kD;老楸53.8 kD,38.5 kD,23.4 kD;滇楸38.5 kD,26.5 kD。图6表1参18     

Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备

[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒（FMDV）的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a（＋）质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5120。[结论]该研究结果为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。