猪Ⅱ型圆环病毒全基因组序列分析及其ORF1和ORF2基因的克隆与表达

猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap.本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中,进行了序列测定.将Rep和Cap基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pPROEXTMHT中,以融合蛋白的形式表达了这两种蛋白.根据文献报道,致病性的PCV-2与无致病性的PCV1的型特异性抗原决定簇主要位于Cap基因的羧基端部分,本实验利用原核表达载体pGEX-6p-1融合表达了Cap基因羧基端423bp的片段.通过薄层扫描各重组菌诱导表达产物的SDS-PAGE结果,重组质粒pPRO-Cap和pPRO-Rep以及pGEX-△Cap的外源基因表达量分别占总菌体总蛋白的15.1%、30.4%和19.6%.将表达的三种蛋白作为抗原,通过酶联免疫吸附试验分别与PCV-2阳性猪血清和SPF猪血清进行了反应,pGEX-△Cap表达的蛋白(Cap蛋白的羧基端部分)抗原反应性最强,这表明截短的Cap蛋白羧基端部分将是一个良好的诊断PCV-2感染用候选抗原.     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白（Rep）和核衣壳蛋白（Cap）,其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体（pShuttle-CMV）,与腺病毒骨架载体（pAdEasyTM）共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒tAd-Cap,测定其TCID50为1015．7／mL。用RT—PCR、间接ELISA、Westernbfot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达

猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础.     

表达猪圆环病毒2型Rep蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒2型(PCV2)是近年来新发现的引起断奶仔猪多系统衰弱综合征的主要病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。为了探究ORF1基因结构及其与功能的关系,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2的ORF1基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中,获得重组转移载体pFBD-ORF1,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得含有ORF1基因的重组穿梭载体rBacmid-ORF1,经脂质体介导转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rAc-Rep,SDS-PAGE和Western-blotting分析可见大小约为36ku的特异性条带,表明rAc-Rep在sf9中成功表达了PCV2Rep蛋白。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白(Cap)在293T细胞中的亚细胞定位

猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状系统中的表达与纯化

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)基因有两个主要的开放阅读框(open reading frame,ORF)。其中,ORF2编码病毒的主要结构蛋白核衣壳蛋白(Cap)。为了在昆虫细胞中表达Cap蛋白,本研究将重组穿梭质粒Bacmid-iel-ORF2经脂质体转染至昆虫细胞中,获得重组杆状病毒。经过噬斑克隆实验,获得稳定、高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,病毒滴度可达到1×109 pfu/m L。免疫印迹实验表明重组Cap蛋白可与PCV2阳性血清发生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应。本研究为提高PCV2灭活疫苗病毒滴度及免疫原性奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达

Cap蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的主要结构蛋白,能诱导免疫保护,是临床上利用血清学诊断PCV2的主要依据。本研究根据PCV2 TJ株全基因核苷酸序列(GenBank登录号:KC751546)设计特异性引物,利用PCR从PCV2 TJ株扩增获得Cap全基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-Cap,经IPTG诱导获得约48 ku的重组融合蛋白,Western blotting分析结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体和PCV2阳性猪血清均呈阳性反应。本研究成功克隆Cap全基因,构建原核表达载体,并实现Cap融合蛋白的表达,这为PCV2 Cap蛋白的功能研究及诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型修饰Cap蛋白基因的原核表达及纯化

目的：本研究基于原核表达系统表达猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）Cap蛋白。方法：PCV-2 ORF2基因编码的Cap蛋白含有能产生免疫反应的多个抗原表位,本研究针对Cap蛋白基因设计引物,去掉核定位信号肽的核苷酸序列克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中,筛选重组菌并进行原核表达、鉴定及纯化。结果：纯化后的修饰Cap蛋白是能够与猪圆环病毒Ⅱ型的阳性血清发生特异性反应。结论：表达的重组修饰Cap蛋白可以作为标准抗原蛋白用于PCV-2的检测。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白杆状病毒载体表达及免疫保护性分析

为了获得低成本高产量的抗原表达,开发新型、有效防控猪圆环病毒的亚单位疫苗,根据猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白序列,通过软件设计优化了密码子并合成cap基因,利用多角体病毒作为载体,构建了表达PCV2 Cap蛋白的重组病毒,命名为flashBAC-PCV2-ORF2株.经过鉴定,证明该病毒株表达Cap蛋白的抗原量在...     

猪圆环病毒2型去核定位信号ORF2基因的原核表达与初步应用

根据PCV2-871病毒株的已知序列设计一对引物,PCR扩增其去核定位信号的Cap基因（ORF2）。通过BamHⅠ/HindⅢ双酶切位点将其克隆到表达载体pQE-32中,转化大肠杆菌M15。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定,表明去核定位信号的Cap蛋白可以大量表达。Western blot、ELISA鉴定蛋白活性。继而。以重组蛋白为抗原包被ELISA板,对28份临床样品进行检测。结果表明,该蛋白具有良好的抗原活性,可以作为抗原应用于临床样品的检测。     

猪圆环病毒2型ORF1、ORF2和ORF3原核表达和多克隆抗体的制备

猪圆环病毒2型(porcine Circovirus type 2,PCV2)感染给养猪业造成巨大的经济损失,而PCV2ORF1、ORF2和ORF3与PCV2的复制、免疫原性及致病机理密切相关。本研究制备PCV2ORF1、ORF2和ORF3多克隆抗体,为进一步研究PCV2ORF1、ORF2和ORF3的功能提供材料。依据PCV2全基因组序列,分别设计针对PCV2ORF1、ORF2和ORF3编码基因的特异性引物,PCR扩增后,克隆入原核表达载体pET-32a的BamHⅠ/NcoⅠ和HindⅢ位点之间,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组原核表达载体分别命名为pET-ORF1、pET-ORF2和pET-ORF3。重组质粒分别转化E.coli BL21菌株,1 mmol/L IPTG诱导表达ORF1、ORF2和ORF3重组蛋白,SDS-PAGE测定结果表明其相对分子质量分别约为52 000、39 000和29 000。大量诱导重组蛋白表达后,回收目的蛋白条带、匀浆后免疫新西兰大白兔,制备兔抗PCV2ORF1、ORF2和ORF3重组蛋白血清。兔抗血清纯化后,Western blot检测抗血清与重组蛋白的特异性结合情况及其效价,证明所制备多克隆抗体均具有较强的特异性,效价均高于1∶10 000。     

PCV-2 ORF2和PRRSV ORF5基因的扩增与双基因真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因序列,分别设计一对引物,应用PCR和RT-PCR扩增出PCV-2 ORF2基因和PRRSV ORF5基因。将PCR产物ORF2经Nhe Ⅰ／EcoRⅠ双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2,RT-PCR产物ORF5经NotⅠ／XbaⅠ双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建重组质粒pIRES-ORF2／ORF5。对此质粒中的插入片段,进行PCRRT-PCR及双酶切鉴定,同时对插入序列进行测序分析,表明SD1株ORF2与国内多种毒株的同源性为99％,pIRES-ORF2ORF5转移载体ORF5基因的核苷酸推导氨基酸与北美洲原型（VR-2332株）氨基酸同源性为99％。此重组表达载体的成功构建,为进一步研究PCV-2ORF2及PRRSV ORF5编码蛋白的生物学活性及研究猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二联核酸疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因的克隆与表达

根据GenBank猪圆环病毒2型基因序列,设计合成两对特异性引物,对厦门株-1进行PCR扩增,得到ORF1和ORF2基因。将PCR产物酶切后,插入到pET-22b载体中,构建原核表达载体pET-22b/ORF1、pET-22b/ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE_3),经IPTG诱导表达,收集茵液进行SDS-PAGE分析。确定重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni~(2 )离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,逐步透析法进行复性。Western blot和ELISA分析结果表明Rep蛋白和Cap蛋白均能与猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应。     

猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5重组杆状病毒疫苗的研究

参照GenBank上收录的基因组序列自行设计引物,分别扩增猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5。将外源基因分别插入经改造的杆状病毒穿梭载体pFVC,获得3种重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2。将重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2分别转入带有杆状病毒骨架的DH10BacTME.coli感受态细胞中。提取高质量的重组质粒rBacmid-ORF2、rBacmid-ORF5、rBacmid-ORF5-ORF2,将重组质粒转染Sf9细胞,获取重组病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2。通过间接免疫荧光检测证实了外源基因正确表达。重组杆状病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2对BALB/c小鼠的免疫试验结果显示,rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2均能够刺激小鼠机体产生免疫应答,产生抗体,并能持续较长时间。     

PRRSV SD2株ORF5/ORF6基因克隆及双基因真核表达载体的构建

以PRRSV细胞培养物为模板，经RT—PCR扩增得到ORF5／ORF6基因，该产物和pIRES真核表达载体分别经双酶切，连接构建pIRES-ORF5／ORF6。经PCR、双酶切鉴定和测序证明成功构建了真核表达载体pIRES-ORF5／ORF6。测得的ORF5／ORF6序列与VR-2332株的氨基酸同源性分别为99％和100％，属北美洲型。     

表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2基因的重组鸡痘病毒的构建及鉴定

分别将猪圆环病毒2型的ORF2基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因,插入到鸡痘病毒转移载体pUTA2-16-LacZ单一启动子和复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-ORF5-ORF2。将该重组质粒与鸡痘病毒282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞,进行同源重组。通过3次溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)加压筛选,经RT-PCR、IFA和Western blot鉴定,表明重组鸡痘病毒中的目的基因在鸡胚成纤维细胞中得到表达,获得一株携带有目的基因ORF2和ORF5的重组鸡痘病毒rFPV-ORF2-ORF5。     

猪圆环病毒2型Rep、Cap蛋白基因串联重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

采用PCR方法克隆猪圆环病毒2型(PCV2)Rep和Cap蛋白基因,以串联的方式依次克隆到pMD18-T载体中.经鉴定后亚克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV.重组穿梭质粒用Pme Ⅰ线性化后与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183株内进行同源重组产生重组腺病毒质粒.将重组腺病毒质粒用Pac Ⅰ线性化后转染293细胞中包装成为完整的腺病毒.将构建的重组腺病毒按照每100μL 1×107蚀宽单位(PFU)滴鼻2次免疫6～8周龄BALB/c小鼠,经尾部采血获得一免、二免血清.用ELISA方法检测结果表明,该重组腺病毒可以诱导机体产生针对PCV2的特异性抗体,可作为候选基因工程疫苗进行本体动物免疫试验研究.     

猪圆环病毒2型ORF2和ORF1-2串联基因重组腺病毒对小鼠的免疫效果

为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)基因的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,利用本实验室构建的PCV2的ORF2和ORF1-2串联基因的重组腺病毒对小鼠进行了免疫并对其免疫效果进行了研究。分别用表达ORF2和OFR1-2基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体和脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例及其增殖反应、自然杀伤活性和特异性杀伤活性进行了检测和比较。结果表明,用表达ORF2基因和ORF1-2串联基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠后,随着免疫次数的增加,小鼠产生的针对PCV2ORF2基因的特异性抗体水平不断升高,第3次免疫后2周达到最高,但第3次免疫后4周有所下降;免疫重组腺病毒的试验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性、CTL杀伤活性和NK细胞杀伤活性与免疫空载体的对照组和免疫PBS的对照组比较均有显著的差异(P<0.05)。本研究为PCV-2基因工程疫苗的深入研究及应用奠定了基础。     

PCV2ORF1、ORF2截短基因原核表达载体的构建及表达

采用PCR方法,从PCV2双拷贝DNA感染性克隆中扩增出PCV2 ORF1和ORF2截短基因,与pQE30原核表达载体分别经KpnI和HandIII双酶切,连接,经鉴定后证明成功构建pQE30-ORF1、pQE30-ORF2原核表达载体,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot检测到目的蛋白表达,为研究蛋白功能和单克隆抗体的研制打下了基础.