绵羊痘病毒和山羊痘病毒双重PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)的检测方法,本研究针对这2种病毒的基因组序列,分别设计2对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等的优化,建立了快速鉴别检测SPPV和GTPV的双重PCR方法。该方法分别扩增出SPPV长度为177 bp和GTPV长度为222 bp的目的片段。特异性试验结果显示,该方法对牛疙瘩皮肤病病毒、犬细小病毒、大肠杆菌O157、沙门氏菌、健康羊组织和牛组织均无扩增。敏感性试验显示,该方法最低可检测1.725×107copies/μL的SPPV和1.71×106copies/μL的GTPV。应用该方法对50份临床病料样品进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致,均检出5份感染GTPV的病料和2份感染SPPV的病料,表明该方法可以用于临床病料样品的检测。     

绵羊痘病毒、山羊痘病毒及羊口疮病毒多重PCR检测方法的建立和应用

为了建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊口疮病毒(ORFV)的多重PCR检测方法,针对GenBank中3种病毒的基因组序列,合成了3对引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了鉴别检测3种病毒的多重PCR方法。特异性试验表明,应用该方法可分别扩增出3种病毒对应的目的片段,对大肠埃希菌、沙门菌、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、Vero细胞、正常羊组织的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验表明,该方法最低检测量分别为30.46pg/μL的绵羊痘病毒、28.9pg/μL的山羊痘病毒和26.94pg/μL的羊口疮病毒基因组DNA;应用本方法对85份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单项PCR检测方法结果一致,说明该方法可以用于临床上SPPV、GTPV和ORFV的鉴别诊断。     

外源性绵羊肺腺瘤病毒实时荧光RPA检测方法的建立

为实现对外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)的快速检测,根据基因组中序列保守的env基因设计特异性引物和探针,通过优化反应条件和反应体系,建立了exJSRV的实时荧光RPA检测方法,并通过灵敏度、特异性、重复性及样品检测进行评价。结果显示,该方法最佳反应温度为40℃,用时短,仅需20 min即可完成扩增;灵敏度高,最低可检测到10⁶ ng/L的cDNA模板,纯化后的cDNA模板最低可检测到10 ng/L,与PCR结果一致;特异性强,能准确检测到exJSRV,与小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊败血性链球菌(OSS)、牛肠道病毒(BEV)、传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、肺炎支原体(MO)等继发呼吸道症状的病原无交叉反应;重复性好,对于相同质量浓度的模板cDNA检测结果一致;可有效检测出病羊肺组织、鼻液及外周血白细胞内的exJSRV,与PCR结果一致。结果表明,该方法可实现exJSRV的快速检测,为绵羊肺腺瘤病(OPA)的诊断及防控提供可靠依据。     

山羊痘病毒LAMP检测方法的建立

为了建立适用于基层养殖场快速、可视化的山羊痘病毒(GTPV)环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法,根据GenBank公布的GTPV ORF103保守区核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,优化反应条件(时间、温度)和反应体系(dNTP、内外引物浓度比),并进行特异性和灵敏度试验。结果表明,所建立的LAMP方法在65℃时反应50 min即可获得清晰的梯状条带;扩增物经10×SYBR GreenⅠ荧光染料染色,紫外线照射或日光下即可直接判定结果;灵敏度试验结果表明,该方法能够检出的GTPV核酸最低浓度为1.287 ng/mL,与常规PCR方法相比,灵敏度增高100倍;该方法特异性良好,与小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊支原体(Mccp)、羊口疮病毒(ORFV)均无交叉反应;对10份临床样品检测结果显示,该方法与传统PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法可用于临床山羊痘病毒的检测。     

猪流行性腹泻病毒实时荧光RPA等温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的猪流行性腹泻病毒（PEDV）分子检测方法,本研究基于PEDV病毒M基因保守序列,设计一系列扩增引物及其荧光探针,以包含PEDV病毒M基因片段的pUC57质粒为模板,同时以包含猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）及古典猪瘟病毒（CSFV）等病毒膜蛋白或核衣壳蛋白基因序列的质粒作为对照,建立了一种PEDV实时荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）等温检测方法,测定了方法的特异性与敏感性。结果表明,该实时荧光RPA方法可在39℃恒温反应20 min特异性扩增PEDV病毒M基因,与TGEV、PRRSV等对照病毒基因无交叉反应,其检测限为10拷贝/μL。应用该实时荧光RPA方法可有效检测出血浆及血浆蛋白粉中的PEDV核酸。本研究建立的实时荧光RPA检测方法简单、快速、灵敏度高,可为PEDV的检测防控提供一种新的、可靠的技术支持。     

绵羊痘和山羊痘的防治方法

绵羊痘又名绵羊“天花”,是由绵羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病.本病以无毛或少毛部位皮肤、粘膜发生痘疹为特征.典型绵羊痘病程一般初为红斑、丘疹,后变为水疱、脓疱,最后干结成痂,脱落而痊愈.     

羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。     

动物A型流感病毒RPA-LFD可视化检测方法的建立

为建立动物A型流感病毒(IV)的重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对A型IV基质蛋白(M)基因保守序列设计了引物和探针,通过反应条件优化,建立了RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法检测动物A型IV呈阳性,与新城疫病毒、鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒等无交叉反应,特异性强;反应时间短、敏感性高,可以在35℃,20 min内检测到最低浓度为10拷贝/μL的重组质粒标准品。利用该方法对从化某活禽市场分离的鸭咽拭子样品共50份进行检测,结果3份为阳性,其余均为阴性,与PCR及病毒分离结果一致,准确性高。本研究首次建立了检测动物A型IV的可视化RPA-LFD检测方法,该方法不依赖任何仪器设备,操作简单、快速,可为基层实验室临床快速检测和流行病学研究提供帮助。     

用于山羊痘病毒载体的强痘病毒启动子筛选

为提高重组山羊痘病毒(GPV)中外源基因的表达水平及筛选强转录效力的启动子,本研究选择桑灯蛾昆虫痘病毒42K启动子(42K)、痘病毒合成晚期441启动子(SL441)、痘病毒合成晚期454启动子(SL454)、牛痘病毒(VV)早晚期P7.5启动子(P7.5)、VV晚期P11启动子(P11)、VV H6启动子(H6)、VV合成早晚期启动子(E/L)及人工优化早晚期启动子(LEO)8种启动子,并在其下游插入萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因,分别构建了启动子效力检测重组质粒。并分别将其转染于预感染GPV的DF-1(鸡)、LT(绵羊)、BHK-21(仓鼠)和Vero(猴)4种动物源细胞中,以表达海肾荧光素酶(Rluc)的p RL-TK为内参质粒,24 h后检测荧光素酶活性。结果表明,在LT细胞中,SL441转录效力最强;在DF-1细胞中,LEO转录效力最强,为其他启动子的1.19~14.46倍;在Vero细胞中,H6和SL441的转录效力较强,达到其他启动子的1.21~11.24倍;在BHK-21中,H6启动子的转录效力也显著强于其它启动子。本实验最终确定了GPV在4种动物源细胞中转录效力强的启动子,该研究结果为进一步提高以GPV为载体疫苗的免疫效力奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒RPA等温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)分子检测方法,基于ASFV P72基因保守序列,设计并合成引物,建立了一种ASFV重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法。结果表明,所建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应30 min,即可实现对目的片段的有效扩增;以包含ASFV P72基因的ORF质粒为模板,RPA的检测限达到10~2 copies,同世界动物卫生组织(OIE)推荐的实时荧光PCR方法检测限一致,但比OIE推荐方法的检测限高10倍;RPA仅特异性扩增ASFV P72基因,对FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因组c DNA或DNA没有扩增。本研究所建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠,为非洲猪瘟的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。     

羊痘的研究进展

羊痘是危害养羊业健康发展的一种烈性传染病,各国学者对该病的诊断与防治进行了广泛研究。作者从羊痘的病原学特征、流行病学特征、诊断方法、防治等方面进行了综述。     

柑橘黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测

【目的】本研究旨在建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)快速检测体系,丰富柑橘黄龙病的高效简便检测方法。【方法】以黄龙病菌株psy62的保守基因序列设计并筛选特异性引物,经灵敏度比较和检测特异性验证,建立该病的RPA检测体系。经PCR、RPA和实时荧光PCR对87份柑橘样品的黄龙病菌检测,验证RPA检测体系的适用性。【结果】建立了黄龙病菌的RPA检测方法。(1)特异性：能特异性检测柑橘黄龙病。(2)灵敏度：RPA是PCR的100倍,与实时荧光PCR相当。(3)检测体系：只需20min,大幅提高检测效率。(4)适用性：RPA与实时荧光PCR检出率均为35.63%,比PCR的31.03%略高。【结论】建立了黄龙病菌的RPA检测方法,具有特异性强、灵敏度高、检测快速、无需特殊仪器设备和操作简便等特点,为柑橘黄龙病提供了高效简便的快速检测手段。     

小反刍兽疫病毒及山羊痘病毒N-ITR基因二联实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

Peste des petits ruminants virus (PPRV) and goat pox virus (GTPV) are the causative agents of two kinds of goats’ diseases-peste des petits ruminants and goat pox which can cause disaster economic losses. In order to detect the two viruses simultaneously and quickly, two sets of primers and relative probes were designed based on the nucleoprotein (N) gene of PPRV and the inverted terminal repeat (ITR) segment of GTPV, respectively. In order to work together in the same reaction, the probes were labeled with different fluorescent materials 5′FAM-TAMRA3′and 5′JOE-Eclipse3′,respectively. Results showed that the duplex Real-time RT-PCR assay was identified to be specific for PPRV and GTPV only and specific fluorescent signal could be detected, but the related viruses including fowl pox virus（FPV）and canine distemper virus (CDV) had no specific fluorescent signal. Positive recombinant plasmids (PPRV pMD18-T-N and GTPV pMD18-T-ITR) were built and used for positive quantitative templates to establish duplex standard curves. The developed assay based on the probe N-ITR was found to be highly specific and sensitive with a detection limit of 10² copies/μL cDNA and 10³ copies/μL DNA for PPRV and GTPV, respectively. Finally, the duplex Real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of PPRV and GTPV was established preliminarily in the study.     

The Extent and Impact of Sheep Pox and Goat Pox in the State of Maharashtra,India

A survey of sheep and goat producers in the state of Maharashtra, India, was undertaken to ascertain the extent and economic impact of sheep pox and goat pox (SGP). One thousand one hundred and sixteen owners were interviewed. Eighty owners (7.2%) reported that they had experienced an outbreak of the disease in the previous 6 years. The results showed that, while producers ranked SGP below other infectious diseases such as foot-and-mouth disease, rinderpest and enterotoxaemia, when SGP occurred it had a major impact, with average morbidity and mortality rates of 63.5% and 49.5%, respectively. Modelling studies suggested it would take about 6 years for a flock or herd to recover from an outbreak, with average annual losses in income of 30–43%, depending on flock type and the owner's actions. Statewide, it is estimated that around 5000 flocks and herds are affected by SGP annually in Maharashtra, costing up to INR 107.5 million. The highest losses occurred in the Aurangabad region.     

Effect on Proliferation of Goat Pox Virus of TK Gene Deficiency

In this study, the proliferation of goat pox virus (GPV) was researched using the recombinant GPV of TK gene insertion inactivation. Different length DNA fragments X1, X2, X3 and X4 were inserted into the transfer plasmid pTKfpgigp to constructed the recombinant transfer plasmids and these plasmids were transfected into lamb testis cells infected GPV. Recombinant GPVs of TK gene inactivation by inserting foreign DNA fragment of 2 800, 4 000, 5 200 and 7 700 bp,respectively, were generated via homologous recombination. Four recombinant GPVs (rGPV/tk^-) were obtained by selective culture and the virus titer were mensurated by 50% tissue culture infective dose. The results showed that the rGPV/tk^- virus titers were decreased obviosuly which was comparable with the wild type GPV AV41. Furthermore, the virus titer of the recombinant virus was decreased more obviously with the extension of the foreign DNA fragment. The result indicated that the proliferation of the GPV was depressed when GPV TK gene was deficient.     

山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响

为了研究山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响,同源重组构建TK基因缺失型重组山羊痘病毒,检测其增殖特性。试验在通用转移质粒pTKfpgigp内插入不同长度的X1~X4片段,构建了4个重组转移质粒;重组质粒转染已感染山羊痘病毒的羔羊睾丸细胞,经同源重组产生4株TK基因缺失型重组山羊痘病毒rGPV/tk^－,其TK基因内分别插入了长度约为2 800、4 000、5 200、7 700 bp的外源DNA片段;筛选纯化重组毒株,测定rGPV/tk^－病毒滴度。结果显示,TK基因失活后,rGPV/tk^－病毒滴度明显降低;随着插入DNA片段的延长,重组毒株的病毒滴度下降程度更加明显。研究表明,TK基因功能的缺失对山羊痘病毒的增殖具有一定的抑制作用,并与外源DNA的长度具有相关性。     

Establishment of a Real-time Fluorescent Recombinase Polymerase Amplification (RPA) for the Detection of African Swine Fever Virus

African swine fever (ASF), which caused by African swine fever virus (ASFV), is an acute, highly contagious disease characterized by high fever. It leads to serious economic losses in pig industry. 3 assemblies of primers and probes targeting were designed to amplify ASFV B646L (p72) gene using recombinase polymerase amplification (RPA) technology. The Real-time fluorescent RPA method was established after screening of primers and probes, optimization of reaction conditions, tests of sensitivity, specificity and repeatability. The results showed that the method could detect 10 copies of DNA within 20 min at 39℃. No cross-reaction was found when testing swine fever virus, porcine circovirus type 2, porcine parvovirus, pseudorabies virus. According to the fluorescence intensity from 5.5×10⁶ to 5.5×10⁰ copies/μL at each time point, the coefficient of variation was 0.38% to 28.30%. In conclusion, this method could be used for the qualitative detection of ASFV pathogen, which might provide technical support for the early diagnosis of ASFV infection in China, and was also of great significance for the development of corresponding control measures.     

非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法的建立

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA）,针对ASFV B646L （p72）基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×10⁶至5.5×10⁰拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。     

山羊痘的流行及防治措施

山羊痘是由山羊痘病毒属的痘病毒引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病。文章从山羊痘流行病学、症状、诊断和防治措施等方面对山羊痘进行综述。