黄瓜黑星病菌致病机理的研究Ⅰ 黄瓜黑星病菌致病毒素的分离和纯化

本文明确了在接种后的黄瓜黄化子叶中能够提取到黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucum eri-num ) 的粗毒素,最佳培养时间为接种后4 d。该毒素具有明显的生物活性,能够抑制黄瓜胚根与胚芽的生长,能使扦插的黄瓜水培幼苗致萎。通过硅胶柱层析纯化黄瓜黑星病菌的粗毒素,根据洗脱顺序和洗脱液的种类将其分为4 个洗脱组分。根据硅胶薄层层析紫外显色及生物活性分析可确定,活性物质主要集中在无色的洗脱组分Ⅱ中,该洗脱组分中有 3 组活性物质:CCⅠ:Rf= 0.51; CCⅡ:Rf=0.25; CCⅢ:Rf= 0.06。     

黄瓜黑星病菌致病机理的研究Ⅱ细胞壁降解酶及其在致病中的作用

 本文通过活体内外黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum)产生的细胞壁降解酶活性分析,初步明确了Cx-酶(羧甲基纤维素酶)、β-葡萄糖苷酶和PMG(聚甲基半乳糖醛酸酶)、PMTE(果胶甲基反式消除酶)在该菌侵染黄瓜中的作用。瓜条感病的各部位,以病健交界处细胞壁降解酶活性最高;在检测的各类酶中,活性最高的为PMG、PMTE,Cx-酶、β-葡萄糖苷酶和FPA(滤纸酶)活性较低。抗感病黄瓜品种染病后,细胞壁降解酶活性均迅速增强。感病品种染病后,果胶酶(PMG、PMTE)活性远远高于抗病品种,其高峰值是抗病品种的2.72~7.52倍。感病品种接种后纤维素酶(Cx-酶、β-葡萄糖苷酶)活性一直增强;抗病品种接种后β-葡萄糖苷酶随着接种天数的增加酶活性一直增强,Cx-酶在染病后初期活性迅速增强,增至高峰后逐渐降低。     

黄瓜黑星病菌致病机理的研究Ⅱ细胞壁降解酶及其在致病中的作用

 本文通过活体内外黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum)产生的细胞壁降解酶活性分析,初步明确了Cx-酶(羧甲基纤维素酶)、β-葡萄糖苷酶和PMG(聚甲基半乳糖醛酸酶)、PMTE(果胶甲基反式消除酶)在该菌侵染黄瓜中的作用。瓜条感病的各部位,以病健交界处细胞壁降解酶活性最高;在检测的各类酶中,活性最高的为PMG、PMTE,Cx-酶、β-葡萄糖苷酶和FPA(滤纸酶)活性较低。抗感病黄瓜品种染病后,细胞壁降解酶活性均迅速增强。感病品种染病后,果胶酶(PMG、PMTE)活性远远高于抗病品种,其高峰值是抗病品种的2.72~7.52倍。感病品种接种后纤维素酶(Cx-酶、β-葡萄糖苷酶)活性一直增强;抗病品种接种后β-葡萄糖苷酶随着接种天数的增加酶活性一直增强,Cx-酶在染病后初期活性迅速增强,增至高峰后逐渐降低。     

草酸青霉菌果胶酶诱导黄瓜抗黑星病研究

 本文就草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)的固态发酵提取产物--果胶酶粗酶液诱导黄瓜对黑星病(Cladosporium cucumerinum)的抗性进行了研究。以果胶酶粗酶液喷雾处理4个感黑星病黄瓜品种的黄化苗,48 h后挑战接种黑星病菌孢子悬液,其中"中农5号"黄瓜品种表现的诱导抗病效果最好,诱抗效果达62.51%。不同浓度果胶酶诱导处理黄瓜,发现果胶酶浓度在20 U/mL时,可导致黄瓜发病略高于对照;在40~200 U/mL浓度范围内,诱导效果较为明显。通过研究果胶酶诱导抗病的时效性,表明诱导处理前接种病菌或诱导处理后0、6 h接种的各处理病情指数与对照间没有差别,而诱导处理12~72 h后接种病菌的,果胶酶的诱导抗病效果均很明显,诱抗效果达29.64%~60.02%。实验还表明,随着挑战接种压力的增大,果胶酶的诱导抗病效果降低。果胶酶不能抑制黑星病菌孢子萌发,相反可以促进孢子萌发和芽管生长。     

高温高湿对黄瓜黑星病菌孢子萌发及侵染的影响

 采取温湿度相结合的方法来研究高温处理对黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum Ell.and Arth.)侵染的影响,比较研究了35~50℃ 4个温度梯度、50%~90% 5个湿度梯度组合处理对病菌的致死作用。同一相对湿度下,随着温度的上升病菌的致死率增加,病菌致病力降低;在同一温度下随着湿度的不断升高,受处理的孢子萌发率和致病能力都逐渐下降。在RH 80%以上、温度40℃以上时,对孢子的致死率随着处理时间的延长而增高,此高温高湿处理病菌超过2 h,病菌孢子不萌发,也基本没有接种发病率。通过高温控制苗期黄瓜黑星病的研究,初步确定高温高湿防治苗期黄瓜黑星病的最佳温度区间为40℃ 2 h或45℃ 1h (RH 80%)。     

黄瓜黑星病菌对多菌灵抗药性的测定

黄瓜黑星病是黄瓜生产中的一种主要病害。生产上使用多菌灵进行药剂防治是控制黑星病危害的主要措施。由于长期大面积地应用多菌灵防治,使个别地区或年份黄瓜黑星病的发生仍为严重。因此,研究黄瓜黑星病菌Cladosporium cucumerinum Ell.et Arthur对多菌灵的抗药性是十分必要的。为此,作者进行了该项研究,结果报道如下。     

采用孢子萌发法测定化合物对黄瓜白粉病菌的生物活性

接种黄瓜白粉菌后16 h的黄瓜叶片用透明胶带在子叶表面粘孢子取样的平均发芽率与用台盼蓝染色后在光学显微镜下调查的发芽率分别为83.7%和85.0%,t测验无显著差异,表明透明胶带取样的发芽率可以代表黄瓜叶片上白粉病菌孢子的发芽率。采用孢子萌发法和叶碟法分别测定了醚菌酯、植物源活性组分大黄素甲醚(P3D)对8个黄瓜白粉菌菌株的EC₅₀。统计结果表明:采用两种方法测定醚菌酯P、3D对黄瓜白粉菌的EC₅₀的相关系数的平方值分别为0.880、.99,表明两种方法的测定结果有很强的相关性;采用该孢子萌发法可评价化合物对植物专性寄生病菌如白粉菌孢子萌发的生物活性。     

玉米茎腐病菌毒素致病力初报

通过提取玉米茎腐病菌毒素粗提液,证实玉米茎腐病原菌(镰刀菌和腐霉菌为主)在镰刀菌毒素培养液、查氏培养液和普通培养液中,能产生和玉米小斑病菌毒素(简称HM毒素,下同)类似的致病毒素。该物质能抑制种子根的生长。接种在玉米叶片上能产生典型的萎蔫枯死斑;用上述3种培养液培养病原菌,产生的毒素致病力差异不显著;不同类型病原菌产生的毒素致病力和同一类型病原菌不同菌株产生的毒素致病力差异都极显著。玉米品系对茎腐病原菌产生的毒素抗病性差异也极显著。     

梨黑星病菌寄生部位及致病作用研究

 组织透明及扫描电镜研究结果表明:梨黑星病菌在叶片上主要寄生于表皮细胞和叶脉薄壁组织细胞的表面,沿细胞表面扩展。病原菌并非只在角质层与表皮细胞间生长,而且在表皮细胞和叶脉薄壁组织细胞的细胞间寄生。在大量的观察中,没有发现侵入到细胞内菌丝或菌丝变态结构。梨黑星病菌不寄生叶肉细胞,但能导致叶肉细胞病变。由于黑星病菌的寄生性既不同于专性寄生,也不同于杀生寄生,才使梨黑星病的潜育期和产孢期都长于这两类真菌病害。这是认识和研究梨黑星病发病特点和流行规律的基础。     

黄瓜黑星病侵染和发病规律及其生态防治的研究

黄瓜黑星病菌以菌丝体在病残株内于田间或土中越冬,成为第二年初侵染来源。黄瓜种子内的菌丝也可越冬,带菌率最高可达37.76%。种子各部位均可带菌,以种皮为多。接种试验证明黄瓜黑星病菌主要是从叶、茎、果实的表皮直接穿透侵入,也可从气孔或伤口侵入,但极少。黄瓜黑星病菌的分生孢子产生必须具备90%以上的相对湿度(RH)和15℃以上的日平均温度。分生孢子在5—30℃下均可萌发,适温15—25℃,但萌发必须有水滴,在无水滴的情况下即使RH达100%也不能萌发。吉林省大棚内发病重是由于5月中旬以后棚温达到黑星病菌生长的温度范围,RH长时间(12小时以上)在90%以上。露地黄瓜黑星病的发生则与当年的降雨量和降雨日数多少有关。大棚内采用降低湿度的生态防治措施,可有效地控制病情,从而减少喷药次数而达到防治目的。     

葱叶枯病菌 Stemphylium botryosum毒素的分离与除草活性研究

葱叶枯病菌在活体外可以产生致病毒素, 用改良PS 培养基培养所得滤液经TLC 分离获得Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 5 种组分, 其Rf 值分别为0.31、0.47、0.74、0.80 和0.90, 在乙醇中最大紫外吸收峰分别为240、247、223、236 和258 nm。生物测定结果表明, 组分Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对马唐的生长有明显的抑制作用, 其中以组分Ⅳ 生物活性最高。粗毒素对禾本科杂草种子萌发抑制效果高于对阔叶杂草, 而对玉米、水稻、油菜等种子萌发影响很小。试验还发现, 毒素对马唐的防效最高, 与百草枯药效相当。毒素对马唐叶绿素a 的含量影响不大, 但对叶绿素b 和叶绿素总含量影响较大。     

瓜黑星病菌、枯萎病菌和蔓枯病菌的三重PCR检测

通过测定黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum)rDNA的ITS序列,比对近缘种及瓜类几种重要病原菌的ITS序列,设计出特异性引物HX-1/HX-2,经过对引物HX-1/HX-2PCR条件的优化,可以扩增出1条190bp的黄瓜黑星病菌特异性DNA条带,灵敏度达到1pg/μL。进一步将引物HX-1/HX-2和瓜类枯萎病菌、瓜类蔓枯病菌特异检测引物Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组合,建立三重PCR体系,可一次检测出瓜类黑星病菌、瓜类枯萎病菌、瓜类蔓枯病菌3种瓜类植物重要的病原菌。建立了可以应用于田间瓜类黑星病菌PCR检测技术和瓜类主要病害三重PCR检测技术,对瓜类病害的诊断和防治具有重要的指导作用。     

病原菌诱导黄瓜对其主要病害的抗病反应

以5种黄瓜主要病原菌作为诱导抗病因子,研究其对黄瓜主要病害的作用,结果发现黄瓜经病原菌诱导后,可以产生对诱导病原菌及其它病原菌引起病害的交互保护作用,并且诱导的交互保护作用与诱导浓度、诱导间隔期、不同品种存在相关性.诱导效果不随诱导接种浓度的升高而升高.在黑星病菌对霜霉病菌的诱导作用中,以浓度为1×102个/ml的黑星病菌孢子悬浮液的诱导效果最好,诱导间隔期为48h黄瓜黑星病菌对霜霉病的交互保护作用最明显,抗性品种的交互保护作用明显好于感病品种;炭疽病菌可诱导黄瓜有效抑制褐斑病的发生,但挑战接种褐斑病菌后,却促进了炭疽病的发生.诱导接种炭疽病菌后再挑战接种褐斑病菌12d,对褐斑病的防效为92.07%.     

葱紫斑病菌毒素的纯化及除草活性

随着人们对植物病原真菌毒素研究和认识的深入,毒素在农药研究中的应用也日趋广泛,特别是把植物病原真菌毒素作为开发除草剂的内源活性物质已有成功的实例。Suemitsu等报道葱紫斑病菌(Alternaria porri)毒素(以下简称AP-毒素)由4种物质组成,但有关其除草生物活性研究目前尚未见报道。作者对AP-毒素的分离提纯及对稗草的生物活性作了初步研究,结果如下。 1 材料与方法 1.1 供试材料:菌种:葱紫斑病菌(Alternaria porri)是由典型病斑分离获得的纯培养物。     

枯斑盘多毛孢Pf-毒素活性组分的分离纯化

 对枯斑盘多毛孢(Pestalotia funerea)培养滤液用70%乙醇沉淀,将其分为可溶性和不可溶(蛋白质等大分子)组分,浸渍法活性检测表明,蛋白质等大分子物质对马尾松、湿地松切根幼苗没有致病活力,非蛋白部分(Pf-毒素)则保留了病原菌培养滤液的致病活性,且与病原菌培养滤液相比活性有所增强。以最适流动相,正丁醇:甲醇:水(4:1:2)为洗脱液,采用硅胶H60型柱反复柱层析,从枯斑盘多毛孢的甲醇粗提物质中分离出9种组分,经致病活性测定出3种组分,Rf值分别为0.83、0.79、0.80,它们对马尾松切根幼苗、湿地松切根幼苗针叶都有致萎作用。     

黄瓜炭疽病菌代谢物中抑菌活性成分研究

采用大孔吸附树脂提取和硅胶柱层析分离技术,从黄瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare代谢物中获得一个抗真菌化合物,采用高分辨质谱、核磁共振波谱和红外光谱等技术鉴定了其化学结构,并评价了其对番茄灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、烟草赤星病菌、苹果炭疽病菌和玉米弯孢病菌的孢子萌发和菌丝生长的抑制作用。结果表明:该化合物为间二羟基苯甲酸大环内酯类抗生素——根赤壳菌素;其对所有供试真菌的孢子萌发均未表现出明显的抑制活性,但对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea的菌丝生长表现出很强的抑制作用。     

黄瓜白粉病菌接种及对杀菌剂敏感性测定方法

建立了孢子悬浮液接种黄瓜子叶测定黄瓜白粉病菌杀菌剂敏感性的简便方法。比较了白粉病菌分生孢子悬浮液涂抹法和喷雾法接种黄瓜幼苗子叶的效果,结果表明,涂抹法发病率高,均匀度更好;测定了接菌后不同时间施药,白粉病菌对己唑醇、腈菌唑、三唑酮、甲基硫菌灵和百菌清等5种杀菌剂的敏感性,结果表明,接菌后96h施药较为敏感,测得的EC50较小。最后确定接种及毒力测定方法为:接种时白粉病菌分生孢子悬浮液使用十二烷基硫酸钠水溶液分散悬浮,孢子浓度为15×10倍显微镜下每视野30~40个,接种后96h施药,发病后直接利用病斑数来计算毒力测定结果。该方法可用于黄瓜白粉病菌抗药性监测和对杀菌剂敏感性测定。     

豇豆轮纹病病菌产毒条件筛选及毒素活性测定

采用种子萌发抑制率和种子胚芽抑制率的检测方法,研究了豇豆轮纹病病原菌（Corynespora cassiicola）在不同培养基、培养时间、培养温度、培养液pH、光照和振荡条件下粗毒素的产生及其活性。试验结果表明：不同的培养条件下病原菌产生毒素活性不同,查彼培养液为最佳培养液,振荡培养可以促进毒素的产生,最适的产毒pH为7~8,最适温度为20~25 ℃,最佳培养时间为15 d,光照条件下病原菌粗毒素的活性最大。豇豆轮纹病粗毒素对于不同寄主的活性测定结果表明：豇豆轮纹病菌毒素接种的10种供试植物中,大豆、菜豆致病反应明显,相对的病斑较大,而对黄瓜无致病力,不产生病斑。     

玉米大斑菌Ht-毒素组分分析

 对分别属于玉米大斑病菌(Helminthosporium turcicum)1号和2号生理小种的致病毒素进行硅胶TL层析、薄层扫描和生物监测的结果发现,两个小种的毒性组分不同。2号小种可分离到I(Rf0.50)、Ⅱ(Rf0.36)、Ⅲ(Rf0.67)、Ⅳ(Rf0.80)、Ⅴ(Rf0.13)、Ⅵ(Rf0.25)6种组分,而1号小种最多可分离到除Ⅳ以外的其它5种组分,这些组分均有不同程度的紫外吸收。对在200~360nm有明显紫外吸收的4种组分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)的生物监测结果表明,只有组分Ⅲ对带Ht₁基因和不带Ht₁基因的Oh43和B372对玉米自交系不具任何致病活性,组分Ⅰ、Ⅱ对不带Ht₁基因的玉米自交系具有致病活性,而对带Ht₁基因的玉米自交系却无毒性。值得重视的是组分Ⅳ的致病特性与组分Ⅰ、Ⅱ正好相反,即对带Ht₁基因的玉米自交系具有致病活性,却对不带Ht₁基因的玉米自交系没有致病作用。结论指出,Ht-毒素的TLC组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ玉米斑菌诱致玉米发病的主要活性成份,其中组分Ⅳ是2号小种与Ht₁基因玉米互作的特异性因子。     

梨黑星病菌被哈茨木霉感染后抗氧化系统的变化

测定被哈茨木霉感染后梨黑星病菌抗氧化系统变化的结果表明,被哈茨木霉感染后梨黑星病菌过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性逐渐下降;丙二醛含量和超氧阴离子产生速率上升;还原型谷胱甘肽和抗坏血酸含量降低。初步明确,梨黑星病菌被哈茨木霉感染后,活性氧清除系统等被破坏,膜脂过氧化作用加强,是最终导致菌体受害的原因之一。