蚕豆萎蔫病毒ELISA检测系统建立及其应用

 从制备的蚕豆萎蔫病毒(BBWV)抗血清中提纯IgG,并用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,建立了DAS-ELISA检测BBWV的方法。DAS-ELISA检测时包被IgG以26.9 μg/ml效果最好,HRP-IgG结合物以1800~11600效果最佳。DAS-ELISA检测BBWV病叶粗汁液的最大稀释度为1 320,检测提纯病毒的最低浓度为0.744 μg/ml。田间病样测定表明,BBWV在蚕豆、豌豆、豇豆、大豆、茄子和辣椒等作物上发生很普遍,在菜豆上也有零星发生,而在莴苣、芹菜、白菜、萝卜、花椰菜上未测到BBWV。DAS-ELISA检测结果与生物学检测结果基本相符,符合率达97.6%。     

葡萄蚕豆萎蔫病毒中国分离物基因组全长序列分析

 葡萄蚕豆萎蔫病毒(grapevine fabavirus,GFabV)是近年报道的葡萄新病毒,与葡萄褪绿斑驳、皱缩等症状发生相关,严重影响葡萄长势。本研究采用小RNA测序结合Sanger测序方法分别对表现褪绿斑驳的‘贝达’和无症状的‘赤霞珠’葡萄中的GFabV分离物进行基因组全长序列测定,获得了GFabV分离物LN_BETA2和LN_CXZ的基因组全长序列,其RNA1基因组全长分别为5 824 bp和5 823 bp,RNA2基因组全长分别为3 132 bp和3 135 bp。LN_BETA2与LN_CXZ的RNA1编码的多聚蛋白核苷酸序列之间的同源性为81.7%,与其他GFabV分离物多聚蛋白核苷酸同源性分别为73.4%~99.5%和73.5%~82.5%;LN_BETA2和LN_CXZ的RNA2编码的多聚蛋白核苷酸同源性为83.8%,与其他GFabV分离物多聚蛋白核苷酸同源性为75.0%~83.3%和68.2%~98.6%。系统进化树分析结果显示,在RNA1基因组中,LN_BETA2划分在组3,LN_CXZ形成单独的分支。RNA2基因组中,LN_BETA2和LN_CXZ分别划分在组3和组5中。本研究首次报道了GFabV中国分离物基因组全长序列,可为今后GFabV生物学特性及致病性研究提供工作基础。     

蚕豆萎蔫病毒2号安徽分离物全基因组序列测定与分析

利用酶联免疫和RT-PCR技术对采自安徽地区的蚕豆病株进行检测,确定其病原为蚕豆萎蔫病毒2号Broad bean wilt virus 2(BBWV2)。为明确BBWV2安徽分离物(BBWV2-AH)的分类地位,克隆了该分离物的全基因组序列,分析了其基因组特征。结果表明,BBWV2-AH RNA1全长为5 944 bp(GenBank登录号:KY606992),含有1个ORF;BBWV2-AH RNA2全长3 587bp(GenBank登录号:KY606993),含有1个ORF。全序列核苷酸和氨基酸相似性分析显示,BBWV2-AH RNA1与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为78.4%~96%和87.1%~99%;BBWV2-AH RNA2与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为76.8%~95.5%和88.2%~98.3%。全基因组核苷酸序列系统发育分析显示,BBWV2-AH RNA1与中国的BBWV2-Hunan RNA1的亲缘关系最近,而BBWV2-AH RNA2与韩国的多个分离物聚集在一起,再与中国的分离物BBWV2-B935形成一个分支。     

侵染勿忘我花卉的蚕豆萎蔫病毒的鉴定

从勿忘我（Ｍｙｏｓｏｔｉｓｓｉｌｖａｔｉｃａ）上采集到１病株，接种昆诺阿藜，接种叶褪绿斑，系统顶枯，最后整株枯死。蚕豆接种叶呈黑色坏死斑，主茎变褐、全株萎蔫。矮牵牛接种叶褪绿斑，系统花叶。用诱捕修饰法制片，观察到病毒粒体球形，并在病毒粒体外面包被着一层抗体。琼脂双扩散试验呈阳性反应     

太子参蚕豆萎蔫病毒2号CP基因的遗传多样性及分子进化分析

为了解太子参蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)的遗传多样性及分子进化关系,本研究对5个不同地理来源的6份太子参病叶样品进行了BBWV2外壳蛋白(coat protein,CP)基因的RT-PCR扩增和克隆。序列分析结果表明,所得13条太子参BBWV2 CP基因序列均为1 345 bp,其核苷酸序列同一性在81.0%~99.0%之间,氨基酸序列同一性在93.5%~99.3%之间;核苷酸多样性为0.084 00;存在280个核苷酸多态性位点,其中232个为地域特异性位点;总变异数为278个,其中同义突变29个,异义突变249个。不同地理来源的太子参BBWV2分离物之间遗传分化程度较高,基因交流不频繁,遗传漂变可能导致分离物间明显的遗传分化。在系统进化树中,太子参分离物的聚类呈现出明显的地域特异性,江苏、贵州、湖南、福建分离物均聚类在I-a亚组,而山东分离物聚类在II-c亚组,遗传距离较远。研究表明,太子参BBW V2存在很高的遗传变异,基因突变是其产生遗传多样性的主要驱动力,而地理因素与其具有较高的核苷酸多样性密切相关。     

蚕豆萎蔫病毒2号分离物PV131和P158侵染寄主植物的细胞病理比较观察

 透射电镜观察比较了蚕豆萎蔫病毒2号(BBWV-2)分离物PV131和P158侵染昆诺藜(Chenopodium quinoa)和蚕豆(Vicia faba)的细胞超微结构变化。结果显示:受PV131分离物侵染的昆诺藜叶肉细胞质中膜结构大量增生,形成有膜状结构、大小泡囊及电子致密物质的特殊膜增生区;病毒粒子散布在细胞质中,形成大块结晶体和管状结构,该管状结构直径约75nm,横切面由9个病毒粒子组成;受PV131侵染的蚕豆叶肉细胞中也形成膜增生区和管状结构,未见病毒结晶体。受P158分离物侵染的昆诺藜和蚕豆叶肉细胞病变情况与PV131分离物相似,形成膜增生区和相同的管状结构,在蚕豆叶肉细胞中也未观察到病毒结晶体。上述结果表明:2个BBWV-2分离物虽然在不同寄主植物上引起的细胞病变程度有差异,但其细胞病理学特征是由病毒基因结构所决定,与寄主的种类无关。     

木尔坦棉花曲叶病毒编码蛋白的亚细胞定位分析

 木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV)是典型的单组分双生病毒,并伴随β卫星分子,是棉花曲叶病的主要病原之一。本研究利用农杆菌介导的瞬时表达系统,将CLCuMV及其卫星分子编码的7个病毒蛋白在本氏烟表皮细胞中表达。通过激光共聚焦显微镜观察发现:V1、C2和C3定位于细胞核;C1和βC1定位在细胞核以及细胞质或细胞膜上,并且在细胞质中形成丝状结构;V2和C4主要定位在细胞质或细胞膜上,细胞核也有微量表达,V2可形成大小不一的颗粒状聚集体结构,C4在细胞膜上可见点状聚集体结构。同时,利用RT-PCR和Western blot对病毒各基因的转录和表达水平进行了分析。CLCuMV编码蛋白的亚细胞定位为蛋白功能的进一步研究提供重要理论依据。     

扬州蚕豆病毒病的鉴定及野豌豆潜隐病毒M扬州分离物基因组克隆及其序列分析

对田间疑似病毒侵染的蚕豆样品,提取总RNA,分离siRNA,建库并通过高通量测序,其结果经velvet拼接组装,经Blastn与NCBI比对分析,发现该样品感染4种病毒:野豌豆潜隐病毒M (vicia cryptic virus M,VCV-M)、野豌豆潜隐病毒(vicia cryptic virus, VCV)、紫云英矮宿病毒(milk vetch dwarf virus, MDV)和三叶草黄脉病毒(clover yellow vein virus, ClYVV)。其中,有14条VCV-M相关的contigs。RT-PCR扩增并拼接获得VCV-M-YZ基因组,其长度为3 434 nt,其5′-UTR和3′-UTR分别为142 nt和117 nt,各自形成与该属代表病毒南方番茄病毒(southern tomato virus, STV) 5′-UTR和3′-UTR相似的高级结构,且A+U含量均较高。VCV-M-YZ与已报道的VCV-M基因组序列一致性在98%以上。系统进化分析表明,VCV-M-YZ与已报道的VCV-M属于一个种,无明显的地理分布差异。本研究结果丰富了VCV-M群体的基因...     

菜豆黄花叶病毒中国和叙利亚蚕豆分离物外壳蛋白的序列分析

 病毒病是影响云南省蚕豆生产的重要病害。对采集的蚕豆病毒病标样进行了组织印迹法检测,表明菜豆黄花叶病毒(BYMV)是最主要的病原。据此,以BYMV基因的保守序列设计了一对特异性引物,用BYMV的5个中国云南蚕豆分离物和1个叙利亚蚕豆分离物侵染的蚕豆叶片总RNA为模板,RT-PCR扩增获得了长度为907bp的目标片段。序列分析显示,此片段中包含822bp的外壳蛋白序列。6个分离物间的外壳蛋白核苷酸和推导编码蛋白质的氨基酸序列的同源性分别为86.4%~100.0%和96.7%~100.0%。与GenBank登录的34个具有完整外壳蛋白序列的BYMV分离物进行同源性和系统进化树分析的结果表明,6个分离物在核苷酸和氨基酸水平上与其它分离物的同源性分别为79.1%~97.9%和83.5%~98.5%,BYMV中国蚕豆分离物与日本蚕豆分离物同源性最高。外壳蛋白基因的序列特征揭示,在BYMV中的蚜传相关基序为NAG。     

2种类型的烟草扭脉病毒外壳蛋白基因的序列和结构分析

 烟草丛顶病主要由烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus ,TBTV)和烟草扭脉病毒(Tobacco vein distorting virus ,TVDV)复合侵染引起。其中,TVDV的CP蛋白可分别包装TBTV和TVDV形成病毒粒子;但也存在TVDV单独侵染不携带TBTV的病样。本文利用RT-PCR对自然状态下携带TBTV的TVDV(采自云南弥渡)和不携带TBTV的TVDV (采自云南保山)的cp基因进行序列克隆,发现TVDV弥渡分离物的cp基因为618个核苷酸,而TVDV保山分离物的cp基因为621个核苷酸,二者的核苷酸序列一致性为90.02 %,氨基酸序列一致性为89.81 %;而长度相同的TVDV cp基因序列一致性为98.5 % ~ 100 %。表明这2个cp基因属于2种不同类型。系统发育树分析也表明这2个cp基因属于进化距离较远的2个群。利用SWISS-MODEL进行同源建模,发现2种类型的TVDV CP蛋白的主要空间结构域基本一致,存在细小的结构域及结构域之间无规则卷曲角度的差异,整体空间结构没有发生明显改变。推断TVDV保山分离物CP蛋白中关键氨基酸的序列突变是导致CP无法包装TBTV,从而在病害传播过程中丢失TBTV的主要因素。     

侵染豆类的蚕豆萎蔫病毒(BBWV)的分离和鉴定

 1980年8月~1984年3月,我们于中国农业科学院品种资源所豆类试验圃,土肥所绿肥试验圃和四川省农科院作物所蚕豆试验田。在蚕豆和田青上采到表现斑驳症状的BB-川Mo③、田青Mo①毒株,豇豆上表现坏死花叶症状的C_502NM毒株。     

蚕豆黄化卷叶病的药剂防治

喷药治蚜防病试验中,溴氰菊酯和久效磷对豆蚜(Aphis craccivora)的防效分别达到96.7%和67.1%。两次和三次施用溴氰菊酯的防病效果分别达到84.1%和86.1%,蚕豆产量分别比未施药对照增产17.7%和21.9%。施药也影响蚕豆黄化卷叶病的时间分布型,三次施药小区的病株始终为泊松分布,病害没有再次扩散;未施药小区早春病株就出现负二项分布,越冬前病害已经扩散。豆蚜蚜害率与蚕豆黄化卷叶病发病率密切相关。     

种传蚕豆真花叶病毒的研究

 本文从生物学性状、理化特性、蛋白外壳及血清学特性等方面,比较系统地研究了从安徽蚕豆上分离到的一个种传分离物Bd。根据试验结果,参考国际上报道的文献,作者认为该分离物隶属于蚕豆真花叶病毒(BBTMV)。这是BBTMV在中国的第一次报道。     

RT—PCR检测南方菜豆花叶病毒

根据南方菜豆花叶病毒（ＳＢＭＶ）两株系Ｂ和Ｃ的核酸序列设计两对引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ可以特异地区分纯化的和０．２ｇ病叶中的两株系，ＲＴ－ＰＣＲ检测ＳＢＭＶ－Ｂ的灵敏度为１０ｐｇ。     

四季豆枯萎病病原鉴定及防治

从南宁市郊11个病区采集的四季豆枯萎病株标样,经分离培养鉴定和致病性测定,证明其病原菌为尖孢镰刀菌菜豆专化型(Fusarium oxysporum f.sp.phaseoli Kend & Syd)。此病在南宁于4月上中旬四季豆初花期开始发生,5月中下旬盛花至结荚期为发病高峰期。用滤纸碟法进行药效试验的结果,40%灭病威300—500倍液的抑菌圈最大,田间灌根防治也有一定效果。可用种子重量的0.5%多菌灵可湿性粉拌种。品种间抗病性有显著差异,秋抗19号和秋抗6号较抗病。     

蚕豆染色病毒(BBSV)在中国的发生与鉴定

 在1985年4月蚕豆病毒病的调查中,先后在四川、湖北、江苏和浙江4省的秋播蚕豆试验区内都发现一种由种子带毒的蚕豆染色病毒(BBSV)。所有病株都发生在由叙利亚国际旱地农业研究中心供种的试验区内,约10-40%的小区或品系发病,株发病率在0-18%之间。病害是随种子传入我国的。
病株为系统感染,病株叶片上的症状可以是轻花叶、斑驳、褪色斑或畸形,有的小叶正常而无明显病变。病毒粒体为等径球状体,直径28毫微米。病毒样本能与英g国染色病毒的抗血清发生沉淀反应,但与真花叶病毒的抗血清不发生反应。在病株上未发现能传毒的象甲,也无象甲的为害状,病毒病尚未扩散。在试验区以外的农田里未发现有蚕豆染色病毒存在。     

广西四季豆枯萎病病原的研究

 四季豆(Phaseoli vulgaris)在广西不仅作为重要蔬菜,而且还大量加工成罐头出口,年种植面积达2万多亩。但近年来,枯萎病严重发生,造成很大的经济损失。国外及北京曾报道过此病害。     

四季豆枯萎病病原鉴定及防治

从南宁市郊11个病区采集的四季豆枯萎病株标样,经分离培养鉴定和致病性测定,证明其病原菌为尖孢镰刀菌菜豆专化型(Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli Kend & Syd)。此病在南宁于4月上中旬四季豆初花期开始发生,5月中下旬盛花至结荚期为发病高峰期。用滤纸碟法进行药效试验的结果,40%灭病威300-500倍液的抑菌圈最大,田间灌根防治也有一定效果。可用种子重量的0.5%多菌灵可湿性粉拌种。品种间抗病性有显著差异,秋抗19号和秋抗6号较抗病。     

侵染蚕豆的芜菁花叶病毒的鉴定与提纯

 在江苏浙江等地的蚕豆苗上出现的红褐色环斑或白色斑驳症状.经鉴定是芜菁花叶病毒侵害的结果.在病组织中的病毒粒体为弯杆状.长度750-800nm。摩擦接种在苋色藜上,接种叶上出现大块黄色枯斑,直径约3毫米,顶叶系统感染,在克氏烟、芜菁、油菜上为系统花叶.在蚕豆苗上的症状,视品种和环境条件而异,在有限生长的品种上多为红褐色环斑.在启东蚕豆上多为白色斑驳,豆荚上也可出现变色斑。对病毒的提纯方法作了改进,用冻融的20%蔗糖溶液可代替常规的10-40%蔗糖梯度液,精提纯的效果相同。