TMV侵染烟草诱导寄主产生细胞自噬

 细胞自噬(autophagy)—自体吞噬,是真核生物中一种高度保守并普遍存在的物质循环利用过程。为明确烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染烟草是否引起细胞自噬,本研究利用TMV-U1和普通烟(Nicotiana tabacum cv. Blight yellow)为主要研究材料,利用透射电子显微镜观察、单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染色技术、自噬标记分子ATG8f-ECFP荧光观察和荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分别检测TMV侵染烟草后的烟草细胞内自噬结构的形成、酸性细胞器的存在和细胞自噬相关基因(Autophagy related gene,ATG)ATG3、ATG4、ATG5、ATG6、ATG7、ATG8a、ATG18a的表达特征。结果表明,TMV侵染72 h后,在液泡边际和液泡内发现大量疑似自噬体结构。利用MDC荧光染色和ATG8f-ECFP瞬时表达技术,通过激光共聚焦显微镜观察,在TMV侵染72 h后发现点状荧光信号。TMV侵染48 h后,除ATG5外,烟草ATG3、ATG4、ATG6、ATG7、ATG8a、ATG18a表达均上调并在72 h达到顶峰。表明TMV侵染后感病烟草均可检测到细胞自噬现象,推测TMV侵染普通烟可诱导寄主产生细胞自噬反应。     

电化学酶联免疫分析检测烟草花叶病毒和烟草环斑病毒

以邻苯二胺 (OPD)底物为例 ,用抗原直接包被法 (DAC -ELISA)同线性扫描极谱法 (LSV)相结合 ,检测烟草花叶病毒 (TMV)的提纯液 ,检出限可达 0 2 5ng/ml,TMV粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 2 4 0 0 ;检测烟草环斑病毒 (TRSV)提纯液 ,检出限为 1 0ng/ml,粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 0 0 0 ,该方法的灵敏度比DAC -ELISA光度法提高了 5倍以上     

β-氨基丁酸诱导烟草产生PR蛋白及对TMV的抑制作用

 本文研究了β-氨基丁酸(BABA)诱导系统侵染寄主烟草NC89产生PR蛋白及其对TMV的抑制作用。用5mmol/LBABA对抗性烟和非抗性烟进行叶面喷施处理均可以抑制烟草叶片中TMV的产生,平均抑制率分别达到59%和49%。BABA和SA处理均可以诱导2种烟草叶片中PR1、PR2和PR5基因的表达,其中对PR1的诱导作用相对较强。分别用BABA和SA处理非抗性烟草,在处理后的不同时间内2种药剂对PR1基因的诱导规律基本相同。用BABA和SA分别预处理非抗性烟草2d后接种TMV,2种药剂对烟草叶片中PR1基因的影响是完全不同的,其中,BABA处理后接种TMV抑制PR1基因的表达,在接种后第72h已经检测不到PR1基因的存在,SA处理后接种TMV对PR1基因的影响呈现弱-强-弱的变化趋势,在接种后第24hPR1的表达量达到最强,以后逐渐减弱。试验结果表明:BABA能够提高非抗性烟草对TMV的抗性,但是BABA诱导烟草产生抗TMV的作用机制可能是一种不同于目前普遍公认的SA的作用机制。     

海带多糖对烟草花叶病毒的抑制作用及其对烟草酶活性的影响

为明确海带多糖抗病毒剂对烟草抗烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）病的诱导抗性及其对TMV感染后的保护作用,采用间接酶联免疫吸附法（ELISA）研究0.5 mg/mL海带多糖水剂、0.5 mg/mL香菇多糖水剂、6.25 mg/L氨基寡糖素水剂和0.1 mg/mL盐酸吗啉胍.铜可湿性粉剂对TMV侵染的预防保护作用和对TMV感染植株的治疗作用,并检测施用海带多糖后烟草体内过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化和海带多糖对感染TMV后烟草叶绿素含量的影响。接种前喷施0.5 mg/mL海带多糖后,再接种TMV病毒,其抑制率可达42.42%,与喷施6.25 mg/L氨基寡糖素抑制率44.96%的效果相当,预防保护作用较好;但两种药剂处理感病植株的治疗效果较差,其抑制率仅分别为38.93%和40.13%。海带多糖能够系统地诱导烟草体内POD、PAL及SOD活性,从而控制了感染TMV后烟草叶绿素含量下降。说明海带多糖可诱导植物产生抗病性。     

壳寡糖诱导烟草抗烟草花叶病毒的超微结构研究

 电镜检查表明,接种烟草花叶病毒(TMV)表现系统侵染的烟草植株叶肉细胞和筛管内有大量病毒粒子和病毒结晶体,细胞质中出现髓鞘样结构、多泡体和次级囊泡。叶片薄壁细胞内叶绿体、线粒体等细胞器变形解体,膜结构增生。经壳寡糖(50 μg/mL)诱导处理的烟草,系统症状减轻,叶肉细胞和筛管中病毒粒子显著减少,偶见病毒结晶体;叶肉细胞中细胞器基本完好,但叶绿体内出现较大的淀粉粒;液泡内和细胞间隙出现大量电子致密物质。在未接毒和未经壳寡糖处理的植株中未见此种电子致密物,其产生可能与诱导抗病性表达有关。     

抑制烟草花叶病毒(TMV)植物提取物的筛选

为开发新型植物源抗病毒剂,以抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)活性为指标,利用半叶枯斑法对13种常见中草药进行了抗病毒活性筛选,并对筛选到的中草药进行了抗病机理的研究。结果表明:马蓝、玉簪、鸦胆子、白薇和苦木5种中草药的30μg/mL醇提取物抗TMV活性较好,抑制率均达70.44%以上,且高于8%宁南霉素水剂1 000倍液的抗病毒活性,其中马蓝醇提取物抗病毒活性最佳,抑制率可达90.70%。对马蓝醇提取物防治烟草花叶病毒机理的研究发现,0.5μg/mL马蓝醇提取物能够保护TMV侵染的烟草原生质体细胞形态完整;经马蓝醇提取物处理后,烟草的苯丙氨酸解氨酶和过氧化物酶活性比清水对照组明显提高;20~50μg/mL浓度的马蓝醇提取物能明显抑制TMV病毒外壳蛋白的表达。推测马蓝醇提取物可能是通过保护植物细胞而起到抗病毒作用,可进一步开发为植物源抗病毒剂。     

嘧肽霉素对烟草花叶病毒抑制作用研究

嘧肽霉素和烟草花叶病毒(TMV)等体积混合后接种,对心叶烟的枯斑抑制率为96.5%,对系统寄主NC89的防效为84.9%。在接种病毒前24 h喷施药剂,枯斑抑制率和对系统寄主的防效分别为75.4%和69.5%。接种病毒后24 h喷药试验表明,药剂能在一定程度上抑制进入植株体内病毒的增殖。药剂与病毒混合处理后电镜观察,病毒粒子有断裂现象,混合时间越长,破坏作用越强。嘧肽霉素对TMV具有较强的体外钝化作用,且是不可逆的。     

地高辛标记的cDNA探针检测烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒及马铃薯Y病毒

 根据已发表的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计特异引物,分别以提取的TMV、CMV和PVY侵染的病叶总RNA为模板,反转录PCR进行体外扩增,分别得到长度为0.44、0.77、0.80 kb的目的片段,并克隆到pGEM-T easy质粒载体上,以构建的重组质粒为模板,用PCR方法合成了相应的地高辛标记的双链DNA探针。以合成的探针通过斑点杂交技术检测烟草病叶总RNA和烟草病叶汁液。TMV、CMV和PVY的3种地高辛探针检测各自感染的烟草病叶总RNA的稀释低限分别为1:1000、1:10000、1:320,检测各自侵染烟草病汁液的最大稀释倍数分别为1:100、1:100、1:10,而每种探针与健康烟草和其它2种病毒的反应均为阴性。     

大豆凝集素基因lec-s转化烟草>增强对烟草花叶病毒的抗性

 将编码大豆凝集素的lec-s基因插入植物表达载体pBI121中,构建植物重组表达质粒pBI121:: lec-s。由根癌土壤杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草株系。PCR和RT-PCR检测证明lec-s基因已转入烟草植株中。接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）进行抗病性试验结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,说明转基因烟草表现出对TMV的抗性。定量RT-PCR检测发现,接种TMV后,抗病防卫基因（PR-1a、GST1、Pal和hsr515）在转基因烟草叶片中显著上调表达。这些结果表明,大豆凝集素基因lec-s转化烟草可对TMV产生抗性,其作用机制可能在于lec-s基因参与了植物的防卫信号通路,诱导了抗病防卫基因在转基因植株体内的表达,增强了植株对TMV的系统抗性。     

侵染扶桑的烟草花叶病毒分离物鉴定

从表现叶斑驳症状的扶桑病株上获得一病毒分离物,电镜下可见约300 nm×18 nm的杆状粒子,其与烟草花叶病毒抗血清呈明显的阳性反应,dsRNA约为6.4 kbp。根据烟草花叶病毒(tobacco.mosaic virus,TMV)的RNA序列设计引物,进行RT-PCR检测,扩增出约800 bp的预期特异片段。将PCR产物连接pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,得到了含有目的片段的重组子。序列分析表明,与周雪平等报道的序列(GenBank AJ011933.1)同源性达99％。通过生物学、病毒粒子观察、血清学以及分子生物学实验结果,确定该病毒分离物为TMV。     

基于CP基因的中国云南省烟草TMV群体遗传多样性分析

为探明云南烟草上烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)的群体遗传多样性特征, 本研究使用TMV外壳蛋白(coat protein, CP)基因的特异性引物对采自云南各烟区的疑似烟草花叶病样品进行检测, 通过克隆测序获得138个TMV CP基因序列, 对其进行了一致性比对, 及系统发育、错配分布、遗传变异、群体多样性等分析。变异分析显示, 138条CP基因序列共有变异位点数122个, 占总位点数的25.42%, 变异类型只有核苷酸替换, 核酸多样性为0.018, 单倍型多样性为0.970;一致性比对结果显示, 138条序列的核苷酸和氨基酸序列一致性均为96%～100%; 重组分析未检测到重组信号;对来自云南烟草, NCBI上其他地区烟草及云南地区其他寄主的TMV分离物的CP基因进行系统发育分析, 结果显示, 所有TMV分离物在进化上可分为4个组, 本试验获得的分离物分布在1、2、3组, 其中只有来源昭通地区的分离物倾向于聚成簇, 表明云南烟草TMV分离物的适应性进化受地理适应性所驱动, 与寄主适应性基本无关;错配分布分析显示, 云南烟草TMV群体呈多峰分布, 表明该群体近期未经历群体扩张事件; 群体间遗传分化分析结果表明, 除昭通和曲靖烟草TMV群体与其他TMV群体之间很容易发生遗传漂变促使群体发生遗传分化外, 其余大部分TMV群体之间的基因流都可以抵制遗传漂变。本研究首次报道了云南各烟区TMV分离物群体遗传变异情况, 研究结果可为TMV的抗病育种和制定更为有效的防治策略提供重要参考。     

三环己基氯化锡对烟草花叶病毒的抑制作用

以心叶烟为试材,采用活体钝化法测定了三环己基氯化锡对烟草花叶病毒(TMV)的抑制作用,并通过电镜、琼脂糖凝胶电泳及紫外光谱法分别测定了三环己基氯化锡对TMV、TMV-RNA及TMV-外壳蛋白(TMV-CP)的体外作用。活体钝化结果显示:500 μ g/mL的三环己基氯化锡对TMV的抑制率达到75.77%±0.11% (P<0.01);三环己基氯化锡与TMV体外作用30 min,电镜下观察,显示病毒粒体出现断裂现象,粒体结构遭到破坏;琼脂糖凝胶电泳显示,三环己基氯化锡对TMV-RNA具有体外降解作用;紫外光谱法测定结果表明,三环己基氯化锡对TMV-CP的体外聚合过程具有抑制作用。     

沼泽红假单胞菌蛋白Rhp-PSP对烟草花叶病毒的系统抗性诱导及互作蛋白筛选

本文研究了蛋白Rhp-PSP诱导烟草抗TMV过程中相关防御酶的活性以及丙二醛（MDA）含量的变化，同时测定了抗病相关基因的表达情况。试验证明，蛋白Rhp-PSP处理烟草后，叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性显著提高，但降低了MDA含量。同时基因PR-1、PR-3、PR-5、PDF1.2表达显著上调，证明了蛋白Rhp-PSP具有诱导烟草产生抗TMV的活性。为阐明诱导抗性机制，利用酵母双杂交系统从烟草cDNA文库进行互作蛋白的筛选并验证，结果表明GPI锚定蛋白、VAN3结合蛋白及叶绿素结合蛋白A与蛋白Rhp-PSP互作。     

生防菌Ba33抑制烟草花叶病毒RNA在叶片内积累的研究

采用realtime quantitative PCR方法测定了Ba33胞外蛋白对烟草花叶病毒RNA在叶片内积累的抑制作用,结果显示:与接种TMV+PBS对照相比,Ba33蛋白与TMV混合接种、接种TMV前24h喷雾Ba33蛋白及接种TMV后6h喷雾Ba33蛋白,均能显著抑制叶片内RNA积累,其中以接种前24h喷雾Ba33蛋白抑制效果最好。     

植物源病毒抑制剂VFB诱导烟草抗烟草花叶病毒机理的初步研究

 为揭示植物源病毒抑制剂VFB的抗病毒机理,本研究以VFB对烟草花叶病毒(TMV)进行预防和治疗处理,测定了烟草中与抗病毒性相关的部分生理生化指标的变化。结果表明:VFB的2种处理方式均可使普通烟体内的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、总酚及类黄酮含量升高,使普通烟体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性增强,预防处理优于治疗处理。可见,VFB可诱导植物产生抗病性,增强烟草对TMV侵染的抵抗力。     

Induction of antiviral resistance and stimulary effect by oligochitosan in tobacco

Oligochitosan was applied by spraying it on tobacco leaves for inhibition of tobacco mosaic virus (TMV). The maximum inhibition of TMV by oligochitosan was observed when inoculation occurred at 24 h after spraying 50 μg ml⁻¹ oligochitosan. The production of H₂O₂ and NO in epidermal tobacco cells induced by oligochitosan was investigated by epidermal strip bioassay and LSCM, using cell permeable fluorophore diaminofluorescein diacetate (DAF-2D) and 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (H₂DCF-DA), respectively. Epidermal tobacco cells treated with oligochitosan resulted in a strong increase of intracellular NO and H₂O₂. Oligochitosan and NO donor sodium nitroprusside (SNP) induced the defense reaction against tobacco mosaic virus (TMV), and increased phenylalanine ammonia-lyase (PAL) activity. Co-treatment of the tobacco cells with oligochitosan and NO scavenger CPTIO blocked the inducing resistance. The results indicated that the defense response induced by oligochitosan was connected with NO pathway.     

Incidence and identification of virus diseases of tobacco in three provinces of Zambia

Nine tobacco fields of small- and large-scale farmers in Central, Lusaka and Southern provinces of Zambia with an experimental area in the range of 4–52 ha were surveyed for the incidence, prevalence and identification of virus diseases during the growing season of 1997. Samples were collected from three tobacco fields in each of the three provinces, and a total of 72 samples was analysed. Virus identification was based on field disease syndrome, host range studies, DAS-ELISA and electron microscopy of virus particles in some cases. The study demonstrated the occurrence of Tobacco mosaic virus (TMV), Potato virus Y (PVY), Alfalfa mosaic virus (AMV) and Tobacco ringspot virus (TRSV). TMV and PVY occurred widely and were common in all three provinces, while AMV and TRSV were relatively less common. The prevalence of the four viruses was TMV 78%, PVY 67%, AMV 33% and TRSV 22%. Serological tests for Tomato spotted wilt virus (TSWV) and Cucumber mosaic virus (CMV) showed that these viruses were not present in the tobacco samples analysed.