植物青枯假单胞菌胞外蛋白及其在致病中的作用

 利用Fny-CMV株系RNA3全长cDNA克隆.构建了MP基因全长的、缺失AUG、5'端缺失(111nt)、3'端缺失(124nt)及内部缺失KpnI片段(501nt)5种不同形式的植物表达载体pBMPR、pBMPA、pBMPS、pBMPH和pBMPK。上述植物表达载体在土壤农杆菌LBA4404介导下转化烟草生产品种NC89,获得了所有5种表达载体的转基因植株,并对其分别进行了分子检测和抗病性分析。     

利用青枯菌胞外蛋白输出缺失突变体防治西红柿青枯病的研究

作者采用转座子Tn5诱变植物青枯菌获得了世界首例植物青枯菌胞外蛋白输出缺失突变体(简称eep突变体)。该突变体在缺失了许多胞外蛋白(包括有植物细胞壁降解酶、果胶酶类和纤维素酶类)外输功能后,也失去了对寄主的致病力。因此,该类突变体有可能被应用于植物青枯病的生物防治。本文主要是针对eep突变体在番茄上的定埴能力和生防效果进行研究。     

青枯雷尔氏菌胞外蛋白指纹多态性分析

 采用SDS-PAGE技术对70株不同来源及致病力青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）进行胞外蛋白指纹多态性分析,研究结果表明,供试青枯雷尔氏菌菌株呈现丰富的胞外蛋白指纹多态性,多态性比率为100%。不同来源青枯雷尔氏菌分泌的胞外蛋白不同,EZ-Tn5TM插入诱变菌株电泳出20条不同大小蛋白条带,分子量集中在20~97 kD ,且菌株间蛋白条带相似或完全相同;60Co辐射诱变菌株共电泳出16条不同大小的蛋白条带,多数蛋白分子量44.3 kD;野生型菌株电泳的蛋白条带最多,共获得26条不同大小的蛋白条带。进一步对37株不同致病力的野生型菌株进行胞外蛋白含量测定,结果表明,不同致病力菌株胞外蛋白含量差异大,强致病力菌株分泌的胞外蛋白含量较高,为1.026～5.963μg/mL,无致病力菌株胞外蛋白含量较低,为0.083～0.761 μg/mL。     

青枯假单胞菌的运动性及其在侵染过程中的作用

 本研究调查了分离自不同寄主植物的107株青枯假单胞菌(简称青枯菌,Pseudomonas solanacearum E.F.Smith)野生型菌株,发现30株野生型菌株具有十分明显的游泳运动性和爬行运动性。这是运动性青枯菌野生型菌株的首次发现。     

昆虫病原线虫共生菌胞内外蛋白的提取及杀虫活性比较

通过超声波破碎、硫酸铵盐析等方法从10株昆虫病原线虫共生菌的发酵液中分离出各菌株的胞内和胞外蛋白,测定各蛋白样品含量及其对棉铃虫初孵幼虫的生长抑制毒性,并用Native-PAGE和SDS-PAGE对各粗蛋白组分进行初步分析。结果表明有7个菌株的胞内和胞外蛋白对棉铃虫初孵幼虫生长均显示出不同程度的抑制生长活性。其中以嗜线虫致病杆菌3个菌株CB6、All和Bw活性最强,其胞内蛋白的活性分别达97.1%、97.9%、97.2%,胞外蛋白分别达95.8%9、6.3%、88.6%。不同菌株胞内胞外蛋白产量各不相同。电泳图谱表明,不同菌株间及同一菌株胞内胞外蛋白有差异,但近缘菌株相似。     

茄青枯假单胞菌一个毒性基因突变体的表型分析

花生植株致病性试验表明分离自花生的茄青枯假单胞菌菌株T2015的ORF3突变体T2135/R在花生上的致病性显著降低,说明该基因与病菌在花生上致病有关。T2135/R在培养基中生长繁殖与野生型T2015没有显著差别,T2135/R产生的胞外植物细胞壁降解酶类如纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶与T2015相比没有显著区别,说明该基因与病菌在培养基中的生长繁殖、病菌的胞外植物细胞壁降解酶的产生无关。     

三株昆虫病原线虫共生菌胞外产物的抑菌活性

采用生长速率法、孢子萌发法、活体组织法和盆栽试验对3株昆虫病原线虫共生菌胞外产物甲醇提取物的抑菌活性进行了系统研究.结果表明,3个菌株甲醇提取物对番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、油菜菌核病菌的菌丝生长,对番茄灰霉病菌、玉米大斑病菌、稻瘟病菌、白菜黑斑病菌、杨树溃疡病菌、小麦根腐病菌的孢子萌发均有很强抑制作用.其中嗜线虫致病杆菌YL001菌株对辣椒疫霉病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC50为35.11mg/L;伯氏致病杆菌YL002菌株对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC50为 42.16mg/L;嗜线虫致病杆菌TB菌株对油菜菌核病菌菌丝生长的抑制作用最强,EC50为18.95mg/L.3个菌株甲醇提取物对玉米大斑病菌孢子萌发都有很强的抑制作用,EC50分别为28.03、36.77和26.40mg/L.3个菌株甲醇提取物在1000mg/L浓度下,对离体番茄果实灰霉病的治疗和保护效果均在70%以上;对盆栽番茄灰霉病和辣椒疫霉病的治疗和保护效果均在65%以上.     

水稻纹枯病菌胞外蛋白酶特性研究

植物病原菌产生蛋白水解酶被认为是病原菌侵染寄主的一个重要策略。作者对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn)产生的胞外蛋白酶的特性进行了研究。结果表明,水稻纹枯病菌产生一个分子量约为49.5ku的胞外蛋白酶。该酶对胰蛋白酶专一性底物Benz-Phe-Val-Arg-NA有较高的活性,并能从羧基端降解Arg和Lys。胰蛋白酶抑制剂对该酶活性有较强的抑制作用,表明该蛋白酶是一种类胰蛋白酶。在离体试验下,该蛋白酶可以降解水稻细胞壁蛋白并释放羟脯氨酸。SDS-PAGE电泳分析显示,至少有4个多肽被降解,分子量范围分别在14.4～20.1、20.1～31ku和31～43ku范围内。说明该胞外蛋白酶具有降解水稻细胞壁的能力,因此,该蛋白酶可能在水稻纹枯病菌的致病过程中起重要作用。     

温度和病原接种浓度对番茄青枯病菌侵染的影响

本试验以不同浓度的Pseudomovas solanacearum悬浮液接种番茄品种湘引79-1号(抗)和粤农2号(感),置于不同温度的光照培养箱内,观察发病情况.当菌液浓度为3×108CFU/mL、3×106CFU/mL在温度25℃以上时9天或更短时间就表现青枯病症状,发病的最低温度是22℃,但潜育期较长,需20天,温度30℃与25℃的病情指数没有显著差别,但30℃潜育期短,只需5天.25℃潜育期稍长,则要9天.病情的发展随着菌液浓度的增高而严重,3×108CFU/mL浓度的病情指数最高达90%,3×102CFU/mL浓度的病情指数最低为40%.     

烟草青枯病菌拮抗细菌的筛选、鉴定和抑菌机制研究

青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum造成的烟草青枯病是烟草主要毁灭性病害之一.本研究采用牛津杯法从运城盐湖湖岸土壤中筛选获得一株对烟草青枯病菌具有较好拮抗效果的菌株FY-C;并进一步分析了菌株FY-C的抑菌谱、对青枯病菌的潜在生防效果.结果 显示,经菌株FY-C无菌滤液处理24 h后的青枯病菌细胞壁...     

Molecular Monitoring of hrpB-disrupted Mutant of Ralstonia solanacearum in Tomato Plants

A nonpathogenic mutant of Ralstonia solanacearum was produced by the insertion of transposon Tn4431. The mutagenized gene was then cloned from a genomic DNA library by the gene tagging method, using the labeled lux operon located on Tn4431 of pUCD623 as a hybridization probe. From nucleotide sequence analysis of the transposon-inserted genomic clone, the hrpB gene was shown to be disrupted by the inserted transposon. Tomato plants were inoculated with the hrpB-disrupted mutant bacteria, for which multiplication and translocation were then monitored using the colony hybridization method. In addition, the original pathogenic bacteria in which the lux operon had been functionally ligated with the genomic promoter were also used for inoculation and traced by their bioluminescence. Multiplication of the hrpB-disrupted mutant was suppressed initially in the invaded root tissues and then in upper hypocotyl after translocation, suggesting that the pathogenic strain of R. solanacearum overcomes at least two steps of host responses expressed in root and hypocotyl tissues. Thus, our approach for molecular monitoring of the bacteria enabled us to precisely analyze the infection behavior of the pathogenic bacteria in planta. Received 16 April 1999/ Accepted in revised form 10 August 1999     

茄青枯拉尔氏菌Rs-T02在3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯作用下的差异蛋白分析

为探明3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯(MG)抑制茄青枯拉尔氏菌的机制,利用二维电泳技术,分析了MG作用下茄青枯拉尔氏菌Rs-T02菌株的差异蛋白。结果发现在MG作用下的菌体中检测出29个差异蛋白点。采用质谱技术鉴定出22个差异蛋白,其中新增蛋白11种、缺失蛋白5种、表达上调蛋白1种和表达下降蛋白5种。这些蛋白参与能量代谢、信号转导、物质运输和DNA修复等途径。我们推测,与能量代谢相关的新增蛋白spot 9和缺失蛋白spot 65可能与MG抑制茄青枯拉尔氏菌的机制有关。     

烟草感染青枯菌后的组织病理变化

病症观察表明,烟草感染青枯菌后168h叶片全部萎蔫下垂、褐变。茎部切片表明,青枯菌处理72h,个别导管内出现了染色较深的物质,髓部和皮层的部分薄壁细胞出现破损。120h后导管内染色较深的物质增多,导管堵塞程度加大。168h后局部区域的木质部和韧皮部分离。对感病植株的叶进行青枯病菌分离,结果表明:从叶中可分离出致病青枯菌,并可以导致复感植株得病继而死亡。     

辣椒青枯病拮抗菌株的筛选及田间防效的测定

用抑菌圈－定殖力双重测定法筛选出6个定殖密度大于10^5cfu/g根，抑菌能力亦较强，同时又极易于人工培养的菌株，作为青枯病的潜在生防菌株。温室试验，防病效果分别达83.4%(J2)、91.6%(J3)、58.4%(FH17）、75.0%(BB11)、66.6％（BT4）和41.6%（BT6），增产效果为21.3%-110.1%，其中以J3增产效果最为显著，BB11次之。1996年在南京和淮阴两地的辣椒青枯病小区进行试验，移栽40d后各菌株平均防效分别为：66.0%(J2)、61.6%(J3)、58.2%(FH17)、62.4%(BB11)、72.8%(BT4)和37.1%(BT6);平均增产效果为45.7%(J2)、76.5%(J3)、32.4%(FH17)、78.5%(BB11)、29.3%(BT4)和19.0%(BT6)。     

青枯雷尔氏菌温度相关致病基因yqhE功能研究

不同温度下青枯雷尔氏菌表达谱PPI网络分析发现,yqhE可能是青枯雷尔氏菌新的温度相关致病基因。克隆青枯雷尔氏菌CBM613的yqh E基因,结果发现该基因长度为831 bp,共编码276个氨基酸。基因敲除结果显示,28℃培养的yqhE突变株较野生型菌株致病力降低,病程延长,但并未彻底丧失致病力。20℃和28℃培养的yqh E突变株维生素C的生物合成皆被抑制;与28℃相比,20℃培养下野生型菌株维生素C的合成能力降低。突变株在20℃和28℃培养下甲基乙二醛（MG）和丙二醛（MDA）明显积累,其中20℃积累更多;20℃培养的野生型菌株MG和MDA比28℃积累更多。维生素C的生物合成被抑制导致青枯雷尔氏菌自由基清除能力减弱与氧化应激反应增强,MG和MDA积累产生细胞毒性,上述结果可能与28℃培养的突变株致病力减弱,20℃培养的野生型菌株致病力丧失有关。综上结果表明yqhE是青枯雷尔氏菌温度相关致病基因。     

青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系统基因簇功能研究

Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)是革兰氏阴性细菌中新近发现的分泌系统,控制细菌的毒性和蛋白泌出。本试验构建了植物青枯菌Po82菌株的T6SS基因簇完全缺失菌株,从全局水平初步分析了T6SS的功能。与野生型菌株相比,T6SS基因簇的缺失导致了突变菌株运动能力显著增强,在接种前期突变株病情指数明显下降;通过qRT-PCR分析Ⅲ型分泌系统效应子基因,其中popA、popB和popP基因表达量上调,而popC表达水平下调。T6SS基因簇的缺失影响了Po82菌株的运动能力和Ⅲ型效应子基因的表达,使得Po82病程延长。这些结果说明,T6SS参与青枯菌的致病过程,且T6SS与T3SS之间有复杂的未知调控关系。     

烟草青枯病菌分离株RSXJ-1的培养性状及其生物型鉴定

从江西省峡江县烟区采集呈典型症状的青枯病烟株,采用平板梯度稀释分离法分离获得一株病原菌分离株,命名为RSXJ-1。在完成致病性测定的基础上,通过分子生物学方法将该菌株鉴定为茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。本文研究了该菌株在不同培养基上的培养性状,结果表明该菌株的培养性状与R.solanacearum的培养性状相一致;对该菌株进一步进行生物型研究,结果显示该菌株能利用乳糖、麦芽糖、纤维二糖、甘露醇和山梨醇氧化产酸并能还原硝酸盐;而不能利用甜醇氧化产酸,据此将该菌株鉴定为生物型Ⅲ-1。     

PMA-qPCR定量检测青枯菌活菌方法的建立

本文将叠氮溴化丙锭(PMA)与荧光实时定量PCR技术相结合,建立了一种适于青枯菌不同小种菌株活细胞精准、快速检测的PMA-qPCR方法。通过单因素变化试验对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了PMA终浓度为15 ng/μL,黑暗孵育时间为10 min,曝光时间为5 min的PMA预处理体系。试验结果表明,当活菌比例大于10%,PMA-qPCR的测定结果均在理论活菌数相对应的95%置信区间内。检测灵敏度测试结果显示,该方法适用于活菌数在5.0×10~2～5.0×10~8 cfu/mL范围内菌悬液的检测。本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范围内有效去除青枯菌死菌的干扰,定量检测出活菌数量,研究结果可为植物细菌性青枯病的流行规律研究提供新的技术支撑。     

大蒜根系分泌物对烟草青枯病的影响

为探讨大蒜根系分泌物对烟草青枯病菌的抑菌活性,采用抑菌圈法和盆栽试验研究了大蒜根系分泌物及其主要成分对烟草青枯病的影响。结果表明：大蒜根系分泌物浓度为1g/mL时,对烟草青枯病菌抑制效果最好,其抑菌率为53.67%。大蒜根系分泌物4种成分的抑菌效果由强到弱依次为：2,6-二异丙基苯酚>二烯丙基二硫>2,6-二叔丁基对甲酚>邻苯二甲酸二丁酯。其中,2,6-二异丙基酚对烟草青枯病菌的抑制作用最强,在1和5mmol/L时的抑菌率分别为99.66%和100.00%;在盆栽试验中也具有较好的防治效果,接种后7 d和14 d后,其防效分别为34.75%和31.35%。因此,大蒜根系分泌物及其成分均对烟草青枯病有明显的抑制作用。本研究揭示了大蒜作为轮作或间作作物对烟草青枯病的防控机理,以及大蒜根系分泌物和2,6-二异丙基酚作为烟草青枯病防治剂的潜力。