探究粪肠球菌CylA在鼠脑微血管内皮细胞中的表达及验证

为探究粪肠球菌CylA基因对血脑屏障的影响,本试验选取粪肠球菌的CylA为目的基因,用PCR技术获取CylA基因片段与pMD@19-T Simple Vector过夜连接后转化至Dh5α中,经含Amp培养基筛选后进行PCR扩增并鉴定,对阳性菌株进行培养并提取其质粒,用酶BamhⅠ和酶XhoⅠ对提取的质粒和pcDNA3.1/Myc-his分别进行双酶切,将阳性质粒转染至鼠脑微血管内皮细胞中。采用实时荧光定量PCR和Western Blot技术对鼠脑微血管内皮细胞中CylA的表达进行检测及验证。结果显示,CylA全长约707 bp。重组真核质粒经双酶切后分别得到一条5500 bp和700 bp左右的条带。荧光定量结果显示,CylA基因42 h差异不显著（P＞0.05）|30、36、48 h差异显著（P＜0.05）,且36 h的表达量最低。同时Western Blot也扩增出阳性条带。由此可知,粪肠球菌CylA基因可在鼠脑微血管内皮细胞中表达,并呈现先下降后上升的趋势。本试验为进一步研究其致病机制提供理论参考。[关键词]粪肠球菌|CylA|荧光定量     

致羔羊脑炎粪肠球菌聚集物质Asa1基因的克隆与序列分析

以致羔羊脑炎粪肠球菌基因组DNA为模板,PCR扩增聚集物质Asa1基因的部分片段,将PCR产物克隆至pMD19-T载体上,通过PCR和双酶切鉴定后进行序列测定。测定序列与GenBank上已公布的医学临床来源肠球菌聚集物质Asa1基因相应序列的同源性在94%以上。结果表明,兽医临床和医学临床两种来源肠球菌聚集物质基因部分序列同源性极高,提示这两种来源的肠球菌之间存在着一定的联系。     

致羔羊脑炎粪肠球菌的分离鉴定

为确定某羊场导致羔羊脑炎的病原,对从3只病死羔羊脑、肝、脾、淋巴结等组织中分离到革兰阳性球菌,采用生化试验、PCR检测、16SrRNA序列分析、进化树分析、药物敏感性及小鼠致病性测定进行鉴定。结果表明,分离菌符合粪肠球菌的生物学特性;对小鼠致病性较强;对庆大霉素、红霉素、克林霉素、万古霉素等有较强的耐药性,对呋喃妥因极敏感,对青霉素、氨苄西林、环丙沙星等敏感;应用DNA Man软件对分离株WS1、WS2、WS3、WS4、WS5 16SrRNA基因序列进行同源性比对,结果与GenBank数据库中粪肠球菌(NR-040789.1)的同源性分别为99.2%、99.0%、98.5%、98.5%和98.8%;经MEGA4.0软件分析的分子系统进化树(N-J法)表明5株分离菌与粪肠球菌之间的亲缘性最近。说明该羊场导致羔羊脑炎并死亡的病原为粪肠球菌。     

绵羊肺炎支原体溶血素TlyC基因的克隆及分子特征分析

根据GenBank报道的绵羊肺炎支原体(MO)基因序列,设计特异性引物,对MO新疆分离株(MO XJ)溶血素TlyC基因进行克隆及测序;并对该基因及其编码蛋白进行分子特征分析,并与其他支原体相应序列进行同源性分析,构建该基因系统进化树。结果表明,TlyC基因全长为1 239bp,编码426个氨基酸,其中第1~23位氨基酸残基为信号肽,编码区含有跨膜结构域和CBS结构域,二级结构以α-螺旋为主。系统发生分析表明,MO与猪肺炎支原体232株和絮状支原体的相应序列亲缘关系较近,而与其他种支原体的亲缘关系较远。研究首次克隆了MOTlyC基因,为了解MOTlyC生物学功能及其致病中的作用奠定了基础。     

绵羊人工感染粪肠球菌的病理组织学观察

用粪肠球菌人工感染羔羊,复制粪肠球菌病病理模型。病理组织学观察可见病羊大、小脑有微血栓形成;大脑有噬神经和卫星化现象;肝细胞、肾小管上皮细胞变性、坏死、肾间质出血;脾脏的动脉周围淋巴鞘出现有许多上皮样细胞组成的上皮样细胞结节。结果表明,粪肠球菌引起羔羊出现的神经症状是非化脓性脑炎引起的,同时还伴随败血症变化。     

羊源肠球菌溶血素产生条件的优化

为了了解肠球菌产生溶血素的最佳条件,通过在不同培养基、培养时间、酸碱度、温度、20mL／L浓度接种剂量．血清浓度和红细胞浓度等条件下,观察羊源肠球菌溶血素产生的变化。结果表明,种子液以2％接种THB,在pH8．5,40℃静置培养12h～24h,溶血能力较好。     

绵羊及其环境中肠球菌生态分布的调查研究

对新疆生产建设兵团农五师84团与90团、农八师新业羊场及142团羊场健康绵羊的鼻拭、肛拭、青贮饲料、棉籽壳、饮水以及周围环境中的土壤进行检测.共检测220个样本,分离得到47株革兰氏阳性、成双或链状排列的球菌;经培养特性、生化特性鉴定,并针对肠球菌高保守的特异性tuf基因,设计的特异性引物对这47株分离株进行PCR扩增,对扩增产物进行分析.结果有4株为非肠球菌,其余43株均为肠球菌.结果表明羊体及其周围环境中肠球菌分布率达19.5%.     

致羔羊脑炎粪肠球菌 XJ05 LuxS 基因的克隆与原核表达

采用 PCR 技术从致羔羊脑炎粪肠球菌 XJ05基因组中扩增得到 LuxS 基因的全序列,对其进行分析,同时与其他细菌相应基因序列及编码的氨基酸进行同源性分析;构建该基因的原核表达载体,对表达蛋白进行鉴定。结果显示,该粪肠球菌 XJ05的 LuxS 基因全长459 bp,编码152个氨基酸,具有功能序列HXXEH,核苷酸同源性与 GenBank 上的枯草芽胞杆菌和粪肠球菌 V583同源性最高,分别为61．2％和100％;构建的重组质粒经诱导后表达分子质量为20 ku 的蛋白质,Western blot 检测显示特异性条带。说明 XJ05的 luxS 基因与肠球菌 V583和枯草芽胞杆菌亲缘关系较近,表达的重组蛋白具有良好的反应原性。     

致羔羊脑炎肠球菌与羔羊正常菌群肠球菌生物学特性的比较

对致羔羊脑炎肠球菌和羔羊正常菌群肠球菌进行培养特性、生化特性、溶血特性、药物敏感性以及拥有毒力因子基因种类与分布进行比较,结果表明2种不同来源羔羊肠球菌的培养特性和生化特性基本一致.致病菌均对链霉素、庆大霉素、红霉素等抗生素耐药,1株正常菌对四环素、红霉素及链霉素耐药.11株致病性肠球菌中有5株菌同时检测到esp、cyIA、asa1、ace、efa、EF0591和EF3314等7种毒力因子基因,2株菌没有检测到其中任何毒力因子基因.30株正常菌有3株菌存在gelE和EF3314,l株菌同时存在gelE、EF3314和asa1 3种毒力因子基因.正常菌群株3种毒力因子基因片段序列与GenBank中登录的相应序列同源性在95%以上,与致病株相应序列同源性在96%以上.致病菌能导致小鼠死亡,而正常菌群肠球菌则不能引起小鼠的死亡.     

东北黑熊源粪肠球菌EfaA基因的克隆表达及生物信息学分析

为检测熊源粪肠球菌心内膜炎抗原（EfaA）基因,用于快速检测东北黑熊粪肠球菌感染病例,本试验根据GenBank登录的粪肠球菌EfaA基因序列（登录号：U03756.1）合成了1对PCR引物,通过PCR法扩增合成长度为689 bp的目的片段。将PCR产物克隆于pMD19-T载体,之后将其转入大肠杆菌DH5α感受态细胞筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD19-T-EfaA并进行PCR、酶切鉴定、序列测定及蛋白质结构预测。结果显示,本试验成功克隆出熊源粪肠球菌EfaA基因,与GenBank登录的ATCC 29212菌株同源性为100.0%。本试验成功构建了重组克隆载体pMD19-T-EfaA,并对测序结果进行了蛋白质结构的预测,为进一步建立黑熊粪肠球菌病的诊断方法提供了理论依据,同时也为黑熊疾病的防制奠定了基础。     

猪伪狂病病毒粤A株gE基因的克隆与序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物,对PRV粤A株gE基因进行了PCR扩增,PCR产物克隆到PMD18-T载体.对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性,并与2株不同来源的毒株进行了同源性分析和比较.     

3株新城疫病毒广西分离株L基因的克隆与序列分析

根据GenBank登陆的新城疫病毒L基因序列,设计了3对引物(L1和L2、L3和L4、L5和L6)。用RT-PCR技术对3株新城疫病毒广西分离GX7/02、GX9/03、GX11/03的L基因进行了分段扩增和克隆,并对克隆出来的3个片段进行序列测定,用DNAstar软件比较分析后进行拼接,得到长约为6.8 kb、包含有L基因全长的核苷酸序列。L基因的RNA全长为6 704 bp,拥有一个6 615 bp的开放阅读框,推导其编码的氨基酸数为2 204个。氨基酸同源性分析表明广西分离株之间同源性为98.6%~98.7%;与ZJ1株同源性为98.8%~98.9%;与La-Sota、B1、F48E9、HB92同源性为92.0%~94.2%。     

牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆与序列分析

为分析吉林省流行的牛瑟氏泰勒虫基因序列，根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因序列设计合成一对引物，用PCR方法扩增出牛瑟氏泰勒虫的基因片段，并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-TEasy载体上，将经EcoRⅠ酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序。结果表明克隆的基因片段长度为868bp，编码283个氨基酸，有2个潜在的糖基化位点。核苷酸同源性分析表明，该基因片段与韩国株（AF521557）、日本株（AB016280）、俄罗斯株（AB016279）的核苷酸序列同源性分别为99．4％、88.0％、88．1％。     

奶牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆及序列分析

研究根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白的基因序列设计合成1对引物,用PCR方法扩增出了牛瑟氏泰勒虫的基因片段,将该基因纯化后连接到pMDl8-T栽体上,进行序列测定和分析,并用此方法对延边某奶牛场10头奶牛进行了检测.结果表明:10份样品中9份为阳性,所扩增的目的基因核苷酸长为868 bp,共编码283个氨基酸;该段基因片段与牛泰勒虫韩国株核苷酸序列同源性为99.4%,氨基酸同源性为99.3%.     

绵羊痘病毒P32基因克隆与进化分析

利用PCR技术扩增出羊痘病毒结构蛋白P32基因,并进行同源性比对及进化分析.结果表明,该病毒与其他绵羊痘病毒与山羊痘病毒同源性分别为99％与96％.     

油茶SOD基因片段克隆及序列分析

摘要：根据已报道的多种植物Cu/Zn SOD和Mn/Fe SOD基因的氨基酸序列的保守区域分别设计简并引物,以油茶（Camellia oleifera）叶片总RNA为模板,通过RT PCR分别扩增得到一个375 bp的Cu/Zn SOD基因片段和一个429 bp的Mn/Fe SOD基因片段。将片段序列在NCBI网站上进行同源性比对,表明本研究克隆的结果均与多种植物的Cu/Zn SOD和Mn/Fe SOD基因存在亲缘关系,因而认为所克隆的基因片段就是油茶SOD基因;并运用DNAStar5.0软件分别进行序列分析,推导的氨基酸序列分别为125个残基和143个残基;具有所有植物SOD基因共有的保守区域;与多种植物Cu/Zn SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均分别在80%和84%以上,与其他植物的Mn/Fe SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在84%和86%以上。     

斯氏副柔线虫线粒体CO1基因的克隆与序列分析

为研究斯氏副柔线虫(Parabronema skrjabini)种间遗传标记特点,从内蒙古地区骆驼皱胃中采集斯氏副柔线虫成虫,提取虫体DNA,利用线虫通用引物扩增细胞色素氧化酶1(CO1)基因,将其克隆到pMD19-T载体后,用PCR技术鉴定阳性菌落并进行测序,运用DNAStar 5.0和MEGA 4.0软件将测序结果与GenBank公布的相关线虫CO1序列进行比对分析。结果显示:斯氏副柔线虫DNA扩增出的CO1基因序列片段长度为689 bp。同其他相关属线虫CO1基因序列比对,斯氏副柔线虫与小口柔线虫(Habronema microstoma)、蝇柔线虫(Habronema muscae)的同源性最高,为86.7%,遗传距离为0.143;与加利西亚光丝虫(Litomosoides galizai)的同源性最低,为80.1%,遗传距离为0.229。通过两种不同方法建立的系统发育树比较,证实斯氏副柔线虫与柔线属线虫均位于同一分支,自展值都在47%以上。表明CO1基因不仅可以作为斯氏副柔线虫理想的种间遗传标记,也可为该线虫进一步的分子分类学研究提供重要基础。     

北极狐白介素-18基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的犬白介素-18（IL-18）基因序列,设计了1对特异性引物。将北极狐外周血淋巴细胞经植物血凝素（PHA）诱导,用TRIzol裂解,提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增狐狸IL-18基因,连接pMD18-T载体,转化DH5d感受态细胞,获得阳性重组质粒。核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长590bp,含582bp的开放阅读框,编码193个氨基酸,与已知犬IL-18序列的同源性高达98．7％,氨基酸同源性为96．4％。     

蛔虫抗原基因ALAg克隆及序列分析

为了确定蛔虫基因工程疫苗的候选基因,试验以蛔虫幼虫的RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出ALAg基因,扩增产物克隆到pMD18-T载体,筛选阳性克隆测序并进行Blast分析。结果表明:该基因与GenBank公布的猪蛔虫As37抗原基因(AB078971)的同源性为95%,与西式贝蛔虫Ag3抗原基因(EU927450)的同源性为92%。说明ALAg基因是线虫特有的抗原基因。     

鹌鹑新城疫病毒分离株F基因的克隆和序列分析

研究以新城疫鹌鹑分离株(LA005)的基因组RNA为模板，应用RT-PCR技术扩增出其F基因的主要功能区片段，并进行了克隆和序列分析。结果表明：所扩增的目的片段长度为813bp，裂解位点氨基酸序列为112R-T-Q-R-R-Fll7，和F48E9标准强毒株的核苷酸和氨基酸的同源率分别为98．9％和98．5％，Cys残基位点和糖基化位点的数目和位置完全一致，说明该分离毒是一株和F48E9标准强毒株亲缘关系很近的强毒株。