GFP标记的马铃薯大丽轮枝菌生物学特性研究

为了研究马铃薯黄萎病菌的侵染机制,将绿色荧光蛋白基因(GFP)通过农杆菌介导的遗传转化方法转入马铃薯黄萎病菌VD012中,经过潮霉素选择性培养基的筛选和分子鉴定,获得了47株有绿色荧光信号的阳性转化子。随机挑取8株阳性转化子,以野生型菌株为对照,对转化子的菌落形态、菌丝的生长速率、产孢量、粗毒素含量和致病力进行了研究。结果表明,8株阳性转化子中有3株微菌核产生的数量明显高于野生型,1株转化子微菌核产生量低于野生型菌株;各阳性转化子的生长速率和野生型菌株差异不显著;阳性转化子的产孢量与对照相比,有2株差异不显著。其余均有不同程度的降低。保湿培养8 h,所有阳性转化子的平均萌发率低于野生型菌株。相比对照,粗毒素的含量表现为升高趋势的转化子有7株,1株表现为下降趋势。致病力测定的结果表明,致病力增强的转化子有1株,2株转化子的致病力呈现降低的趋势。     

我国棉花大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)电泳图谱分析

对24株来自不同地区、作物的不同致病类型的大丽轮枝菌,进行了同工酶和可溶性蛋白电泳图谱分析。结果表明,24株大丽轮枝菌苹果酸脱氢酶酶谱具有种的特异性,酯酶酶谱具有属的特异性。谷氨酸脱氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶和可溶性蛋白电泳图谱与病菌的致病类型有关,可将24株大丽轮枝菌分为2群,群Ⅰ包括20个菌株,均属于中等致病力或弱致病力的非落叶型菌系;群Ⅱ包括4株菌,均属于强致病力的落叶型菌系。     

江苏省大丽轮枝菌(Verticillum dahliae)营养体亲和性研究

用硝酸还原酶缺陷型(Nit)突变体技术,对来自江苏省80年代及1991年不同菌株进行了营养体亲和性研究。80年代的65个大丽轮枝菌菌株经含氯酸钾培养基诱导,表型鉴定获得突变体A型(Nit 1)73株,B型(Nit M)77株,C型27株,其它类型4株。亲和性测定表明,仅一株(VD8)与国外落叶型群相亲和,属同一亲和群,其余菌株为非落叶型群。对1991年的35个菌株诱导获得78个A型突变体,19个B型突变体。有5个菌株与国外落叶型群相一致,呈强亲和性反应,其中JC1B及SY12两菌株获得A、B两型突变体,可成为我国的落叶型的标准菌株。     

一株大丽轮枝菌拮抗细菌7-47菌株的分离与鉴定

 从全国各地棉田采集土样,筛选对棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）具有拮抗作用的芽孢杆菌菌株。通过初筛得到具有拮抗作用的菌株68株,复筛选出1株拮抗活性较高的菌株7-47,并通过生理生化试验,形态特征的观察及16S rDNA的序列分析对其进行了鉴定,认为菌株7-47属于漠海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）。     

农杆菌介导转化大丽轮枝茵的体系优化

为了揭示大丽轮枝菌的遗传变异和致病机理,以含潮霉素为抗性筛选标记、绿色荧光蛋白GFP为报告基因载体,优化了农杆菌介导转化大丽轮枝菌的遗传转化体系,获得了大丽轮枝菌菌株V991和BP2含绿色荧光蛋白GFP的转化子,转化率达到100×10-6～550×10-6.优化的转化条件为:农杆菌以IM液体培养基调节浓度至OD600=...     

中国农科院首次揭示大丽轮枝菌导致棉花落叶致病机理

<正>中国农科院农产品加工研究所所长戴小枫研究员领衔的有害生物防控创新团队,经过多年对涉及8科、600多种寄主植物的大丽轮枝菌的跟踪研究,首次揭示了这一被称为植物"癌症"病原的真菌引起寄主落叶直至减产绝收的机理,为生物防治该菌、阻断棉花等作物黄萎病蔓延提供了新的靶点。相关研究成果日前在线发表于国际期刊《新植物科学家》。据介绍,大丽轮枝菌是一种毁灭性     

大丽轮枝菌致萎毒力指示菌的筛选及拮抗作用初探

为了筛选可指示Verticillium dahliae致萎毒素毒力大小的指示菌,并对致萎毒素抑制指示菌生长的机理进行初步探讨,采用指示菌平板打孔法,对黑曲霉(Aspergillus niger)BF-3758、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等12种具有微生物种属代表性的菌株进行筛选;采用拮抗试验、致萎试验结合显微观察的方法,初步探索了Verticillium dahliae致萎毒素对指示菌生长的抑制作用。结果表明,Verticillium dahliae粗毒素对Aspergillus niger BF-3758的生长具有较强的抑制作用,且该抑制作用和粗毒素对离体叶片的致萎作用具有一致性,并存在一定的量效关系,Aspergillusniger BF-3758菌株可以作为Verticillium dahliae致萎毒素的毒力指示菌;Verticillium dahliae粗毒素可抑制Aspergillus niger BF-3758的孢子萌发和菌丝生长,对成熟菌丝也有破坏作用。上述研究可为评价Verticillium dahliae的致病力提供一种操作简便、耗时短、费用低的生物学方法。     

大丽轮枝菌致病缺陷型T-DNA插入突变体的筛选与鉴定

【目的】从大丽轮枝菌T-DNA突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hiTAIL-PCR(High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR)技术分别对筛选获得的9个致病力显著降低的突变体进行拷贝数和侧翼序列分析。【结果】与接种野生型Vd991的棉花相比,接种突变体的棉花的病情指数极显著降低。Southern杂交表明其中1个突变体中T-DNA为双拷贝插入,其余8个突变体均为单拷贝插入。生物学特性分析发现T-DNA的插入导致这些突变体在生长速率和产孢量等方面与野生型Vd991相比均有不同程度的降低。Blast比对分析明确了这些突变体中T-DNA的插入位置和在基因组上的分布,并从野生型菌株Vd991中成功克隆得到了这些可能影响大丽轮枝菌致病力的相关基因。【结论】筛选和鉴定T-DNA插入突变是在全基因组范围内快速获得致病相关基因信息的1种有效方法,极大的促进了大丽轮枝菌的致病分子机制等研究,为进一步培育抗病棉花品种奠定了基础。     

几种氨基酸铜对大丽轮枝菌产生毒素蛋白的影响

用几种氨基酸铜溶液处理大丽轮枝菌,阴离子交换层析分离培养液中的毒素蛋白,并进行棉苗的致萎实验,比较了各氨基酸铜制剂对大丽轮枝菌毒素蛋白产生的影响。实验表明,丙氨酸铜、甘氨酸铜、谷氨酸铜和复合氨基酸铜都在一定程度上抑制了大丽轮枝菌微菌核的形成和毒素蛋白的分泌,而苏氨酸铜促进了毒素蛋白的分泌。说明复合氨基酸铜的抑菌作用是各成分协同作用的结果。     

贝莱斯芽孢杆菌SZAD1对大丽轮枝菌的生物防治效果

【目的】黄萎病是棉花的主要真菌病害,缺乏高抗品种和安全有效的化学杀菌剂。生物防治黄萎病对棉花生产具有重要意义。本研究旨在探讨棉花内生细菌对大丽轮枝菌的拮抗活性和生物防治潜力。【方法】通过16S r DNA与gyr B序列分析,对菌株SZAD1进行鉴定。在平板对峙试验中检测SZAD1对黄萎病菌VD080菌丝生长的抑制能力,通过种子浸泡和灌根检测对黄萎病的防效。制备含羧甲基纤维素或几丁质的琼脂平板培养基来检测菌株能否分泌纤维素酶和几丁质酶,并用二硝基水杨酸试剂法测定酶活性。【结果】SZAD1属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。SZAD1菌株能显著抑制VD080菌丝生长,种子浸泡法和灌根法处理中SZAD1菌株对棉花黄萎病的防效分别为60.10%和56.00%。SZAD1菌株能产生纤维素酶和几丁质酶,在培养72 h时达到最大酶活性。该菌发酵72 h的上清液抑菌效果最强。加入25 mg·L^-1和50 mg·L^-1的SZAD1发酵上清液后,液体马铃薯葡萄糖琼脂培养基中的VD080孢子含量分别较对照降低了30.20%和96.53%...     

河北省棉花黄萎病菌致病性的研究

在棉花苗期采用塑料营养钵底部定量注菌液法接种，于昼温２５～２６℃，夜温２０～２２℃的人工培养室中测定了自河北省重点植棉县分离的４０个棉花黄萎病菌单孢菌系和外地５个菌系的致病性。以中棉石系亚、海岛棉海７１２４、陆地棉９３抗１２、辽棉５号、冀棉１１号、农大３６５６个品种为鉴别寄主，以病情指数作为划分抗、感类型的标准，根据在鉴别寄主上的反应，４５个供试菌系可被划分为致病力强的Ⅰ型、致病力中等的Ⅱ型和致病力弱的Ⅲ型，分别占５３．５％、２８．９％、１７．８％。Ⅰ型菌系除使中棉表现抗（耐）病外，海岛棉和陆地棉均表现感病。该类菌系遍布冀中南棉区，其中有７个菌系可使部分品种表现落叶，证明河北省已有落叶型菌系存在。试验还表明，海７１２４、９３抗１２、冀棉１１号和农大３６５４个棉花品种对黄萎病鉴别力较强，可作为鉴别寄主加以应用     

河南省不同地区棉花黄萎病菌分离物致病性及其毒素致萎活性测定

在河南省不同地区分离并鉴定33株棉花黄萎病菌分离物,并进行了致病力和粗毒素致萎活性测定。致病力结果表明,河南省棉花黄萎病菌分离物可分为强、中、弱3种致病力类型,分别占48.5%、21.2%、30.3%。河南省同一地区内不同分离物间致病力差异明显。粗毒素致萎活性测定结果表明,黄萎病菌强致病力分离物分泌的粗毒素对棉苗的致萎力较强,弱致病力分离物分泌的粗毒素对棉苗的致萎力较弱,强、中、弱3种致病力类型分离物在72h时对棉苗的平均致萎指数分别为63.82、52.38、45.83。采用考马斯亮蓝法测定不同分离物粗蛋白含量,结果表明,不同黄萎病菌分离物分泌的粗蛋白含量存在明显差异,且与其所致的病情指数呈显著正相关。     

来源于耐旱荒漠植物蛋白CkND对棉花黄萎病的抑制作用及其抗旱性研究

 利用蛋白组学策略分离了荒漠植物-牛心朴子（Cynanchum komarovii）抗病、抗旱功能相关蛋白CkND。以棉花黄萎病菌为供试菌株,研究了蛋白CkND对棉花黄萎病的抑制作用。结果表明：蛋白CkND对棉花黄萎病菌菌丝生长及孢子萌发具有较好的抑制作用。离体试验中,100 mg·L^-1的蛋白CkND对棉花黄萎病菌菌丝生长抑制效果在24 h、48 h、72 h分别为79.53%、83.01%、87.50％,35 mg·L^-1的蛋白CkND对孢子萌发抑制率为100%;活体试验中,蛋白CkND对棉花黄萎病具有显著的防治效果。另外,本研究将CkND基因构建到pCAMBIA1304表达载体CaMV35S启动子下游,将pCAMBIA1304-CkND通过农杆菌介导转化法转入野生型拟南芥植株中。将33个株系的转pCAMBIA1304 -CkND的 T₂代拟南芥和21株转pCAMBIA1304的T₂代拟南芥,同时进行抗旱性试验。结果显示,转pCAMBIA1304 的T₂代拟南芥14个株系枯死,而转pCAMBIA1304-CkND的 T₂代拟南芥有24个株系的转基因植株存活,且叶片保持绿色,植株生长良好,根系、须根发达,须根数目明显增多。转pCAMBIA1304-CkND拟南芥株高增加了30%,显著提高了植物抗旱性。     

棉花黄萎病拮抗细菌LC-04菌株的抗菌蛋白产生条件研究

LC-04菌株是从棉花叶部组织中分离出的一株类芽孢杆菌,其发酵液上清液的硫酸铵沉淀物对大丽轮枝菌V-190菌株的生长具有明显的拮抗作用,实验证明发酵液中含有蛋白质类抗菌物质。LC-04菌株的适宜发酵条件为:在pH7的LBG培养基中于30℃,180 r.min-1摇床振荡培养48 h,用70%硫酸铵对LC-04菌株发酵液上清液进行盐析,可以沉淀最多的抗菌蛋白。     

新疆棉花黄萎病菌致病性分化的研究

对新疆主要植棉区的30个棉花黄萎病菌菌株及陕西省农科院植保所赠送的4个标准菌株进行致病性分化和营养亲和性研究。结果表明,新疆棉花黄萎病菌致病性分化明显,可分为强、中、弱3种类型,34个菌株中的32个菌株可分为2个亲合群,另外两个菌株暂未划定亲合群。     

棉花黄萎病菌VdSge1基因的敲除与功能分析

为了明确棉花黄萎病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)的VdSge1基因功能,本研究利用基因同源重组原理,通过构建敲除载体,对棉花黄萎病菌落叶型强致病力菌株V592的VdSge1基因进行了敲除,获得了4个目标基因敲除的突变体;以野生型菌株V592为对照,通过对敲除突变体生物学性状和致病性测定,结果表明,突变体的菌落生长速度、产孢量明显高于野生型,并且丧失对棉花的致病性。利用q RT-PCR对其他基因在突变体中的表达情况进行分析,结果表明,VdSge1基因敲除后,VMK1、VGB和VdGARP1的表达量随之下降,而VDH1和PevD1的表达却明显上升。由此说明,VdSge1基因与大丽轮枝菌的菌落生长速度、产孢量及致病性密切相关,并且可以影响其他一些基因的表达。     

荧光标记基因转化棉花黄萎病菌及标记菌系选育

为了研究黄萎病菌的侵染机制,通过农杆菌介导的转化方法,将绿色荧光蛋白基因sGFP导入落叶型黄萎病菌VD07038,将红色荧光蛋白基因mCherryRFP导入非落叶型黄萎病菌Bp2中,分别获得了具有绿色、红色荧光信号的阳性转化子。经过分子验证和连续继代培养,证明了这些转化子具有遗传稳定的对潮霉素的抗性。通过对转化子的菌落形态、生长速度和致病力进行检测,发现大部分转化子与野生型基本一致,少量转化子发生变异,其中转化子Bp2R-30不能产生微菌核,致病力显著下降。利用荧光显微镜观察了转化子VD07038G-10在感病棉花品种苏棉22幼苗根部的侵染情况。结果表明,在接菌12 h后VD07038G-10的孢子可吸附在根表面;接种7~9 d后,菌丝入侵到棉花根部的维管组织。本研究获得的荧光蛋白标记的棉花黄萎病菌VD07038G-10可用于实时观测黄萎病菌侵染棉花根系的过程,并且可以定量鉴定不同棉花品种对该菌系的抗性,为棉花黄萎病菌抗性鉴定提供一种新方法。     

棉花黄萎病拮抗蛋白的分离与纯化

从棉花叶组织中分离到的类芽孢杆菌(Paenibacillus)LC105菌株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有明显的拮抗作用.该菌株发酵液分别用过滤、高压灭菌及有机溶剂处理,初步证明对大丽轮枝菌产生拮抗作用的物质为蛋白质.LC105菌株发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析及Sephacryl S-100凝胶层析分离纯化,得到了分子量为27 kDa的抗菌蛋白.     

枯草芽孢杆菌NCD-2菌株抗菌蛋白初步分析

枯草芽孢杆菌NCD-2菌株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有较强的抗生作用。通过对NCD-2菌株培养条件的研究,结果表明在30℃、培养液初始pH为7.0和培养时间为2 d条件下,利用NB培养基培养该菌株所得培养液抑菌活性优于其他培养基,其培养液经硫酸铵沉淀所得的蛋白粗提液经RNA酶处理后的抑菌活性与对照相比差异不显著,经蛋白酶K和胰蛋白酶处理后的抑菌活性与对照相比差异显著;蛋白粗提液经60℃处理后的抑菌活性与对照相比差异不显著,经80,100,120℃处理后抑菌活性与对照相比差异显著,但经120℃处理30 min后仍有一部分抑菌活性,研究结果说明该菌株产生的抗菌物质存在性质上的差异。