低温胁迫下内源性ROS对磷脂酶D活性影响的研究

低温(4℃,0℃和-4℃)处理高山离子芥(chorispora bungeana),研究低温胁迫引发的内源性ROS对高山离子芥叶中线粒体膜结合态磷脂酶D(Phospholipase D PLD)活性的影响,以期揭示内源性ROS对高山离子芥叶中线粒体膜结合态PLD活性的调控机制。结果表明,在4℃,0℃和-4℃处理下,高山离子芥叶中H2O2的含量和PLD活性均高于空白对照组。在正常条件下,用不同浓度H2O2处理后,PLD活性高于空白对照组。当添加NADPH氧化酶抑制剂(diphenylene iodonium DPI)处理后,在3个温度胁迫下PLD活性低于对照组,在该条件下线粒体膜结合态Ca~(2+)含量高于对照组。当用DPI+CaCl2处理后,PLD活性较添加DPI处理组高,而添加Ca~(2+)的螯合剂EGTA处理后,PLD活性与对照组相比表现出降低,表明低温胁迫下高山离子芥叶中Ca~(2+)参与内源性ROS对PLD活性的调控。     

高山离子芥愈伤组织总RNA的提取方法研究

为了探寻提取高山离子芥（Chorispora bungeana）总RNA的最佳方法和条件。本研究分别采用改良的Trizol法、柱式离心法和CTAB法提取高山离子芥RNA,比较其得率、纯度、完整性和反转录后的PCR扩增效果;并对RNA的保存以及去RNA酶的处理进行了优化。结果表明,改良的Trizol法提取的RNA纯度和得率高、完整性好,转录后的PCR扩增效果好;RNA提取后室温保存8 h内降解较少,-80 ℃至少保存30 d。枪头、离心管等去RNA酶处理不完全会导致大量RNA降解,电泳槽等工具及电泳液的RNA酶灭活不彻底会使RNA在电泳过程中降解。     

基于碘离子增强过氧化物酶样活性的铜离子检测

铜离子具有过氧化物酶样活性,我们发现,碘离子能增强这种活性。基于此,利用TMB-H_2O_2体系,采用紫外分光光度法,实现了铜离子的灵敏检测。该方法操作简便,速度快,有望应用于环境中铜离子的现场检测。     

抗菌肽Cecropin D基因在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析

为使抗菌肽Cecropin D在巴斯德毕赤酵母中高效表达,本研究根据Cecropin D全基因序列和毕赤酵母的偏嗜性设计合成4条寡聚西核苷酸,SOEing-PCR技术法合成Cecropin D基因序列,并克隆至酵母表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒,将其线性化后电击转化毕赤酵母菌株SMD1168,经高浓度博莱霉素筛选,获得高拷贝转化子,菌液PCR鉴定表明Cecropin D基因已整合到酵母基因组中.在GAP强启动子调控下,重组Cecropin D高效分泌表达,产物耐高温耐酸碱,并对部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果,对E.coliDH5 α和S.aureus Cowan I株的MIC值分别为2.17 μg/mL和4.55 μg/mL.     

壳聚糖对肉仔鸡血清花生四烯酸含量、磷脂酶A2活性及小肠胞内磷脂酶A2 mRNA表达的影响

本试验旨在研究日粮中添加不同水平壳聚糖对肉仔鸡血清花生四烯酸含量、磷脂酶A2活性及小肠胞内磷脂酶A2mRNA表达的影响.试验选择1日龄健康爱拔益加肉仔鸡240只(公母各占1/2),随机分为6个处理,每个处理5个重复,每个重复8只鸡.对照组饲喂基础日粮,其他5种试验日粮分别在基础日粮中添加50、200、500、1000和2 000 mg/kg的壳聚糖配制而成.试验期42 d.结果表明,肉仔鸡血清花生四烯酸含量、磷脂酶A2活性及十二指肠、空肠、回肠的胞内磷脂酶A2mRNA表达均随日粮壳聚糖添加量的增加呈显著二次曲线增加(P<0.05);其中以500和1 000 mg/kg壳聚糖组较高,但当日粮壳聚糖添加量为2 000 mg/kg时则有不同程度的降低.由此可知,壳聚糖对肉仔鸡免疫功能的影响可能与磷脂酶A2的活性及小肠胞内磷脂酶A2mRNA的表达发生改变有关.     

禽甲状腺过氧化物酶活性的动态测定

正确测定甲状腺过氧化物酶 (TPO)的活性参照Hosoya提供的方法 ,对TPO活性的测定方法做了一定的改进 ,其准确度和精确度均有了一定的提高     

谷精草有效成分分析及体外抗菌活性测定

采用试管法和圆形滤纸层析法分析鉴定了谷精草的化学成分,结果表明:谷精草含有生物碱、酚性成分、有机酸、黄酮及其甙类、挥发油、植物甾醇、鞣质等化学成分。用纸片法和试管法对谷精草水提取液进行了体外抗菌作用试验,结果表明:谷精草水提取液对金色葡萄球菌、链球菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌等兽医临床常见病原微生物都有较强的抗菌作用,抑菌圈直径分别为12.16±0.33mm,15.36±0.29mm,13.57±0.61mm,8.63±0.26mm,9.88±0.72mm;谷精草水提取液对金色葡萄球菌、链球菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.125g/ml、0.063g/ml、0.125g/ml、0.5g/ml、0.25g/m;最低杀菌浓度(MBC)分别为0.25g/ml、0.125g/ml、0.25g/ml、1g/ml、1g/ml。     

谷精草有效成分分析及体外抗菌活性测定

采用试管法和圆形滤纸层析法分析鉴定了谷精草的化学成分,结果表明:谷精草含有生物碱、酚性成分、有机酸、黄酮及其甙类、挥发油、植物甾醇、鞣质等化学成分.用纸片法和试管法对谷精草水提取液进行了体外抗菌作用试验.结果表明:谷精草水提取液对金色葡萄球菌、链球菌、巴氏杆茵、沙门氏菌、大肠杆菌等兽医临床常见病原微生物都有较强的抗茵作用,抑茵圈直径分别为12.16±0.33 mm,15.36±0.29 mm,13.57±0.61 mm,8.63±0.26 mm,9.88±0.72mm:谷精草水提取液对金色葡萄球菌、链球菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.125 g/ml、0.063g/ml、0.125 g/ml、0.5 g/ml、0.25g/ml;最低杀菌浓度(MBC)分别为0.25g/ml、0.125g/ml、0.25g/ml、1g/ml、1g/ml.     

影响奶牛产后卵巢周期活动恢复的因素研究分析

本研究通过对宁夏区内5个规模奶牛场的繁殖母牛生殖状况调查的基础之上,分析表明,产前体况评分为3.25～4,产后体况评分为2.75～3.5,年泌乳量为7 000～5 000kg,产犊季节在秋冬季、经产奶牛等因素与其相对应的对照组比较,产后卵巢开始活动的时间、产后第一次站立发情的时间、产后第一次配种时间明显提前（P〈0.05）,受胎率明显增高（P〈0.05）,产犊指数明显缩短（P〈0.05）。     

检测绵羊源爱知病毒D型荧光RT-PCR方法的建立和应用

绵羊源爱知病毒D型(ovine Aichivirus D)是在国内绵羊中新发现的病毒,本研究根据绵羊源Aichivirus D 3D基因序列设计检测引物,通过反应体系和条件优化,成功建立了检测绵羊源Aichivirus D的TB Green染料法荧光RT-PCR方法,该方法特异性和稳定性良好,灵敏度高。对2020年4月―2021年5月采集自四川6个场253份绵羊粪便样本(健康羊的133份,腹泻羊的120份)进行检测,结果该病毒的平均检出率为8.7％,场阳性率为66.7％。其中,腹泻粪便样本中绵羊源Aichivirus D阳性率(17.5%)显著高于非腹泻粪便样本中绵羊源Aichivirus D阳性率(0.75%,P<0.001)。表明绵羊源Aichivirus D可能是引起以上地区绵羊腹泻的病原。从绵羊源Aichivirus D的阳性样本中成功克隆出大小为1 422 bp的13个完整的绵羊源Aichivirus D 3D基因,其核苷酸相似性为99.4％～100.0％。遗传演化分析发现这13株绵羊源Aichivirus D 3D基因与本实验室前期研究上传的绵羊源Aichivirus D 3D基因共同聚为单独的一个大支。本研究为绵羊源Aichivirus D的分子检测提供了一种新的方法和基础流行病学数据。     

新生牛血清促细胞生长活性检测方法的建立与应用

牛血清是医药生物技术产品中重要的原辅材料之一,做好牛血清的质量控制是提高生物制品质量的重要环节。本研究通过应用PK15、BHK21和ST三种兽用生物制品研制中常用的细胞作为载体,选用国内同等价位5个不同厂家生产的新生牛血清作为比较对象,采用细胞倍增时间测定法、细胞克隆形成率测定法、细胞三次连续传代培养法、MTT比色法和微量终点稀释法五种血清质量鉴定的方法进行比较,检测新生牛血清的促细胞生长活性,最终确定了MTT比色法作为便捷高效快速筛选新生牛血清的检测方法。     

水貂多巴胺受体D2基因的克隆测序及外显子区多态性检测

以多巴胺受体D2基因(DRD2)作为候选基因,分析该基因对水貂自咬行为的影响。本试验采用聚合酶链式反应方法,首次从美洲黑貂脚部肌肉组织扩增出多巴胺受体D2基因的部分序列片段,并克隆测序,将该序列提交到Gene Bank上,已得到序列号为EU085471。通过序列比较,在第四外显子区域未发现碱基突变,在第5外显子区域发现在41位点处发生了(T→C)转换,采用单链构象多态性(PCR-SSCP)方法进行了多态性检测,结果表明:在不同个体中未检测到基因多态性。     

Characterization of Equine Phospholipase C Zeta: A Review and Preliminary Results on Expression Defects in Subfertile Stallions

In all mammalian species studied thus far, fertilization results in a series of intracellular Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) increases, referred to as oscillations, responsible for driving oocyte activation and embryonic development. Current evidence supports the notion that sperm-borne phospholipase C zeta (PLCZ) is responsible for the initiation of these [Ca²⁺]_i oscillations. Although this appears to be a highly conserved mechanism for oocyte activation, differences in PLCZ sequence, activity, and expression do exist among different species. Herein, we summarize the information supporting PLCZ as the oocyte-activating factor in mammals and present our current knowledge regarding the characterization of this protein in the horse. The equine sequence yielded a protein of high relative [Ca²⁺]_i-releasing activity. Equine PLCZ was expressed over the head region overlying the acrosome, equatorial segment, connecting piece between the head and midpiece, and on the principal piece of the flagellum of stallion sperm. Equine PLCZ expressed both over the head and tail sperm regions was catalytically active, with the latter representing a characteristic unique to the horse. We also present preliminary data in subfertile stallions displaying PLCZ expression defects, although further research is required to establish a clear association between these defects and fertility problems in the horse. In summary, the information presented raises the questions of whether equine PLCZ could play diverse roles in sperm physiology and/or become a marker for the evaluation of stallion fertility, both of which are worthy of further investigation.     

弹性硬蛋白溶解试验鉴别反刍动物腐蹄病节瘤拟杆菌强毒株

根据腐蹄病节瘤拟杆菌毒力菌株具有溶解弹性硬蛋白的特性,利用弹性硬蛋白培养基建立了弹性硬蛋白溶解试验,以鉴别节瘤拟杆菌强毒株。试验表明,将不同毒力的菌株同时接种于弹性硬蛋白培养基,蛋白溶解带出现的时间和宽度都显著不同,强毒株大多在７ｄ内,少部分在７～１１ｄ内均出现一条明显的蛋白溶解带;而弱毒株在２１ｄ内基本上未见蛋白溶解带出现。     

IBD试纸条对中强毒力苗毒及分离野毒的检测研究

以琼扩为对照，应用IBD试纸条分别检测了人工感染鸡、疫苗接种鸡、自然发病鸡3种不同类型的法氏囊样品以及不同的疫苗。毒株测定结果显示，IBD苗毒228E、MB、V877、NF8、QC试纸条均为阳性，琼扩对照均为阴性，分离强毒H4、He3、Y2试纸条及琼扩对照均为阳性。法氏囊样品测定结果显示，自然感染病例，H4、He3、Y2感染鸡，228E、MB、V877、NF8接种鸡两种方法测定均为阳性，QC则为阴性。对法氏囊样品的检测结果证明，IBD试纸条具有特异、敏感、快速的特点，其敏感性高于琼扩的敏感性，为IBD诊断提供了新方法。     

山羊痘病毒LAMP检测方法的建立

为了建立适用于基层养殖场快速、可视化的山羊痘病毒(GTPV)环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法,根据GenBank公布的GTPV ORF103保守区核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,优化反应条件(时间、温度)和反应体系(dNTP、内外引物浓度比),并进行特异性和灵敏度试验。结果表明,所建立的LAMP方法在65℃时反应50 min即可获得清晰的梯状条带;扩增物经10×SYBR GreenⅠ荧光染料染色,紫外线照射或日光下即可直接判定结果;灵敏度试验结果表明,该方法能够检出的GTPV核酸最低浓度为1.287 ng/mL,与常规PCR方法相比,灵敏度增高100倍;该方法特异性良好,与小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊支原体(Mccp)、羊口疮病毒(ORFV)均无交叉反应;对10份临床样品检测结果显示,该方法与传统PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法可用于临床山羊痘病毒的检测。