拟南芥CycD2基因在水稻中的表达及初步分析

细胞周期蛋白CycD2基因是在拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中发现的，对调节细胞周期具有重要作用的调控因子。研究利用RT-PCR技术由拟南芥幼苗mRNA扩增了CycD2基因，构建了超量表达载体并对单子叶植物水稻（Oryza sativa ssp. japonica）进行了转化。对获得的转基因植株进行半定量RT-PCR分析表明，CycD2 mRNA的确能够在水稻中积累。超量表达CycD2的转基因水稻植株在发育早期生长与发育加快，表现为幼苗植株根长和株高均显著高于对照（转空载体植株），加快了水稻的生长速率。     

水稻单C_2H_2型锌指基因ZOS2-01的表达与功能分析

拟南芥超雄基因（SUPERMAN,SUP）是一个单C2H2锌指基因。该基因突变后会造成雌蕊同源转化为雄蕊,正常的心皮发育受阻,因此SUP在控制花第3/4轮边界的建立和胚珠的发育中起重要作用。为了探知水稻中的SUP同源基因是否也存在类似的功能,我们根据拟南芥SUP的功能结构域,从水稻中克隆了一个与SUP类似基因,命名为ZOS2-01,并对其表达和功能进行了分析。结果表明,ZOS2-01与拟南芥的SUP和矮牵牛的PhSUP1在系统进化树上处于同一分支且与SUP的功能结构域完全相同。定量PCR和GUS表达分析表明,除胚乳外,ZOS2-01几乎在所有组织和器官中表达,但在幼穗中的表达量最高,暗示它可能参与了水稻的营养生长和花器官发育的调节。然而,采用RNA干扰和过量表达的方法减少和增加ZOS2-01的表达并没有明显影响水稻的生长发育,转基因水稻的营养生长正常,花器官发育也没有明显异常且结实正常。这些结果表明,尽管水稻ZOS2-01与拟南芥SUP具有相同的功能结构域,但它们的表达和功能可能已出现了分化,或者水稻中存在多个功能冗余的SUP类似基因。     

过量表达盐芥TsIPK2基因增强转基因水稻耐盐性

【目的】本试验以野生型(WT)和转盐芥TsIPK2基因的水稻为材料,研究NaCl胁迫条件下过量表达TsIPK2基因对水稻植株抗盐胁迫能力的影响。【方法】取水稻材料种子和其3叶龄幼苗,分别在不同NaCl浓度(0、50、100、150、200 mmol/L)下进行处理。检测WT与过量表达TsIPK2基因水稻种子的发芽率、主根长和芽长、幼苗的丙二醛(MDA)和脯氨酸的含量,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,以及与胁迫相关的5个基因的表达。【结果】在盐胁迫下,与野生型相比,转基因水稻具有更好的发芽率、主根长和芽长。野生型和转基因水稻两者的脯氨酸含量增加,转基因水稻的积累量显著高于野生型,但是转基因水稻MDA含量增加幅度小于野生型。野生型和转基因水稻幼苗SOD酶活性均增加,但转基因植株的酶活性显著高于野生型;二者POD酶活性呈现先升高后下降的趋势,但是二者活性没有显著的差别;转基因水稻的CAT活性也呈现先升高后下降的趋势,然而野生型水稻的CAT活性在盐胁迫下没有显著的变化。高盐处理后,野生型和转基因水稻的5个与胁迫相关的基因表达倍数都增加,与野生型相比,转基因水稻的OsP5CS1、OsSOD、OsCATB和OsLEA3的表达量显著升高,而OsPOX1基因的表达量变化不显著。【结论】过量表达TsIPK2基因能够通过增强水稻的渗透调节能力、抗氧化胁迫能力并调节胁迫相关基因的表达,以提高水稻的耐盐性。     

过量表达pAPX基因提高水稻对镉胁迫的耐性

研究了编码大麦pAPX的基因HvAPXI导入水稻并过量表达后，转pAPX水稻在镉胁迫下的生长状况、生理指标及镉含量。结果发现，由于pAPX基因的过量表达，转基因植株的根系伸长量、生物量、叶绿素含量以及APX活性都明显高于野生型植株。与野生型植株相比，转基因水稻对镉胁迫具有明显的耐性。伴随对镉胁迫耐性的提高，转pAPX水稻对镉的累积量也同时提高。     

OsCRY2基因抑制表达对水稻主要农艺性状的影响

利用已公布的水稻OsCRY2基因序列设计引物,扩增部分基因片段,成功构建了ihpRNA植物表达载体pSC1301-347-OsCRY2,并通过农杆菌介导法将OsCRY2干扰片段导入水稻获得了转基因植株。根据转基因植株主要农艺性状的表现,分析了该基因的功能。结果表明,抑制OsCRY2基因表达会强烈延迟水稻开花与成熟;转基...     

西红柿原系统素基因转化水稻的抗虫性研究

构建了两个含西红柿原系统素基因的双元载体pNAR304（UbiI5’+Prosystemin+NOS3’）和pNAR305 (UbiI5’+Prosystemin+NOS3’+ PinⅡ5’+PinⅡ+PinⅡ3’)，并用农杆菌介导方法将其转入水稻品种秀水63、合江19和日本晴。经潮霉素抗性、PCR和Southern blot确证，共获得转基因水稻14株。Northern blot检测表明，原系统素基因(Prosystemin)和马铃薯蛋白酶抑制剂基因(PinⅡ)在这些转基因植株中都能转录表达。然而，植株的二化螟和褐飞虱抗虫性鉴定表明：单独转入Prosystemin（pNAR304）不能提高转基因水稻的抗虫能力；Prosystemin和PinⅡ双价（pNAR305）转基因植株能明显提高水稻的抗虫性，但其抗性水平与PinⅡ单个基因的转基因水稻植株间并无显著差异。 这表明，Prosystemin基因转入水稻并不能有效调节转基因水稻PinII基因的表达量。据此试验结果推测，水稻中可能不存在类似于西红柿系统素的信号途径，很可能水稻的伤害信号转导是经由与双子叶植物系统素体系不同的其它途径来实现的。     

磷胁迫下蔗糖对水稻苗期根适应性和磷酸转运蛋白基因表达的影响

磷是植物生长和发育中最重要的必须元素之一。尽管土壤中磷资源很丰富,但大部分磷是以植物不能吸收利用的固定态和有机态存在,特别是以酸性土壤为主的南方稻田,水稻缺磷现象非常严重。理解和掌握水稻对低磷的适应机制有助于利用分子手段培育磷高效利用水稻品种。为阐明蔗糖提高水稻耐低磷的机制,本研究对水稻幼苗进行不同磷、糖处理,分析水稻幼苗在不同磷糖配比培养基中的根系结构、无机磷、酸性磷酸酶活性的变化,并利用定量RT-PCR技术分析水稻磷酸转运蛋白基因(OsPT)和酸性磷酸酶基因(OsSAP1)的表达。试验设2个磷浓度:无磷和85 mg·L?1KH2PO4,2个蔗糖浓度:无糖和3%蔗糖,正交设计。结果表明,在低磷胁迫时添加蔗糖,能使水稻幼苗的根总长度、总根数、根冠比显著增加,根分泌的酸性磷酸酶活性降低,但水稻体内的磷酸转运酶活性提高。11个与磷具有高度亲和力的磷酸转运酶的表达发生了改变,其中根优势表达的4个基因OsPT2、OsPT3、OsPT4、OsPT6对磷、糖的影响最为敏感,暗示了蔗糖是通过调节磷转运蛋白维持磷的吸收和平衡。增加根系的蔗糖分配能够提高水稻幼苗对磷胁迫的耐受性。     

大白菜BrTCP24基因的克隆与功能分析

近年来,由于家庭结构的变化,市场对小株型大白菜的需求日益迫切.开展负调控叶球大小发育相关基因的克隆与功能研究有助于加快小株型大白菜品种的选育进程.本研究利用RT-PCR方法从大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)自交系福山包头叶片中分离了一个TCP第二亚族成员基因,命名为BrTCP24.BrTCP24基因编码区内无内含子,开放阅读框(ORF)全长1 221 bp,预测编码406个氨基酸.利用MEGA4.0软件将BrTCP24与拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP家族基因进行进化分析发现,BrT-CP24与AtTCP3同属于一个分支,在进化上具有较近的亲缘关系.用DNAMAN软件对BrTCP24和AtTCP3蛋白进行多序列联配分析发现,二者的氨基酸一致性可达到55.17％,在保守的TCP结构域其一致性可高达91.53％.这种进化上的亲缘关系和序列上的保守性,暗示二者可能具有类似的生物学功能.通过半定量RT-PCR分析发现,BrTCP24基因在大白菜的根、茎、莲座叶、包叶、盛开的花、受精后10 d的果夹和花蕾中均有表达,其中莲座叶中表达量最高,根、包叶、盛开的花、受精后10d的果夹和花蕾中的表达量次之,短缩茎中表达量最低;另外,在5 μmol NAA处理的12h内BrTCP24的表达水平未发生明显变化.为进一步研究BrTCP24基因的功能,我们构建了转化拟南芥的正义表达载体(35S::BrTCP24),并转入拟南芥中.通过卡那霉素筛选以及基因组DNA PCR鉴定,共得到17株转基因拟南芥植株.通过对其中5株的RT-PCR分析发现,它们都能够转录表达BrTCP24基因.利用荧光实时定量PCR方法对部分转基因植株的插入拷贝数进行检测发现,BrTCP24基因以单拷贝形式插入拟南芥基因组.进一步研究发现,与野生型拟南芥相比,过量表达BrTCP24基因可导致转基因拟南芥的下胚轴和叶器官明显减小.此外,过量表达BrTCP24基因抑制了与器官大小相关基因ANT、AtEXP10、AtGRF5、AtGIF1和CycD3;1的表达.这些结果表明,大白菜BrTCP24基因可能通过抑制细胞的生长参与调节植物器官大小的发育.     

水稻侧根突变体Oslrd2的表型分析和基因克隆

侧根是水稻胚后发育的重要器官,具有吸收养分和稳固植株的作用.本研究从甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的水稻Kasalath突变体库中筛选得到一个水稻侧根突变体Oslrd2,对其进行了表型和遗传分析、图位克隆、候选基因测序及转基因互补验证.结果表明,与野生型相比,Oslrd2幼苗期的苗高和根系伸长都受到明显抑制,侧根短且数量少...     

水稻OsGPDH1的克隆与功能鉴定

为了解水稻甘油-3-磷酸脱氢酶基因在水稻抗逆性中的作用,本研究从水稻品种日本晴中克隆了1个编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因,命名为OsGPDH1,该基因编码的蛋白酶具有NAD(P)+结合域和脱氢酶域,且这2个结构域在植物中高度保守。构建过表达OsGPDH1基因载体转化水稻得到转基因植株,RT-qPCR分析表明,OsGPDH1基因在水稻孕穗期的叶、幼穗、茎、节、叶鞘中均有表达,说明该基因参与了水稻的生长发育过程。OsGPDH1基因也受到PEG6000、高盐、双氧水等逆境和甲基茉莉酸(mJA)、水杨酸(SA)等激素诱导表达,且诱导12h后,OsGPDH1的表达量达到最高水平,但对脱落酸(ABA)不敏感。盐胁迫下的发芽试验表明,过表达转基因水稻的发芽率高于野生型,说明OsGPDH1基因表达量的提高可增强转基因植株对盐胁迫的耐受性。对过表达OsGPDH1的转基因水稻进行苗期20%PEG6000胁迫处理后,转基因水稻的成活率显著高于野生型,说明OsGPDH1基因过表达可提高水稻苗期抗旱能力。本研究初步证明了OsGPDH1水稻抗盐胁迫和渗透胁迫的重要作用,为培育抗性转基因水稻新品种提供了新的基因资源。     

Release and activity of allelochemicals from allelopathic rice seedlings

3-Isopropyl-5-acetoxycyclohexene-2-one-1 (1), momilactone B (2), and 5,7,4'-trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavone (3) were isolated and identified from an allelopathic rice accession PI312777. These three compounds at low concentrations could inhibit the growth of weeds Echinochloa crusgalli and Cyperus difformis associated with rice, especially mixtures of the compounds had stronger inhibitory activity than did individual compounds. Studies with hydroponic culture, continuous root exudates trapping system (CRETS), and direct resin adsorption methods showed that a total of 7.6 n moles 1, 2, and 3 were exuded from living roots of each seedling into the environment at 10 days after seedlings were transplanted. Furthermore, 1, 2, and 3 were found in the soil growing PI312777 seedlings at day 15 after seedlings emergence and reached a total of 39.5 microg/g soil at day 30. The results indicated that PI 312777 seedlings could release sufficient quantities of 1, 2, and 3 into the environment to act as allelochemicals inhibiting the growth of associated weeds. Investigations on the distribution of 1, 2, and 3 in PI 312777 plant, and its root exudates showed that the levels of 1, 2, and 3 were significantly higher in the shoots and root exudates than in the roots, and only trace 1 was observed in the roots. The results suggest that the roots of rice seedlings are not major site of synthesis or accumulation 1, 2, and 3, but a pathway for their release into the environment. The levels of 1, 2, and 3 in the root exudates were over 2-folds higher under direct resin adsorption than under hydroponic culture and CRETS, and hence, it is the preferred method to collect and identify active allelochemicals in rice exudates in future studies on rice allelopathy.     

低氮胁迫下水稻根系的发生及生长素的响应

采用水培实验,研究了5个氮(N)浓度下(0.01～5 mmol L-1)水稻的生物量、体内氮浓度、根系发育、体内生长素浓度以及生长素外流蛋白OsPIN家族基因的表达情况。结果表明,与正常供氮水平(2.5mmol L-1)相比,低氮(0.01 mmol L-1)胁迫下水稻根冠比增加28%,地上部全氮浓度降低约20%,根系全氮浓度降低约33%,种子根长度增加25%,种子根上的侧根密度降低26%,倒一叶中的生长素含量增加140%,而根茎结合处和根系的生长素浓度分别下降22%和60%;RT-PCR的结果表明,低氮(0.01 mmol L-1)胁迫下水稻根系中OsPIN1a-b、OsPIN2、OsPIN5a-b和OsPIN9基因表达显著下调;而外源生长素α-萘乙酸(NAA)和生长素极性运输抑制剂1-萘氨甲酰苯甲酸(NPA)的施加均能影响到水稻种子根长和种子根上的侧根密度。由此推论,低氮胁迫下水稻体内生长素从倒一叶到根系极性运输减少是水稻根系对低氮胁迫响应的生理机制之一。     

小麦生长素响应因子TaARF6转基因烟草植株分子鉴定

【目的】生长素响应因子(ARF)在介导生长素信号传递和调控下游生长素响应基因的表达中发挥着重要功能。本文旨在以在富集丰磷特异表达基因的小麦根系cDNA差减文库中鉴定的1个ARF类别的家族成员TaARF6为基础,对该基因cDNA序列、分子特征、不同供磷水平下该基因在根、叶中表达模式及遗传转化TaARF6对丰磷和缺磷条件下植株形态的影响进行较全面研究,阐明该小麦生长素响应因子基因介导不同供磷水平下对植株生长特性的影响。【方法】采用生物信息学工具预测TaARF6编码蛋白特征; 采用溶液培养法培养丰、缺磷处理小麦幼苗,采用半定量RT-PCR技术鉴定TaARF6在丰、缺磷处理下的表达特征。采用DNA重组技术构建将TaARF6编码阅读框融合至表达载体中的表达质粒,利用农杆菌介导的遗传转化法建立超表达TaARF6转基因烟草植株。采用琼脂培养和溶液培养法,培养丰、缺磷不同供磷水平下野生型植株和转基因烟草植株,进而利用常规分析方法鉴定不同磷水平下植株长势、根系和茎叶生物量和植株根叶形态及性状。【结果】1)TaARF6编码生长素响应因子(ARF)型转录因子,编码蛋白中含有ARF家族成员具有的保守结构域。该基因在氨基酸水平上与源于短柄草BdARF6和源于水稻的OsARF6具有高度同源特征。表达分析表明,TaARF6在根、叶中均呈典型低磷下表达下调、复磷后表达再度回升模式,表明该基因表达受到外界供磷水平的调节。2)遗传转化结果表明,在正常生长和低磷逆境下,与野生型植株相比,转基因烟草株系幼苗和植株形态明显增大。3)丰、缺磷不同供磷水平下,与未转化的野生型(WT)对照植株相比,转基因系(Line 3 和Line 5)植株幼苗和植株根系、茎叶和单株鲜、干重均较野生型显著增加。此外,与WT相比,转基因系植株根系数量增多、主侧根长度、根体积、叶面积和根冠比增加。【结论】TaARF6编码典型的生长素响应因子,其编码蛋白具有生长素响应因子特有结构域。TaARF6对环境中的低磷胁迫逆境能产生明显应答。上调表达TaARF6基因,具有增加植株根、叶鲜、干重和改善根叶及植株形态的生物学功能。本研究表明,通过对植株体内生长素响应基因的转录调控,TaARF6在介导植株不同供磷水平下的根叶形态建成和干物质累积过程中发挥着重要作用。     

不同价态无机砷胁迫下水稻秧苗的营养生理与分子响应

为揭示水稻秧苗响应砷胁迫的营养生理机制,以"汕优63"为受体材料,采用水培方法研究了水稻秧苗在不同价态无机砷胁迫下其形态学指标(根长、株高和干重)及植株中N、P、K含量等生理响应,并采用实时荧光定量PCR (FQ-PCR)分析了不同价态无机砷胁迫下水稻秧苗根和叶中与N、P、K吸收相关的4个关键酶基因的表达差异.结果表明,砷胁迫可显著降低水稻的根长、株高、干重,As(Ⅲ)的抑制作用大于As(Ⅴ);As(Ⅲ)主要抑制水稻秧苗对磷、钾的积累,而As(Ⅴ)主要抑制氮的积累;不同价态无机砷胁迫下,水稻秧苗根部,叶部与N、P、K吸收相关的基因表达均下调,且As(Ⅲ)主要影响磷酸根离子转运蛋白和钾离子转运蛋白的表达,而As(Ⅴ)则主要影响硝酸根离子转运蛋白和氨离子转运蛋白的表达.可见,不同价态无机砷胁迫对水稻营养生理机制的影响存在差异.     

作物初生根不同发育时期通气组织形成的石蜡切片与徒手切片的比较观察

应用石蜡切片方法和徒手切片方法,通过对水稻幼苗根系通气组织发育的观察,比较两种切片的异同。结果显示：石蜡切片和徒手切片都能清楚显示水稻根系通气组织的结构;并由此确定了水稻幼根通气组织形成过程,具体为：4天苗龄的水稻幼苗根系在培养24 h后开始形成通气组织,72 h时通气组织发育成熟。越靠近根基的部位,植株组织发育更成熟,通气组织的发育程度也更高。相比于石蜡切片,徒手切片方法更适用于水稻根系通气组织结构的观察。进一步利用徒手切片方法比较水稻和小麦根系通气组织形成对低氧的反应,发现低氧显著诱导麦根通气组织的形成,而对稻根通气组织发育的促进作用不明显。     

水稻根际促生细菌促生生理活性评价

为了考察水稻特异性PGPR菌株各生理活性对水稻幼苗初生根数、次生根数、茎干重和根干重的影响,筛选优良PGPR菌株,采用改良的CAS检测法、Salkowski比色法、钼蓝比色法和1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶检测法分别测定菌株产铁载体、产吲哚乙酸(IAA)、溶磷能力和ACC脱氨酶活性,利用Hoagland半固体培养基和土壤盆栽法培养水稻幼苗。结果表明,IAA产量低的菌株对水稻幼苗初生根数、次生根数和茎干重的增长有明显的促进效果;根干重明显随铁载体产量增加而增加;溶磷活性高的菌株对水稻幼苗茎干重和根干重的增加均有明显的促进作用;低ACC脱氨酶活性的菌株促进水稻幼苗初生根的生长,活性高的菌株促进次生根数的增加。根据半固体试验结果,选择7株具有明显促生效果的菌株进行盆栽试验,结果证实,这些菌株均具有显著的促生效应。     

乙烯通过调控氧化还原水平和耐冷基因表达提高早稻秧苗耐低温胁迫能力

乙烯参与调控植物响应多种逆境胁迫，然而乙烯调控早稻秧苗响应低温胁迫的生理和分子机制还不明确。本研究选择无土基质、发酵基质和营养土3种育秧基质对中早39早稻品种进行正常育秧至两叶一心期，外源喷施乙烯利后将水稻秧苗进行3d的低温处理，随后测定秧苗理化性质和抗寒基因表达，同时以喷施等量清水作为对照。结果显示：喷施乙烯利后显著提高了低温条件下水稻秧苗的生长，提高了秧苗体内的养分含量和渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖含量，增强了秧苗体内抗氧化系统酶活性和氧化还原状态(AsA/DHA比率)，提高了秧苗体内OsCOIN、TERF2、OsLti6a和OsCDPK7等耐冷基因的表达。以上结果说明，外源喷施乙烯通过调控水稻体内渗透调节物质含量、氧化还原水平和耐冷基因的表达增强水稻秧苗的耐低温胁迫能力。     

不同水、氮条件对水稻苗生长及伤流液的影响

为探明不同水分供应和氮素形态对水稻根苗及伤流液的影响,设正常水分及50 g/L PEG模拟水分胁迫和3种不同质量比例的NH4+-N/NO3--N（9/1,5/5,1/9）氮素营养处理,测定了水稻幼苗生物量,根系形态指标,根系活力及根基伤流量。结果表明,正常水分条件下,NH4+-N促进水稻根系平均直径增大,有利于水稻地上部物质累积;NO3--N则使水稻根系总吸收面积增大,促进根系物质累积;NH4+-N/NO3--N为5/5处理的水稻活跃吸收面积最大,活跃吸收面积比亦最高。水分胁迫条件下,NH4+-N/NO3--N为5/5的处理更有利于水稻地上部分的生长,NO3--N有利于水稻鲜重和干重增加,促进根系平均直径增大,水稻的根系总吸收面积、活跃吸收面积均随NO3--N供应比例的增加呈上升趋势。正常水分条件下,水稻幼苗白天的耗水量随NH4+-N/ NO3--N比例降低呈下降趋势,水分胁迫条件降低了水稻对水分的吸收。水分胁迫显著降低各处理水稻伤流量,正常水分条件下,NH4+-N/NO3--N为5/5处理的水稻伤流量最大;水分胁迫后,9/1处理的水稻伤流量相对较多。     

玉米苗期根系生长与耐低磷的关系

在田间筛选试验的基础上,利用两个磷高效(181和186)、两个磷低效(153和197)玉米自交系,进一步研究了这些自交系苗期耐低磷能力差异及其与根系生长的关系。结果表明,在低磷胁迫(P.5.78.mg/kg)下,所有自交系玉米地上部重量、初生根重、次生根重及磷累积量降低,但磷高效自交系181和186受影响程度显著小于153和197。在试验所处的玉米生育时期(6叶龄),磷对所用自交系的初生根及次生根数量没有影响。比较181和197的根系形态,在低磷胁迫下,磷低效自交系197的初生根侧根长、轴根长均显著下降,磷高效自交系181则下降幅度很小。而且,低磷使181初生根的侧根/轴根比值、根长度/根重比值较高。说明低磷胁迫下,181自交系可以将根中的有限的养分及干物质作更合理的分配,促进细根的生长,从而获得较长的根系。