集胞藻PCC6803乙醇酸脱氢酶基因的克隆及其叶绿体定位分析

为明确集胞藻PCC6803乙醇酸脱氢酶与水稻Rubisco小亚基叶绿体转运肽(RCTP)的融合蛋白是否能准确定位到水稻叶绿体,本研究以特异引物从集胞藻PCC6803基因组DNA中扩增获得约1.5 kb的片段,将该片段与水稻Rubisco小亚基叶绿体转运肽连接,然后将融合片段连入瞬时表达载体P322-d1-e GFP,测序,获得融合基因RCTP-gdh,进一步构建了叶绿体定位的瞬时表达载体RCTPGDH-e GFP-d1并进行了叶绿体定位研究。结果表明,集胞藻PCC6803 GDH共编码492个氨基酸,含有FAD结合域、FAD关联的氧化酶活性(222~464 aa)以及乙醇酸氧化酶亚基(51~463 aa)。激光共聚焦显微镜分析表明,融合蛋白RCTP-GDH-e GFP可以准确定位到水稻叶绿体,但其转运效率低于RCTP-e GFP的转运效率,叶绿体和细胞质中的融合蛋白RCTP-GDH-e GFP都易于聚集而呈斑点状。本研究为进一步应用集胞藻gdh基因改造C3作物光呼吸代谢途径,抑制C3作物光呼吸速率,提高作物光合速率奠定了基础。     

马铃薯光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的克隆与功能分析

叶片是植物光合作用器官,在能量固定和利用中具有重要作用,研究光诱导型茎叶特异表达启动子的作用元件及其功能对于其调控基因的表达研究具有重要的理论意义和应用价值。本研究用PCR技术从马铃薯(Solanum tuberosum L.)基因组中分离了光诱导型茎叶特异表达启动子ST-LS1的1556bp序列,序列分析表明,该片段与已报道的ST-LS1启动子(Gen Bank accession No.X04753.1)有99.68%的同源性,包括参与芽的特定表达和光反应顺式作用元件as-2-box、光效应顺式作用元件G-box等。将该片段与GUS基因融合,构建了植物表达载体pBⅠ121-ST-LS1,应用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)获得了转基因植株。用qRT-PCR和GUS活性组织染色检测转基因烟草植株,结果表明,在ST-LS1启动子驱动的GUS转基因烟草植株的叶和茎中能够检测到GUS基因的表达,根中则检测不到;对黑暗、恒温光照培养、自然光条件处理20d后的转基因植株分析表明,在黑暗处理的转基因植株中GUS基因无表达,而在自然光条件处理转基因植株的叶和茎中GUS基因的表达高于恒温光照培养的转基因植株。结果可为应用基因工程改良农作物品种提供理论和应用依据。     

一个水稻根时空差异表达启动子的克隆及功能分析

本研究旨在分离克隆水稻根特异表达的启动子,为育种提供资源.本实验结合本室芯片数据库和RT-PCR验证得到一个水稻根特异表达的基因(TIGR Locus:Loc_Os05g19570),采用PCR技术从MH63的基因组DNA中扩增其上游启动子P12,长度为1950 bp,将该启动子片段与报告基因gus相连,构建植物表达载体,农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)介导转化水稻(Oryzative ssp.japonica)中花11.组织化学分析及荧光定量测定显示该启动子具有根特异性及时间差异性.根据P12启动子序列特征,利用PCR对其进行有目的的缺失,将5个长度不同的缺失片段分别与gus相连,构建植物表达载体,转化水稻中花11.荧光定量测定结果表明:-1059～-819bp区域缺失后,报告基因在根里的表达量显著降低,说明这个区域可能存在顺式元件.本研究成功的分离克隆到一个水稻根特异的启动子P12,进一步分析发现其还具有时间差异性.     

大肠杆菌乙酰辅酶A羧化酶accD亚基表达载体的构建及遗传转化研究

为探索大肠杆菌异质型乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）的β-CT亚基accD基因对油料作物含油量的影响,将目的基因E.coli accD（eaccD）与拟南芥Rubisco小亚基（rbcS）转运肽基因融合,构建以油菜Napin启动子驱动的种子特异表达载体。本试验应用农杆菌介导法,将该表达载体转入油菜,通过PCR检测获得了...     

加强Psy基因表达和通过RNAi抑制Lcy基因表达的载体构建

通过基因工程手段加强八氢番茄红素合成酶（Psy）基因的表达和通过RNAi抑制番茄红素β-环化酶（Lcy）基因（该基因是调控番茄红素转化为其他类胡萝卜素的主要的基因）的表达是培育高番茄红素品种的重要手段之一。根据GenBank中拟南芥的Psy基因序列（NM-121729），通过聚合酶链式反应（PCR）从拟南芥的cDNA中扩增出了长1296的Psy基因。根据GenBank中番茄的Lcy基因序列（X86452）和Pds启动子序列（U46919）分别设计特异引物从番茄中扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理，将Lcy基因的长302bp的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段插入到抗Kan的pVCT2020的表达载体中，并通过具有果实特异性特点的启动子——八氢番茄红素去饱和酶基因（Pds）启动子控制该干扰片段的表达，同时将Psy基因在Pds启动子调控下插入到同一载体中，从而构建成了能同时加强Psy基因的表达和抑制Lcy基因表达的植物表达载体。     

水稻rbcs基因启动子的克隆及结构功能分析

利用PCR法克隆了水稻日本晴来源的核酮糖-1、5-二磷酸羧化酶小亚基基因（rbcS）5’上游调控区，命名为Posrbcs。将Posrbcs与gus基因融合，并通过农杆菌介导转入水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性进行定性与定量分析，结果表明，Posrbcs启动子可驱动gus基因在转基因水稻植株的叶片、叶鞘、茎杆及颖壳中特异性表达，在胚乳中不表达。然后构建不同长度片断的Posrbcs的5’端缺失体，分别与gus构建融合基因，转入水稻中。对转基因植株GUS活性定量分析结果显示， Posrbcs片段愈短，GUS活性愈低；进一步的光诱导试验结果显示，光能明显提高gus基因表达活性，并且随着Posrbcs片段缩短，Posrbcs中的I box、GT1结合位点、GATA box、T box 等光诱导相关元件的缺失会造成在不同时间段的光诱导活性降低以及光诱导表达时间后移。凝胶阻滞试验证实Posrbcs序列中的这些光诱导相关元件有相应的核蛋白的结合。     

含有融合标记基因和LoxP／FRT位点的植物表达载体构建及应用

本研究利用化学合成法合成了包含pCAMBIA0390左右边界T-DNA和LoxP／FRT（LF）位点的DNA片段Ⅰ,利用SacⅡ和SphⅠ酶切位点,去除了pCAMBIA0390左右边界T—DNA和多克隆位点之间的序列,然后连接DNA片段Ⅰ和载体片段,构建了植物表达载体pGM323-LF-enTP。随后,再合成含有适合在单予叶植物中表达的由玉米Ubi-1启动子驱动的融合标记基因（Bar：：gus）和水稻actin-1启动子驱动的助抗虫蛋白基因（Cry1A6）表达元件的DNA片段Ⅳ,在pGM323～LF—enTP的基础上,利用5以Ⅰ和PstⅠ位点构建了同时含有LF位点、Bar：：gus以及Cry1Ab基因表达元件的表达载体pGM626-LF—ABt。利用含有pGM626-LF—ABt的农杆菌遗传转化烟草和玉米,以草丁膦作为抗性筛选剂,非转化细胞得到了有效抑制,快速获得了转基W植株,利用GUS组织化学检测和RT—PCR分析了转基因植株中标记基因的表达,结果表明pGM626-LF—ABt可以用于农杆菌介导的单、双子叶植物遗传转化。本研究为培育安全抗虫转基因植物奠定了基础。     

水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体的构建及遗传转化研究

为研究水稻热激转录因子基因OsHsfA7的功能及其在水稻耐热育种方面的应用价值,本文通过构建水稻OsHsfA7基因RNA干扰载体获得功能抑制变异材料,从反向遗传学进行基因的功能分析。扩增OsHsfA7c DNA3'编码区470bp片段,分别以反向和正向插入到中间载体pBSK连接的GUS片段两侧,然后将得到的RNA干扰片段克隆到改造的植物表达载体p1301M,构建以CaMV35S启动子驱动表达的水稻OsHsfA7基因RNA干扰表达载体。将该载体转入根癌农杆菌EHA105后,采用农杆菌介导法进行了水稻日本晴品种的遗传转化,获得了23株具有潮霉素抗性的转基因植株,其中12株经GUS染色呈蓝色并且DNA检测10株已插入目的片段,RNA检测其中6株OsHsfA7基因的表达水平下降甚至未检出。结果说明本研究构建的OsHsfA7基因RNA干扰载体对该基因表达沉默是有效的。     

香石竹ACC氧化酶基因克隆及其反义表达载体构建

据已报道的香石竹氨基环丙烷羧酸(ACC)氧化酶基因的cDNA序列设计特异引物,以香石竹品种“Master”基因组DNA为模板,用PCR方法克隆出香石竹ACO基因的部分序列。测序结果显示,克隆的序列与已报道序列基本一致。将克隆的香石竹ACO片段反向连接到植物表达载体pCAMBIA 1301中CaMV 35S启动子的下游,构建了香石竹ACO基因的反义表达载体pCAM-ACO2,为进一步通过反义技术延长转基因香石竹的花期奠定了基础。     

香蕉乙烯受体基因RNA干扰表达载体的构建

设汁两对引物，PCR扩增香蕉乙烯受体基因cDNA序列自AUG启始密码子起长538bp区段的正向(记为5‘I)、反向(记为AI’)DNA区段。构建含该正、反向互补重复序列DNA片段的中间载体，经测序证实连接正确后。克隆到植物表达载体pCAMBIA-1301中的GUs基因位置并经双酶切证实。在所得表达载体pCAMBIA-1301-S5’I-AI’中，该插入正反互补重复片段处于35S启动子之后，由此转录的mRNA因两端序列反向互补而形成发夹式RNA，因此可应用于RNA干扰研究。同时，文中对构建含正、反向重复序列插入片段植物表达载体过程中出现的插入片段链内退火引起连接困难等问题进行了分析讨论。     

水稻钙依赖型蛋白激酶0sCPK9基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

水稻钙依赖型蛋白激酶（CDPKs）是一个响应逆境胁迫并在植物发育过程中起重要作用的蛋白激酶。我们采用RT—PCR从水稻品种日本晴（Oryza sativa L．CV．Nipponbare）中克隆了OsCPK9基因靠近翻译起始位点下游的一段280bp的特异基因片段。将该片段以正、反向分别连接到来源于小麦TAK14基因的548bp内含子片段（NCBIaccessionnumber：AF325198）两侧,从而获得pSK．OsCPK9-RNAi的中间表达载体。进而将其克隆到植物双元表达载体pCAMBIA1301中,构建shRNAi表达载体pCAMBIA．05CPK9一RNAi。经酶切和测序鉴定正确后,利用农杆菌介导转化水稻。通过抗性筛选和标记基因hyg和gus进行PCR鉴定,筛选到20株转基因水稻植株,实时荧光定量PCR分析显示,部分转基因植株OsCPK9的表达受到显著抑制。     

小反刍兽疫病毒N基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。     

马铃薯叶片特异性启动子克隆分析及其驱动的人白细胞介素-12表达载体构建

利用植物生物反应器表达具有应用价值的药用蛋白是近年来生物技术研究热点。本研究利用PCR技术从马铃薯基因组中克隆其叶片组织特异性启动子Prbcs后,利用PLACE等数据库对序列进行启动子元件分析,接着通过重叠PCR、限制性内切酶酶切、体外连接、转化等技术,以双元载体pCambia-2301为骨架,构建Prbcs驱动的药用蛋白人白细胞介素12（hIL12）表达载体。结果显示,本研究成功从马铃薯基因组中扩增得到了623 bp大小的启动子片段,序列分析表明该片段含有典型的启动子元件如TATA-box,以及一些组织特异性的相关响应元件,符合组织特异性启动子的特征;成功获得了基于pCambia-2301的Prbcs驱动的hIL12植物表达载体。本研究获得的Ppatatin启动子及其驱动的hIL12表达载体,为提高hIL12在植物生物反应器中表达量以及优化马铃薯生物反应器打下了基础。     

棉花PEPC基因种子特异性ihpRNA表达载体的构建及鉴定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC）是控制植物体中蛋白质和脂肪酸含量比例的关键酶。本研究从棉花中克隆得到船PC基因,长度为433bp,并将该基因的正反义片段分别和种子特异性启动子napin启动子（1123bp）、α球蛋白B基因启动子（1149bp）连接,插入到植物表达载体pCADS1341中。经酶切和PCR鉴定,成功的构建了PEPC基因的种子特异性ihpRNA表达载体pCADSNPSPA和pCADSBPSPA,为后期高含油量棉花材料的选育打下了基础。     

三倍体毛白杨PtDRG02基因启动子的瞬时表达分析

本研究利用PCR技术从三倍体毛白杨（（Populus tomentosaxP．bolleana）xP．tomentosa）基因组DNA中扩增获得抗病相关PtDRG02基因的一个启动子区（包括其下游5’端非编码区序列）,命名为Ptp01。以β-葡萄糖苷酸酶（舢）基因为报告基因,构建了PtDRG02基因启动子植物表达载体Ptp01／gus。以根癌农杆菌EHA105及LBA4404感受态细胞为受体,转化植物表达载体Ptp01／gus进行瞬时表达,并对启动子进行了功能活性分析,结果表明该启动子能够驱动gus报告基因在毛白杨叶片组织中表达,但表达强度弱于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子。     

OsCRY2基因抑制表达对水稻主要农艺性状的影响

利用已公布的水稻OsCRY2基因序列设计引物,扩增部分基因片段,成功构建了ihpRNA植物表达载体pSC1301-347-OsCRY2,并通过农杆菌介导法将OsCRY2干扰片段导入水稻获得了转基因植株。根据转基因植株主要农艺性状的表现,分析了该基因的功能。结果表明,抑制OsCRY2基因表达会强烈延迟水稻开花与成熟;转基...     

巴西橡胶树HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5＇调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。