克隆包含以拟南芥为寄主的甘蓝黑腐病菌Xcc1067无毒基因的DNA片段

本研究探索了以拟南芥为寄主的甘蓝黑后病菌的致病条件，观察了其病症的发展．建立了菌株Ｘｃｃ１０６７的ｐＩＪ３２００为载体的基因文库，从基因文库中筛选出拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ为寄主的Ｘｃｃ１０６７菌株的无毒基因克隆，该克隆的进一步分析正在进行。     

十字花科黑腐病菌中调控致病相关基因hpaS的XC_2486基因鉴定

十字花科黑腐病菌hpaS影响致病性、HR其编码产物分别与HpaR2、HrpG形成双组分系统。为了深入了解hapS的表达调控机制,本研究将hpaS的启动子与蔗糖敏感基因sacB融合,构建了hpaS的表达报告质粒pL6sacB3670并导入十字花科黑腐病菌野生型菌株8004中,获得了报告菌株8004/pL6sacB3670。然后利用转座子EZ：Tn5对该报告菌株进行诱变,筛选到一株转座子EZ：Tn5插入基因组的克隆。通过测序定位分析发现该克隆是由转座子EZ：Tn5插入到编号为XC_2486的ORF所产生的。然后将hpaS启动子与报告基因gusA融合的报告质粒pL6GUS3670分别导入野生型8004和XC_2486的突变体239C02中,测定比较pL6GUS3670的GUS表达水平,结果显示在突变体背景下GUS表达水平明显比在野生型背景下降低。这表明XC_2486正调控hpaS的表达。对XC_2486突变体239C02进行致病性和过敏反应检测发现,XC_2486与致病性相关,与HR无关。     

转座子报告基因Tn5gusA5诱变甘蓝黑腐病菌分离与致病相关的突变体

构建携带报告基因的转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５于广谱性ｃｏｓ质粒ｐＬＡＦＲ１上，利用Ｔｎ５ｇｕｓＡ５诱变野生型甘蓝黑腐病黄单胞菌，筛选与致病性有关的因子（胞外多糖，胞外酶）突变体，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和报告基因ｇｕｓ表达验证，突变体是由转座子诱变所致。     

十字花科黑腐病菌中一个与黄色素合成相关基因的鉴定

十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）能够产生大量的胞外多糖。胞外多糖商品名又称为黄原胶,具有广泛用途,在食品生产中可作为添加剂使用。为了得到不含黄色素的黄原胶,我们采用转座子EZ-Tn5随机插入诱变的方法对8004菌株进行突变,获得了一株不产黄色素的突变体。通过对突变体的转座子EZ-Tn5插入位点进行分析,发现该突变体是由于编号为XC_4097的基因被插入突变后衍生而来。同源性分析表明XC_4097编码一种脂质酰基转移酶,它与脂质的合成有关。采用同源双交换方法构建XC_4097基因的缺失突变体。通过对野生菌、突变体以及功能回补体的表型分析进一步证实了XC_4097基因功能的丧失只影响黑腐病菌黄色素的合成,而不影响细菌生长以及胞外多糖的合成。这为工业上生产无黄色素的黄原胶提供了应用基础。     

转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获胞外多糖突变体的验证

利用转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５上的抗性基因,通过“鸟枪法”克隆到用这种转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获得的三个胞外多糖突变体菌株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７中的转座子及其相邻序列的ＤＮＡ片段,并利用含有这些片段的重组质粒,通过标记置换构建了突变体。通过检测标记置换突变体的胞外多糖产量及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,证实了胞外多糖突变株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７不仅确系转座子插入所致,而且转座子插入的位点分布在染色体的不同区域。从而证实了我们所报道的诱变体系是可行的     

3种接种方法对十字花科黑腐病菌Xcc8004菌株在拟南芥Col-0上致病力的影响

十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pathovar carnpestris,Xcc）是引起十字花科植物黑腐病的病原菌,也是研究寄主与病原微生物相互作用分子机理的模式菌之一。Xcc可以感染白菜、萝卜和甘蓝等十字花科农作物,也可以感染重要的模式植物拟南芥（AroJoidopsisthaliana）。由于拟南芥的全基因组测序已经完成,因此,拟南芥是研究寄主植物对Xcc浸染的防卫反应的分子机理的最理想的寄主材料。但是,到现在为止,一套完善的在拟南芥上进行xcc致病检测的实验系统还没有建立。为此,本研究比较了“叶片压渗法”、“剪叶法”和“叶片中脉穿刺法”这3种常用的病原细菌接种方法对Xcc的实验室菌株8004f以下简称Xcc8004）在哥伦比亚生态型拟南芥似．thanlianaecoype Colombia0,Col-0）上的致病力的影响。结果发现,在拟南芥Col-0叶片上用“叶片压渗法”接种Xcc8004可以引起明显致病症状,而用“剪叶法”和“叶片中脉穿刺法”接种均不能引起病症。这一结果说明,不同的接种方法的对Xcc在拟南芥上的致病力有很大的影响。因此,要在拟南芥Col-0上进行Xcc8004的致病力检测,本研究建议采用“叶片压渗法”而不用“剪叶法’和“叶片中脉穿刺法”。此外,本研究还建立了一套简易的拟南芥试验用苗的栽培方法。     

甘蓝黑腐病菌rPf基因簇对胞外蛋白酶Ⅰ基因表达的调控

甘蓝黑腐病黄单胞菌（ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＰｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）产生的胞外蛋白酶Ⅰ在致病的早期阶段起重要作用，该酶以及其它胞外酶和胞外多糖的合成受一致病因子调控基因簇（ｒＰｆ基因簇）的正向调控。本研究利用带有β－半乳糖苷酶报道基因（ｌａｃＺ）的转座子Ｔｎ５－Ｂ２０诱变蛋白酶Ⅰ基因克隆，获得了ｌａｃＺ在蛋白酶Ⅰ基因启动子控制下表达的Ｔｎ５－Ｂ２０插入突变质粒。通过将这种突变质粒导入野生型和各ｒｐｆ基因突变体菌株后，测定ｌａｃＺ基因在细胞生长周期中的表达水平，不仅进一步证实了这些ｒｐｆ基因对蛋白酶Ⅰ基因的正向调控作用，而且明确了它们的调控水平．发现ｒｐｆＡ、ｒｐｆＣ、ｒｐｆＥ、ｒｐｆＧ或ｒｐｆＨ突变后，蛋白酶Ⅰ基因的转录会降低９０％左右，而ｒｐｆＢ突变后，蛋白酶Ⅰ基因的转录只降低４８％。     

十字花科黑腐病菌hrpG基因原核表达

在十字花科黑腐病菌（Xcc）中,hrp基因对寄主的致病性和非寄主的超敏反应中起核心作用,而hrpG对整个hrp基因簇起调控作用。HrpG为OmpR家族的双组分系统感受调控蛋白,含有两个结构域,分别是N端Response_reg和C端Trans reg_C。本研究利用表达载体pQE-30Xa,成功构建了HrpG的表达重组子,在E.coliM15[pREP4]中进行诱导表达。通过调节诱导温度、IPTG浓度和诱导时间最终确定在温度为20℃,IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导表达4h。hrpG基因在宿主细胞E.coli M15获得高效可溶性表达。目前尚未有可溶性HrpG蛋白获得成功表达的报导,本研究中获得HrpG蛋白在大肠杆菌获得大量可溶性的表达,将为in vitro研究HrpG的生理活性,特异的结合位点和调控功能研究打下良好基础。     

大肠杆菌转录后调控蛋白CsrA的C末端具有抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性的功能

CsrA（在有些细菌例如十字花科黑腐病菌中也称为RsmA,统称CsrA／RsmA）是一类在细菌中广泛分布而且氨基酸序列非常保守的RNA结合蛋白。研究表明,CsrA／RsmA作为转录后全局调控因子参与了包括细胞碳代谢、次生代谢、运动性、生物被膜形成以及动植物病原菌的致病过程等许多细胞过程的调控。CsrA／RsmA在不同的细菌中的生物学功能各有异同。在大肠杆菌中,CsrA的主要功能是控制细胞的碳代谢、运动性和生物被膜形成;而在十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestrispathovarcampe5tris,Xcc）中,CsrA的同源蛋白RsmA的主要功能除了控制碳代谢、运动性和生物被膜形成外,还控制致病性和胞外酶的产生。大肠杆菌的CsrA（CsrAEcoli）是否具有XccRsmA（RsmAXcc）的功能？为了回答这个问题,我们用大肠杆菌的csrA基因（csrAE.coli）互补Xcc的耶剃基因（rsmAXcc）的缺失突变体DM2506。结果显示,csrAE.coli能够互补DM2506的所有表型,说明csrA。瑚具有RsmAXcc的全部功能。更重要的是,我们发现,无论是瑚,叫枷突变体还是野生型菌株,导入表达CsrAE.coli扰的质粒后均导致其致胞外蛋白酶活性的严重下降,证明CsrAE.coli,以具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的作用。进一步的实验证实,CsrA E.coli的C末端第53～61位氨基酸残基具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的功能。     

野油菜黄单胞菌XC3813-3815基因启动子的定位分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（简称Xcc）是十字花科作物黑腐病的病原菌,同时也是发酵工业生产黄原胶的菌种。在以前的工作中,证实了Xcc8004菌株基因组中一个包含XC3813-3815三个基因的新位点与致病性和胞外多糖（EPS,又称黄原胶）合成有关。本工作通过PCR合成包含相应ORF及其上游不同长度的DNA片段,并克隆于不带启动子的质粒载体pLAFR6后,将所获的重组质粒互补相应的突变体。通过这一功能互补的方法,确定了这三个基因在其ORF上游约50bp内分别拥有自身的启动子。     

野油菜黄单胞菌XC1892基因与致病力关系的分析

野油菜黄单胞菌野油菜变种(简称Xcc)是十字花科作物黑腐病的病原菌。在前期工作中,从Xcc8004菌株获得1株编号为XC1892的基因的转座子Tn5gusA5突变体,其致病力降低。根据基因组注释,XC1892编码1个DsbE蛋白,参与细胞色素的合成。为评估XC1892的功能,采用自杀质粒pK18mob对XC1892进行诱变,获得非极性突变体1892nk。对突变体的表型分析发现,其致病力及胞外多糖产量分别是野生型的59%和55%。用一段包含XC1892基因的DNA片段对突变体1982nk进行功能互补,其致病力和胞外多糖产量基本得到恢复。这表明XC1892基因与Xcc的致病力和胞外多糖合成产量有关。     

互补野油菜黄单胞菌野油菜致病型T113突变体胞外多糖产生的DNA片段的克隆

以从野油菜黄单胞菌野油菜致病型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）胞外多糖突变体Ｔ１１３中克隆的含转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５及其两侧相邻序列的１２．３ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ片段为探针,从野生型菌株８００４中克隆到与突变位点相对应的６．５ｋｂＥｃｏＲＩ片段,克隆于载体ｐＬＡＦＲ３上的该片段能反式互补突变株Ｔ１１３的胞外多糖产生,说明该片段上含有至少一个与胞外多糖产生有关的基因。     

野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品制备方法的建立

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc）是十字花科植物黑腐病的病原细菌。我们建立了Xcc的蛋白质组学研究平台,用于分离、鉴定该菌的致病相关蛋白。为了减少胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）对蛋白材料质量的影响,我们构建了EPS缺陷的Xcc8004ΔgumB突变体。本研究以Xcc8004ΔgumB出发菌株,用诱导培养液培养,取细胞上清通过超滤浓缩得到蛋白质粗提物,分别采用丙酮沉淀法、试剂盒纯化法和丙酮沉淀-试剂盒联用法来纯化蛋白质粗提物,通过比较双向电泳的结果优选最佳的样品制备方法。结果证明丙酮沉淀-试剂盒联用法较为理想,所得双向电泳图片清晰,分辨率高。因此,此方法可以用于制备野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品,并可以满足进一步研究的需要。     

不同接种浓度对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种胞外多糖突变体致病性的影响

利用转座子 Tn5gus A5诱变和标记置换方法 ,构建了野油菜黄单胞菌野油菜致病变种( Xanthomonas campestris pv.campestris)系列标记置换突变体 ,其中 6个突变体的胞外多糖产量显著降低。致病试验结果表明 ,胞外多糖产量对 Xcc的致病性有明显的影响 ,不同接种浓度对 Xcc胞外多糖突变体致病性亦有明显影响。