植物EST-SSR标记开发及其应用

随着生物科技的进步,大量的植物表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）已经成为开发SSR标记的重要资源。EST-SSR作为一种新型分子标记,其多态性可能与基因功能直接相关,而且在相近植物间具有良好通用性,使得EST-SSR标记在实际应用中更具价值。采用计算机方法大规模发掘EST-SSR多态性位点极大地提高了SSR标记开发效率。尤其随着新一代测序技术的成熟以及测序成本的急剧下降,利用新一代测序技术产生大量的转录组数据进行EST-SSR多态性标记的计算机大规模发掘将对SSR标记的开发带来深远影响。本文简要介绍了植物EST-SSR分布特点,并对EST-SSR标记开发现状以及相关应用作了综合评述,此外,还对EST-SSR标记的计算机开发新策略进行了展望。     

绵羊皮肤源EST-SSR标记与羊毛性状的关联性分析

为了筛选与绵羊(Ovis aries)毛性状基因座连锁更强的分子标记,本研究选择9个多态性丰富的绵羊皮肤源EST-SSR位点,检测了德国美利奴羊与中国美利奴羊级进杂交F2代群体的遗传多态性,并分析了标记与毛性状间的关联性.分析结果显示,所选的9个EST-SSR位点在供试群体中共检测到39个等位基因,多态性丰富,其中的6个位点基因型间存在显著差异;其中,与自然长度关联的位点有5个,与伸直长度关联的位点有4个,与纤维直径关联的位点有3个.6个EST-SSR位点基因型间存在显著差异;关联性标记对羊毛性状相关效应的F检验结果表明:33176918位点和33176988位点分别对羊毛自然长度、纤维平均直径具有显著的遗传效应(P＜0.05).研究结果提示,与羊毛性状相关的6个位点中,33176918号位点对羊毛的自然长度有较大的标记效应,该位点的CD基因型是羊毛自然长度的有利基因型;33176988号位点对羊毛的纤维直径有显著地标记效应,该位点的BC基因型是纤维直径的有利基因型.这两个位点可能与控制毛形状的基因座紧密连锁.     

基于EST-SSR标记的MCID法鉴定冬瓜种质资源

种质资源鉴定是研究与利用冬瓜种质资源的基础.为了明确冬瓜种质资源遗传多样性,本研究基于表达序列标签-简单重复序列(EST-SSR)分子标记的人工绘制品种鉴别示意图(MCID)法鉴定40份冬瓜种质资源.利用筛选出的7对引物对冬瓜种质资源进行PCR扩增,应用MCID法构建冬瓜品种鉴定图.结果表明,利用7对引物扩增的特征性谱...     

菠菜转录组SSR位点分析及其分子标记的开发

简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)分子标记具有多态性高、重复性好、共显性等特点,己广泛用于蔬菜作物遗传育种研究中.本研究利用MISA软件对菠菜(Spinacia oleracea)转录组SSR位点信息进行分析,开发适用于菠菜的SSR分子标记,并对不同菠菜材料的遗传多样性进行分析.结果显示,在获得的44 796条基因簇(Unigene)中检测出2 045个SSR位点,检测出2 045个SSR位点,分布在1 940条Unigene上,发生频率为4.33％,平均距离为19.81 kb.菠菜SSR中以单、三、四核苷酸重复为主,分别占总SSR的19％、65％和7％,重复长度主要为18～24 bp,占菠菜总SSR的93.55％,以重复次数6次和7次为主,分别占菠菜总SSR的31.42％和31.05％.菠菜转录组中单核苷酸重复类型为A/T,二核苷酸重复主要为GA/TC和AG/CT,三核苷酸重复主要以CAA/TTG、GTT/AAC、GAA/TTC、TGT/ACA和GAT/ATC为主.本研究共设计了2 199对SSR特异位点引物,随机挑选218对引物对9个不同类型的菠菜材料进行扩增检测,其中38对表现出多态性.利用UPGMA做图进行聚类分析,9份菠菜材料聚为3类.本研究通过对菠菜转录组SSR位点信息分析及其分子标记的开发,获得了多态性较为丰富的SSR位点,为菠菜遗传多样性的分析、遗传图谱的构建及分子标记辅助育种提供了基础资料.     

利用生物信息学方法进行基于表达序列标签的玉 米单核苷酸多态性标记的开发

针对简单重复序列（SSR）标记密度不足、单核苷酸多态性（SNP）标记开发一般只基于2种基因型的序列差异,用以检测其他基因型的材料时多态性不高,不能满足玉米基因精细定位需要的现状,本研究从公共数据库下载来自不同遗传背景的玉米表达序列标签（EST）,结合运用各种生物信息学软件,开发基于EST序列的高多态性SNP标记。通过对2018530条EST序列的比对分析,拼接发掘出遍布全基因组的80363个SNP位点。在SNP位点两侧保守序列上设计PCR引物,开发出12388 个SNP标记（www.sicau.edu.cn/web/yms/snp/snp.html）,包含34721个SNP位点。其中,6008个标记只含单一SNP位点,12762个位点的多态性信息含量（PIC）大于04,具有高度多态性。     

松树、杨树及桉树表达基因序列微卫星比对分析

微卫星是生物基因组中变异频率最快的序列,结构基因中微卫星重复数的变化会引起基因的框移突变,导致基因表达完全不同或截短的蛋白。因此在进化过程中,基因区微卫星会受到强烈选择的影响。为研究基因区微卫星在不同树种中的变化情况,在本研究中,利用SPUTNIK程序分析了NCBI数据库中松树（Pinus spp.）、杨树（Populus spp.）及桉树（Eucalyptus spp.）的表达序列标签（express sequence tag,EST）序列各3万条。结果显示,桉树和杨树EST序列含有微卫星的比例比较接近,分别为18.7%和15.3%,而在松树中则发生了较大分化,只有8.2%。研究发现,三碱基重复单元是这3个树种编码序列中微卫星的主要重复类型。除三碱基重复微卫星外,桉树和杨树EST序列中其它类型微卫星的丰度随着重复单元长度的增加而减少,而在松树中则呈相反现象。同时值得注意的是松树EST序列中变异频率快的微卫星（〉20bp）数量明显比桉树及杨树少。研究还发现,3个树种中微卫星获得或丢失重复单元的速率都随着重复单元的增加而降低。本研究首次报道了不同树种基因区微卫星比较研究,发现了一些松树与杨树、桉树相比较EST序列中所含微卫星在丰度及变异频率方面存在的异同。基因所含微卫星序列对基因的功能有重要影响,本研究的结果将为了解不同树种中基因区微卫星的特征提供重要参数,同时也将为利用所研究树种的EST序列开发多态性高的微卫星标记提供有益的生物信息学参考。     

遗传图谱构建时标记的选择与表达序列标签

表达序列标签(EST)是一种快速有效揭示基因组容量的方法。ESTs在新基因的发现、基因作图和基因组序列编码区域的确定等方面起到重要作用。综述了遗传图谱构建时标记选择及EST的应用。     

核桃EST-SSR标记的开发

从GenBank数据库上公布的5025条核桃（Juglans regia）EST序列中,用SSRHunter软件搜索到485条EST序列中含有540个SSR,SSR出现频率为10.75%,SSR-ESTs检出率为9.7%。利用检出的SSR-ESTs序列设计SSR引物43对,对6个核桃样品、1个黑核桃（J. nigra）样品和1个核桃楸（J. mandshurica）样品进行了PCR扩增,其中40对引物有扩增带,占设计引物的93%,35对引物有多态性,占可扩增引物的87.5%。在有多态性的35对引物中,27对引物在核桃种内有多态性;8对引物在核桃种内无多态性,而在核桃、核桃楸和黑核桃种间有多态性。应用UPGMA方法对检测样品进行聚类分析,结果与传统分类一致。     

大白菜表达序列标签SSR标记分析*

对大白菜（Brassica campestris L．ssppekinensis）13007个EST序列进行拼接共得到7714个片段重叠群（contig），其中10．4％（890个）非冗余EST含有SSR标记（EST-SSR），标记间平均间隔距离为3．9kb，单、双和三核苷酸重复序列大约各占1／3左右。CDS所包含的三核苷酸重复序列最多，而且AAG／CTT重复序列的含量最高。通过同源性比较分析，获得功能已知的SSR-ESTs774个，共计含有846个SSR，其中50．2％位于5＇-UTR，31．4％位于3＇-UTR，18．4％位于CDS。实验选取123个SSR座位设计引物，利用芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的高抗和高感大白菜F6代自交系材料各2份，分析EST-SSR标记多态性。结果表明，其中37个标记可进行有效扩增，但是没有表现出多态性，23个标记（18．7％）至少在1份材料中具有多态性。对这些EST-SSR标记在大白菜和其它芸薹属植物的系统发育关系分析、遗传作图和基因定位的应用进行了讨论。     

厚朴转录组特征分析及EST-SSR标记的开发

为探明厚朴的基因组信息,开发合适的生物学工具以促进厚朴的遗传育种,本研究利用Illumina-Solexa测序技术对厚朴根、茎皮、叶不同组织的9个样本进行转录组分析,获得大量的序列信息,并以转录组序列为基础进行厚朴SSR分子标记的大规模发掘。结果表明,共获得了109 526条厚朴转录组序列,平均序列长度为1 023 bp,通过与蛋白数据库NR、Swiss-Prot、GO、KOG和KEGG五个数据库比对,分别有6 0361、39 942、65 535、51 351和27 310条厚朴转录组的Unigene被注释;厚朴转录组表达信息进行大通量SSR位点的发掘,发现了含SSR位点的序列25 925条,共27 721个SSR位点,SSR出现的频率为23.67%。厚朴转录组共发现了374种碱基重复模式,且CT/GA和AG/TC是主要的双碱基重复序列,AGA/TCT和AAG/TTC是主要的三碱基重复序列;随机挑选的180对SSR引物中有104对产生清晰可重复的条带,21对引物具有多态性,厚朴SSR引物多态性较高。本研究结果为厚朴及近缘种的遗传多样性分析、遗传图谱构建及比较基因组研究奠定了一定的理论基础。     

基于PCR的SSR标记分离方法综述

SSR分子标记是目前应用最广泛的第二代共显性分子遗传标记。SSR标记具有物种特异性,要应用该方法需要提前开发相应物种的特异SSR标记,而获得微卫星标记的经典方法是通过构建基因组片段文库和特殊标记SSR探针杂交法获取,这些方法经济成本相对较高且耗时耗力。近年来,该领域的研究中积累了很多研究成果和技术改进,发展起来几种基于PCR简便易操作且节约成本的SSR标记分离方法,例如基于RAPD的微卫星分离方法、基于ISSR抑制PCR扩增法、序列标签微卫星分析法、选择性扩增微卫星分析法以及荧光ISSR-PCR分离微卫星和微卫星扩增文库法等。本文主要对这些方法逐一进行综述,旨在为各个物种SSR标记的开发提供参考。     

铁皮石斛EST-SSR分子标记的开发

为了开发铁皮石斛EST-SSR分子标记,利用SSRIT软件对铁皮石斛近缘物种-金钗石斛的15 383条EST序列进行SSR位点查找,利用Primer 5和Oligo 7软件进行引物设计和评价,之后经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行初步筛选,并通过聚丙烯酰氨凝胶电泳对所筛选的引物进行有效性检测。结果表明,SSRIT软件共查找到370条SSR位点序列,共有379个SSR位点,候选SSR位点出现的频率为2.46%。二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占41.42%、26.91%和27.44%,其中二核苷酸重复中AG/CT(20.84%)和GA/TC(18.73%)最丰富;三核苷酸重复中TCT/AGA(4.22%)和GA/TC(3.96%)最丰富;而六核苷酸重复基元较多。EST-SSR平均长度为24 bp,平均每8.5条EST序列包含1个SSR位点。设计的106对EST-SSR引物中有50对能扩增出理想的PCR产物,引物有效扩增率为47.17%,其中有43对能够扩增出多态性条带,占可扩增引物的86%。本研究开发的43对引物为铁皮石斛遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建和功能基因研究等提供了重要的参考价值。     

紫楠转录组EST-SSR标记开发及通用性分析

紫楠(Phoebe sheareri)是商品材金丝楠木的原植物种之一,现存野生资源日益减少,为了进一步掌握其遗传多样性和遗传结构特征,大规模开发该种表达序列标签-简单重复序列(expressed sequence tag-simple sequence repeat,EST-SSR)标记迫在眉睫。本研究首次进行紫楠转录组高通量测序,挖掘SSR位点和开发EST-SSR标记,并进行引物的初步验证以及在楠属植物的通用性检测。结果显示,通过Illumina Hiseq 2500测序共获得43 781条Unigene,应用MISA软件鉴定了6 958个SSR位点,分布频率为15.89%,平均每5.31 kb出现1个SSR位点。紫楠SSR位点共包括340种重复基元,以二、三核苷酸为主,其优势重复基元分别为AG/CT(23.99%)和AAG/CCT(12.81%)。基于不同重复基元类型设计合成了94对SSR引物,以10份紫楠及同属4种楠木的基因组DNA为模板对其有效性及通用性进行初步验证,筛选出具有清晰扩增产物的引物41对,其中32对具有多态性,其平均等位基因数2.75个,观察杂合度(heterozygosity,Ho)、期望杂合度(heterozygosity,He)、多态信息含量(polymorphism information content,PIC)分别为0.369、0.563和0.541,且在同属材料中通用性较高。紫楠转录组测序获得的Unigene可作为SSR标记开发的有效来源,所获得的EST-SSR引物可为紫楠及楠属其他树种的遗传结构分析、种质资源利用及遗传图谱构建提供有效的分子标记。     

水稻、菠菜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)重组蛋白表达及酶活性分析

本研究目的是通过基因克隆、原核表达和蛋白纯化技术获得水稻(Oryza sativa subs.japonica)、菠菜(Spinacia oleracea)甜菜碱醛脱氢酶基因(OsBADH和SpBADH)的融合蛋白,体外测定两者的醛脱氢酶活性,说明水稻存在OsBADH且具有醛脱氢酶功能。通过RT-PCR成功克隆了OsBADH和SpBADH基因的全长序列,二者氨基酸序列同源性为70.8%。OsBADH和SpBADH的重组质粒均可在大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE分析表明,经0.4mmol/LIPTG诱导的融合蛋白条带约70kD。两者的表达产物经TALON金属螯合树脂纯化后进行酶活测定,结果显示都具有甜菜碱醛脱氢酶活性。OsBADH的比活力为74.87nmol/min/mg,对照SpBADH比活力为86.84nmol/min/mg,表明OsBADH能够有效行使醛脱氢酶功能,而高效液相色谱法未在水稻叶片中检测出甜菜碱。研究结果提示,水稻可能并非由于BADH自身不具有酶活而不积累甘氨酸甜菜碱,该研究为进一步探讨水稻中甜菜碱合成的分子机制提供了研究基础。     

换锦花EST-SSR标记开发及遗传多样性分析

为开发换锦花EST-SSR标记和分析其遗传多样性,本研究利用MISA软件对换锦花转录组信息进行SSR位点检测,再利用Primer3.0设计引物,经PCR扩增和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测引物的有效性和多态性,并绘制换锦花种质资源的聚类图。结果表明,共检测到9 918个SSR位点,发生频率为18.59%,分布距离为3.729 kb;SSR位点重复单元为1~3个碱基,其中,单碱基重复三碱基重复二碱基重复,分别占SSR总数的61.08%、23.22%和14.23%,四碱基及以上重复单元相对较少。共设计出9 302对SSR引物,随机选取并合成278对引物进行PCR扩增,能够清晰扩增出的引物有185对(66.55%),在石蒜属的七个种中具有多态性的有59对(31.89%),其中11对(18.64%)能够在浙江和江苏种群的30份换锦花种质资源表现出丰富的多态性。综上,本研究开发的EST-SSR标记具有丰富的多态性,在换锦花以及石蒜属植物的遗传多样性分析、杂交种鉴定及遗传图谱的构建应用中具有重要意义。     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的分离和诱导表达

植物体内的甜菜碱由胆碱经两步不可逆的氧化反应合成，甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase，BADH)是合成甜菜碱的关键酶，催化甜菜碱醛氧化为甜菜碱。本研究从菠菜叶片中分离了BADH基因，并将该基因与其它植物的BADH序列作了同源性分析，同时，证实了菠菜BADH基因的转录与表达受干旱和盐胁迫的诱导。     

不同浓度牛蒡提取液对菠菜生长及品质的影响

通过盆栽试验,研究了不同浓度牛蒡提取液对菠菜生长及品质的影响.结果表明,与清水对照相比,喷施30～1500 mg/L牛蒡提取液可使菠菜鲜重增加10.8%～30.0%;可能由于"稀释效应",叶绿素含量降低2.7%～15.7%;Vc含量提高46.1%～136.4%;硝酸盐含量降低 23.2%～69.2%;草酸含量降低 22.3% ～67.6%.其中,对叶绿素含量、Vc 含量、硝酸盐及草酸含量的效应,都以 30 mg/L 处理的效果最好.而鲜重方面,30 mg/L处理与效果最好的 500 mg/L处理之间差异亦不显著.因此,从对菠菜的生长情况、品质情况及经济角度综合考虑,牛蒡提取液应用在菠菜上的适宜浓度为 30 mg/L.     

易变山羊草中抗虫相关基因cDNA部分片段的克隆及序列分析

易变山羊草是小麦近缘种植物，对禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)、根结线虫(Meloidogyne naasi)都具有很高的抗性。本实验根据小麦另一近缘种植物节节麦的抗虫基因Cre3保守区核苷酸序列设计合成正向引物，通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)从易变山羊草的RNA中扩增出抗虫相关基因部分cDNA片段。     

人参EST-SSR标记的建立

从7055条人参EST序列中共搜索出791个SSR。根据引物设计标准,设计了68对EST-SSR引物。在合适的PCR反应体系下,分别以人参品种集安长脖、抚松二马牙的DNA为模板,对设计的EST-SSR引物进行筛选,发现有43对EST-SSR引物能扩增出产物。在9个人参品种、2个西洋参品种和2个刺五加品种中进一步对这些可扩增的引物对进行多态性检测,发现有26对引物显示多态性,占可扩增引物的60.47%,占设计引物总数的38.23%。本研究结果表明,根据人参EST建立EST-SSR标记是一种行而有效的的方法。     

增铵对菠菜生长及品质的影响

通过水培试验研究不同NH4+-N/NO3--N比例(100/0,25/75,50/50,0/100)对4个菠菜品种地上部和根系生长、以及植株不同部位硝酸盐、水溶性糖含量的影响。结果表明,在NH4+-N/NO3--N比例为0/100时,各品种菠菜的生物量最大,而随着NH4+-N/NO3--N比例的增加,各品种菠菜的生物量和硝酸盐累积量均呈递减趋势,而水溶性糖含量则呈递增趋势,说明增铵能提高菠菜品质,但不能增加菠菜的产量。