月季MYB转录因子基因RcWER-like的克隆及表达分析

MYB转录因子在植物响应盐胁迫过程中起着重要的调控作用。为明确MYB类转录因子RcWER-like生物学功能,本研究以月季月月粉为材料,利用生物信息学分析及实时荧光定量PCR技术研究RcWER-like基因在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组织不同时间点的表达特性。结果表明,依据转录组测序获得的序列信息和月季全基因组信息克隆得到了RcWER-like,该基因全长为882 bp,开放阅读框(ORF)为669 bp,编码223个氨基酸。序列比对发现,RcWER-like在N端具有保守的R2R3-MYB结构域。系统进化树分析结果显示,RcWER-like与桃PpWER-like、梅花PmWER-like、苹果MdWER-like处于同一分支,属于R2R3-MYB类转录因子。实时荧光定量PCR结果表明,RcWER-like基因在盐胁迫处理24 h后表达明显上调,且外施水杨酸和茉莉酸甲酯均可诱导RcWER-like的表达;在盐胁迫下,外施水杨酸和茉莉酸甲酯可诱导RcWER-like的表达,且均高于单独盐或激素处理。此外,月季RcWER-like在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组...     

牛肌细胞生成素基因(MyoG)启动子的活性及组织特异性分析

肌细胞生成素(myogenin,MyoG)在肌肉细胞分化过程中起着中心调控的作用。为了研究牛(Bos)MyoG基因启动子的启动效率和组织特异性。本研究首先克隆了牛MyoG基因启动子区域,以pDsRed2载体为外源载体,红色荧光蛋白为目的基因,构建了pDsRed-BosMyoG真核表达载体。利用脂质体介导转染体外培养的绵羊(Ovis aries)骨骼肌卫星细胞和成纤维细胞,最后通过实时定量PCR和Western blot检测红色荧光蛋白的表达,从而确定牛MyoG基因启动子的启动效率及组织特异性。结果显示,pDsRed-BosMyoG转染绵羊骨骼肌卫星细胞后在显微镜下可观察到红色荧光蛋白的表达,但在转染后的成纤维细胞中并没有观察到红色荧光蛋白的表达。在mRNA水平上,转基因骨骼肌卫星细胞中红色荧光蛋白mRNA表达量明显高于转基因成纤维细胞(P0.01)。Western blot结果显示,转基因骨骼肌卫星中高表达红色荧光蛋白,而在转基因成纤维细胞中并未检测到此蛋白。结果表明,本研究克隆得到的牛MyoG基因启动子可以特异性的在绵羊骨骼肌卫星细胞中驱动外源基因的高表达,是一种有效的肌肉细胞特异性启动子。克隆MyoG基因的启动子,探讨启动子区域的启动活性,有助于从理论上揭示MyoG基因表达的关键调控位点,同时也有利于揭示肌肉发育调控的相关机理,为改良家畜肉质研究提供实验依据。     

猪背膘组织二脂酰甘油酰基转移酶基因(DGAT1和DGAT2)的发育性表达分析

酰基辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶(acyl-coA:diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是催化甘油三酯合成最后一步反应的关键酶,包括DGAT1和DGAT2两种;阐明其在发育过程中的表达规律对于找到控制中外猪种脂肪沉积能力差异的基因十分必要.本研究分别用RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR的方法分别对莱芜猪和杜洛克3日龄仔猪和成年猪背膘组织中DGAT1和DGAT2 mRNA表达量进行了分析.结果表明,莱芜猪和杜洛克成年猪DGAT1 mRNA的表达量均高于3日龄仔猪,分别为5.0倍和2.7倍;成年猪DGAT2 mRNA表达量高于3日龄仔猪,分别为27.6倍(P＜0.01)和4.8倍(P＜0.05).两品种成年猪和3日龄仔猪DGAT2基因表达量的变化均高于DGAT1.品种间同一发育时期比较,杜洛克3日龄仔猪背膘组织中DGAT2基因的表达量高于莱芜猪,但成年莱芜猪背膘组织中DGAT2基因的表达量高于杜洛克,差异均不显著(P＞0.05).提示DGAT2基因可能与中外猪品种脂肪沉积能力的差异有关.     

湖羊生长分化因子9（GDF9）基因组织表达特征、mRNA表达水平与SNPs分析

生长分化因子9(GDF9)是TGF-β超家族的一个成员,在早期卵泡的生长和分化过程中起着重要的调节作用.试验采用RT-PCR和实时荧光定量PCR对湖羊GDF9的组织表达、发情期单羔和三羔湖羊卵巢组织mRNA表达水平进行了研究:用PCR-RFLP法对湖羊群体GDF9外显子1第152位点的多态性进行了分析.组织表达谱分析发现GDF9基因在湖羊的下丘脑、垂体、卵巢、子宫、输卵管、心、肝、脾、肺、肾等组织中均有表达;实时荧光定量PCR结果表明,三羔湖羊卵巢组织中GDF9基因mRNA表达水平显著高于单羔湖羊(P<0.05);PCR-RFLP法没有检测到湖羊GDF9基因cDNA第152处发生的单碱基突变(A→G).研究提示GDF9基因mRNA表达水平与湖羊的繁殖性状有一定的关系,在湖羊群体中的多态性还有待于进一步研究.     

西农萨能羊胰岛素诱导基因2(INSIG2)的克隆及组织表达分析

胰岛素诱导基因2(insulin induced gene2,INSIG2)是参与脂质形成和代谢调控的重要基因,而山羊乳腺中脂质合成和代谢与乳品质密切相关。为进一步明确它们之间的关系进而为改善山羊乳品风味提供科学支持。本实验以西农萨能羊(Capra hircus)乳腺组织为研究材料,采用RT-PCR技术克隆山羊INSIG2基因,并采用实时荧光定量(RT-qPCR)技术在山羊10个组织中对INSIG2基因进行了组织表达分析。研究获得了915bp的cDNA序列(GenBank登录号:JQ361767),其中编码区678bp,该基因编码225个氨基酸,预测蛋白质分子量为24.8730kD,等电点(pI)为8.77。通过核苷酸和氨基酸序列比对分析发现,山羊的INSIG2与GenBank中牛(Bos taurus)的相似性最高。蛋白质结构分析显示,INSIG2存在6个跨膜螺旋;疏水性分析发现,其N端和C端均具有亲水性;遗传距离分析发现,山羊与牛的亲缘关系最近,其次是猪(Susscrofa)。INSIG2基因的组织表达分析表明,INSIG2基因在10个被检测组织中均有表达,且肺组织中表达量最高,肌肉次之,乳腺组织的表达量居中,心脏组织中最低。研究结果为该基因在山羊乳腺组织中的功能研究提供依据。     

SYBR Green I荧光定量PCR法检测朗德鹅填饲前后黑素皮质素受体-4基因(MC4R)的表达

黑素皮质素受体4基因(MC4R)在各组织中的不同表达对于鹅脂肪代谢具有重要作用.本研究应用强制填饲技术建立腹型肥胖朗德鹅(Casuarius casuarius)模型,提取填饲后及正常朗德鹅新鲜腹脂、肝脏等13种组织的总RNA,SYBR GreenI荧光定量PCR法检测各组织MC4R基因的表达,选择β-actin作为内参基因,使用半定量2-△△Ct法分析.PCR结果显示,MC4R基因及β-actin在填饲前后朗德鹅心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肌胃、小肠、胰腺、脑、胸肌、腿肌、腹脂、皮下脂等13种组织中均存在不同程度表达.SYBR Green I荧光定量PCR结果表明,在肾、小肠和心这3个组织中,填饲后朗德鹅MC4R表达量均比对照组中朗德鹅该基因表达量低,填饲后分别为填饲前表达量的0.41±1.80、0.65±5.75和0.72±1.22倍.而在其他组织中,MC4R基因表达量均有不同程度的增加,填饲组/对照组相对表达量倍数由高到低顺序分别为:22.78±1.00倍(脑),9.08±2.80倍(肝),5.28±1.83倍(肺),3.78±3.01倍(胰),3.07±3.64倍(腿肌),2.90±0.97倍(胃),2.34±1.66倍(皮下脂肪),2.18±3.01倍(腹脂),2.07±0.37倍(胸肌),2.01±1.75倍(脾).结果符合MC4R作用机理,为畜牧生产及人类肥胖问题的研究提供间接依据.     

香鱼抗凝血酶基因(AT)cDNA的克隆、序列分析及组织表达特征

抗凝血酶(antithrombin,AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性,并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号:FN429980)。测序结果表明,香鱼AT基因cDNA全长1487个核苷酸,包含1个大的开放阅读框(ORF),推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白,N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构,包括:羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明,香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高,为81%。系统进化树分析表明,物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼AT位于鱼类AT簇中,与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大,在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在鳗利斯顿氏菌(Listone...     

柳枝稷根组织实时定量PCR分析中内参基因的选择

选择表达稳定性高的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析(qRT-PCR)准确性的重要条件。本研究以能源植物柳枝稷(Panicum virgatum L.)根组织为材料,通过不同非生物条件胁迫,利用qRT-PCR技术检测UBQ1(泛素基因)、ACT2(肌动蛋白基因)、UBQ2(泛素基因)、TUB(β微管蛋白基因)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因)、CBP20(类胡萝卜素结合蛋白基因)、UCE2(泛素接合酶基因)、18S rRNA1(18S核糖体RNA基因)、NAC(NAC域蛋白基因)和CYP2(亲环蛋白基因)10个内参基因的mRNA的表达情况,并运用Delta-Ct method,Genorm(ver.3.5)、Bestkeeper(ver.1.0)和NormFinder(ver.0.953)软件综合分析10个内参基因的表达稳定性。结果显示,在不同的非生物环境胁迫条件下,最适合作为柳枝稷根组织研究的内参基因各不相同。10个内参基因平均表达稳定由高到低排序为:ACT2,TUB,UCE2,CBP20,CYP2,UBQ2,18S rRNA1,NAC,UBQ1,GAPDH。在干旱胁迫条件下,ACT2基因表达稳定性最高;在盐胁迫和热胁迫条件下,18S rRNA1基因表达稳定性最高;在冷胁迫和涝胁迫条件下,ACT2基因表达稳定性最高。经软件综合分析显示,ACT2、TUB和UCE2基因最适合作为柳枝稷非生物胁迫研究的内参基因;UBQ1和GAPDH基因最不合适作为内参基因。该研究结果可用于柳枝稷非生物胁迫下各种基因表达的进一步研究。     

2个猪品种的背最长肌组织中兰尼定受体（RYR1）基因表达的发育性变化

本研究采用实时荧光定量PCR方法检测了长白猪和梅山猪背最长肌组织中RYR1基因mRNA表达量在初生（0月龄）、1月龄、2月龄、3月龄、4月龄和5月龄间的变化及其与体重、肌纤维面积（CSA）和肌内脂肪含量（IMF）之间的相关性。结果表明：长白猪的体重、CSA在多数月龄均高于梅山猪,而梅山猪的IMF在多数月龄均高于长白猪。两品种RYR1基因表达量的发育性表达模式极为相似,均表现为波动起伏中逐渐上升的趋势。相同月龄时,梅山猪RYR1基因的表达量均高于长白猪。本文初步揭示了两猪种生长发育过程中RYR1基因表达的发育性变化模式和品种差异,为进一步研究RYR1基因对猪肉质性状的影响提供了基础数据。     

6天龄与10天龄大鼠的睾丸组织的基因差异表达

通过基因芯片技术,利用Roche-NimbleGen公司制作的大鼠12×135K全基因组表达谱芯片,对日龄为6d和10d的大鼠睾丸组织进行全基因组表达差异分析。结果显示：具有2倍以上的差异表达基因有4298个,其中表达上调的基因共1878个,表达下调的基因共2420个。这些差异表达的基因中有3154个基因具有基因本体注释,参与了154个生物学通路。进一步分析表明具有8倍以上差异表达的基因有13个,这些基因参与了生物学过程、细胞组分和分子功能等基因本体分类,进一步选择3个差异表达的基因,LOC686076、Cxcl6和Trib3,做了实时定量RT-PCR检测。其结果趋势与芯片数据一致。因此,我们初步认为精原干细胞的发生与增殖在大鼠早期的发育过程中已经有大量的基因参与,是一个多基因协调表达的过程。     

杨树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）基因启动子的克隆与分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的关键性调控限速酶,其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力NADPH,也为核酸合成提供戊糖;此外,还参加非生物逆境胁迫应答反应。因此,G6PDH对植物的生长发育起着非常重要的作用。本文利用甜杨G6PDH基因和毛果杨基因组序列,通过PCR获得了甜杨G6PDH基因上游1400bp的序列。序列分析结果表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box。此外,还包含多个胁迫诱导元件,如低温诱导元件LTR,盐诱导元件GT-1,抗冻、缺水、脱落酸、抗寒元件MYB和MYC,以及光响应元件L-box、G-box、3AF-1、TC丰富区等。     

苗期干旱对花生抗病相关基因PnAG3的表达及耐旱生理指标的影响

为确定抗病基因PnAG3与花生抗旱性关系,本实验利用土壤盆栽试验,通过控水模拟干旱条件,利用荧光定量方法分析不同程度干旱、苗期不同抗病花生(Arachis hypogaea L.)品种PnAG3基因的表达变化,同时测定它们耐旱生理指标的变化。结果表明,抗病品种在中度干旱胁迫下超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活力分别升高了3.15、2.55和4.95倍,而不抗病品种在3种处理下差异不显著;丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量在不同干旱程度下均有所升高,且不抗病品种升高幅度大于抗病品种;基因PnAG3的表达量在抗病品种中要高于不抗病品种,但抗病品种在中度和重度干旱胁迫下基因表达量出现的峰值较不抗病品种早,与CAT活性的变化相似。整体来看,SOD呈持续上升趋势,而基因PnAG3表达量、POD、CAT和MDA呈现先上升后下降的趋势,结合耐旱生理指标及抗病相关基因PnAG3的变化情况,基因PnAG3表达量变化与耐旱生理指标的变化有相关性,且在抗病品种中基因PnAG3的表达量大于不抗病品种,推测基因PnAG3的功能与花生抗逆性有关。本研究为进一步研究花生抗性育种和种质筛选提供依据。     

Scriptaid处理可提高近交系五指山猪克隆胚胎的发育能力和克隆效率

为探讨一种新型低毒的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid处理克隆胚胎时对其发育能力和克隆效率的影响,本研究以近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植构建重构胚胎,重构胚胎激活后培养在添加Scriptaid不同浓度（0～300nmol/L）的胚胎培养液中培养不同的时间（0～36h）,观察克隆胚胎的卵裂率和囊胚率,评价克隆胚胎体外的发育能力。实验结果发现100nmol/L Scriptaid处理24h组克隆胚胎的囊胚发育率（30.4%）较对照组（17.5%）显著提高,P〈0.05。将100nmol/L Scriptaid处理24h组克隆胚胎和对照组胚胎分别移植到4头受体母猪中,进一步观察其体内的发育能力。处理组克隆胚胎的受体在平均窝产仔数和克隆效率（分别为5头,2.4%）均显著高于对照组（分别为1.5头,0.7%）,P〈0.05。以上结果表明,100nmol/L Scriptaid处理24h近交系五指山小型猪克隆胚胎,有利于提高克隆胚胎的发育能力和克隆效率。     

实时定量PCR检测转基因水稻科丰6号插入拷贝数和转基因含量

建立转基因成分灵敏、准确的定量标识是实施转基因安全阈值管理的一个基本步骤,其中实时定量PCR技术是检测产品中转基因含量的主要技术方法。本研究利用该技术确定了双价(cry1Ac+CpTi)转基因抗虫水稻(Oryzasativa)科丰6号中有3个拷贝的外源基因插入。通过对外源基因Bt和转化事件特异的边界特异序列为对象的绝对定量和相对定量检测方法的研究,发现以边界特异序列为对象的事件特异性检测和以目的基因Bt为对象的检测都能够满足相对定量检测的要求。在100ng基因组DNA中,Bt基因和特异性检测的相对定量检测限分别为0.1%和0.5%,在绝对定量检测中,特异性检测的检测限为5个拷贝。不同检测方法对4个已知转基因含量的样品检测结果与预期均一致。结果表明,以转基因产品占总产品比例为定义的转基因含量的测定中,多拷贝或单拷贝基因为对象的不同定量方法的检测对转基因产品的相对定量结果没有影响,本研究对转基因产品的定量阈值设定具有一定的借鉴意义。     

植物中γ-亚麻酸合成关键酶——△^6-脂肪酸脱氢酶

γ-亚麻酸作为人体必需的不饱和脂肪酸，对人体的激素调节及脂肪酸代谢发挥着重要的生理作用。△^6-脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。本文介绍了不饱和脂肪酸γ-亚麻酸代谢途径中的关键酶△^6-脂肪酸脱氢酶的结构功能与目前△^6-脂肪酸脱氢酶的基因工程研究进展，并对其应用进行了展望，以期为利用基因工程手段生产γ-亚麻酸提供参考。     

河岸带土壤溶解性有机质垂直分布特征及其性质研究

河岸带有机质（Soil organic matter,SOM）的迁移转化在有机碳从陆地生态系统向水域生态系统中迁移转化及污染物的迁移转化中起到了重要的作用。以崇明岛典型河岸带为研究对象,分析了不同区域河岸带土壤有机碳（Soil organic carbon,SOC）、土壤溶解性有机碳（Soil dissolved organic carbon,SDOC）垂直分布特征和三维荧光光谱（Excitation—Emission matrix,EEM）特征,探讨了河岸带对土壤溶解性有机质（Soil dissolved organic matter,SDOM）性质及其潜在环境影响。结果表明：表层土壤（0—30cm）SOC储量占采样深度土壤SOC的40％左右,SDOC占SOC的5％左右,从陆上区域到缓冲区域表层土壤SDOC呈累积效应。河岸带有机质主要来自河岸带植物残体及其代谢产物,地下水也可能是河岸带土壤DOM的另一来源,河岸带土壤中大部分类腐殖质被表层矿物质所吸附。在土壤系统中,综合应用荧光指纹指数[荧光指数（Fluorescence index,FI）,生源指数（The index of recent autochthonous contribution,BIX）和腐殖化指数（Humification index,HIX）]可以有效地揭示其来源和特性,但在土壤体系中单独应用指纹指数需审慎。     

酿酒葡萄分支酸合成酶基因（VvCS）的克隆与表达分析

本研究以酿酒葡萄（Vitis vinifera）品种赤霞珠（Cabernet Sauvignon）及霞多丽（Chardonnay）为试材,采用in silico克隆和分子克隆相结合的策略,从果实中克隆到分支酸合成酶基因,命名为VvCS。该基因的cDNA编码区全长1312bp,编码436个氨基酸残基,预测其编码蛋白质分子量为46.9kD,等电点为7.8;生物信息学分析显示VvCS的DNA全长7117bp,包含13个外显子和12个内含子,定位于葡萄的第13号染色体上。VvCS编码的蛋白与其它植物来源的分支酸合成酶在氨基酸水平上的同源性为75%左右;实时荧光定量PCR分析表明VvCS在葡萄果实、茎、叶和叶柄组织中均有表达,且在果皮、果肉和种子中的表达变化趋势相似,与盛花后5周的果实相比,盛花后11周果实各部位中VvCS表达丰度均有不同程度增加。     

抑制素A对牦牛颗粒细胞FSH、LH及其受体表达的影响

为了探明抑制素A(INHA)对牦牛卵泡颗粒细胞中促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)与其受体结合发挥的作用,通过体外培养牦牛卵泡颗粒细胞,采用免疫荧光技术(IF)检测促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)在颗粒细胞中的分布情况,用不同浓度外源性INHA(0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL^-1)作用12 h后,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测颗粒细胞中FSHβ、LHβ、FSHR、LHR基因的表达情况,采用酶联免疫分析试验(ELISA)检测细胞内外FSH、LH的含量。结果显示,FSHR和LHR在颗粒细胞质与细胞核中均有表达。FSHβ和LHβ基因在颗粒细胞中的表达随INHA浓度的增大呈先降后升的趋势;INHA浓度接近5 ng·mL^-1时,FSHβ表达最低;INHA浓度接近10 ng·mL^-1时,LHβ表达最低;FSHR和LHR基因的表达与INHA浓度呈负相关。INHA浓度接近5 ng·mL^-1时,颗粒细胞内外FSH含量最低;INHA浓度接近10 ng·mL^...