秦川牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1基因(Nramp1)N端序列的原核表达及纯化

为了研究牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)的功能,探求转基因抗胞内感染菌牛新材料创制的功能基因,本实验应用RT-PCR方法从秦川牛(Bos taurus)外周血中扩增出Nramp1编码基因N端序列,并将其克隆到pMD18-T simple载体,酶切后连接于pGEX-4T-1表达载体,命名为pGEX-N2。将重组质粒pGEX-N2转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测GST-Nramp1-N融合蛋白表达,并筛选最佳诱导条件,用谷胱甘肽Sepharose4B介质分离纯化该融合蛋白。结果表明,牛Nramp1N端编码序列长186bp,与GenBank中的相应的牛基因序列(U12862.1)对比存在一个碱基差异,致使其编码的第49位氨基酸为丙氨酸。构建的牛Nramp1N端表达重组质粒pGEX-N2,于35℃、0.1mmol/LIPTG、诱导10h,在大肠杆菌中高效表达,表达产物的分子量为33kD。结果为进一步研究牛Nramp1在机体抵抗胞内菌感染中的作用并为利用该基因进行转基因抗病牛的培育提供了实验依据和实验材料。     

人Irisin基因的克隆、原核表达及重组蛋白的纯化

鸢尾素(Irisin)是新发现的一种肌肉因子,其前体是Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(fibronectin typeⅢdomain-containing protein 5,FNDCS).为实现人(Homo sapiens) Irisin的原核表达,通过反转录PCR得到人肌肉组织总RNA的cDNA,并以特异性引物扩增得到人FNDC5基因的cDNA序列.以特异性引物扩增将人Irisin基因序列引入NdeⅠ和Xho Ⅰ酶切位点,经双酶切后插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒并转化大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3) pLysS.通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)检测,用镍柱纯化目的蛋白,并用Western blot方法鉴定.DNA序列分析结果显示,克隆的人Irisin基因序列和NCBI公布的序列一致,并成功构建了pET-30a-Irisin重组表达载体;SDS-PAGE电泳检测和Western blot结果表明,表达蛋白分子量约为14kD,与预期大小一致;实现了人Irisin的可溶性表达,得到了较高纯度的目的蛋白,为进一步研究人Irisin蛋白的结构、功能及应用提供了理论依据.     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的真核表达及其牛结核病诊断价值评价

本研究旨在利用毕赤酵母(Pichia pastoris)系统融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的培养滤液蛋白10(culture filter protein 10,CFP10)和早期分泌抗原靶6蛋白(earlier secreted antigen target 6,ESAT6),并评价其作为牛结核病外周血γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)体外释放实验特异性刺激剂来诊断牛结核病的应用潜能.通过PCR扩增cfp1 0-esat6融合基因,构建pPICZα A-(cfp10-esat6)重组质粒,电转化毕赤酵母GSll5,添加甲醇至终浓度1.0％,诱导3d,取培养上清进行SDS-PAGE分析,镍离子金属螯合亲和层析柱纯化目的蛋白,Western blot分析重组蛋白的免疫反应性;取纯化的融合蛋白CFP10-ESAT6作为刺激剂用于牛结核病外周血IFN-γ体外释放实验,评价其牛结核病诊断价值.结果表明,目的蛋白(33kD)被成功分泌表达,该融合蛋白与抗CFP10、ESAT6、组氨酸标签和c-Myc4种单抗均发生特异性反应,具有较好的免疫反应性.165份奶牛外周血样品的IFN-γ检测结果表明,CFP 10-ESAT6融合蛋白与结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)作为刺激剂,二者阳性符合率为82.3％,阴性符合率为78.8％.本研究利用酵母表达系统成功表达CFP10-ESAT6融合蛋白,并表现出更高的生物学活性,在牛结核病外周血IFN-γ体外释放实验中可作为候选刺激剂,并能克服混合感染导致的PPD漏检问题,从而进一步提高检测的敏感性和特异性.     

牛Phlda2基因的组织表达及生物信息学分析

在人、鼠和猪中,Phlda2基因是一个母源表达的印记基因,编码一种胞浆蛋白,具有与血小板同源的结构域。在牛中,Phlda2基因的结构和功能还不清楚。本研究首先利用RT-PCR方法对Phlda2基因在牛组织中的表达进行了分析,进而采用生物信息学方法对牛Phlda2基因的分子进化、启动子及蛋白的高级结构进行了分析和预测。结果表明,Phlda2基因在牛的心、肝、脾、肺、肾、大脑、骨骼肌、皮下脂肪、卵巢和胎盘10个组织中均有表达。对包括人、小鼠、牛、猪、原鸡、非洲爪蝉、斑马鱼和袋鼠在内的8种动物Phlda2基因mRNA序列进化进行分析,发现这8种动物的遗传距离小于0.435,且牛和猪遗传距离最近,为0.148,与基因系统进化树分析的结果一致。牛Phlda2基因的启动子最可能位于该基因起始密码子上游487-737bp区域,包括20种转录因子结合位点。牛Phlda2基因编码亲水性蛋白,其二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主;蛋白三级结构包括一个由β片层和α-螺旋构成的血小板同源结构域（PH）。以上研究结果将为进一步研究Phlda2基因的功能和分析基因表达调控的分子机理奠定基础。     

山羊c-Myc原癌基因克隆、原核表达和GST-Myc融合蛋白纯化

本研究的目的是通过分子克隆、原核表达和蛋白纯化技术获得山羊GST-Sox2融合蛋白.用RT-PCR方法从山羊(Capra hircus)肠组织克隆了c-Myc基因,通过TA克隆,构建了pMD18-T-Myc质粒.DNA测序证明,山羊c-Myc全长cDNA约1320 bp,该序列包含一个完整的开放阅读框,编码439个氨基酸,经分析该序列与绵羊(Ovis aries)的c-Myc序列同源性为99.2%.将该cDNA片段亚克隆至pGEX-KG载体,构建了重组质粒pGEX-KG-Myc.经酶切鉴定和测序,将重组质粒导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,由IPTG诱导表达,以谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和纯化GST-Myc融合蛋白.SDS-PAGE分析表明,纯化的GST-Myc融合蛋白约75 kD,与预期值相符,且呈现清晰的单一条带.Western blot检测证实,该融合蛋白能够被GST抗体所识别.本实验克隆了山羊c-Myc基因,获得了高纯度的GST-Myc融合蛋白,为其多克隆或单克隆抗体的制备提供了基础资料,为山羊iPS细胞(induced pluripotent stem cells)检测创造了条件.     

拟南芥AtHOS10基因的克隆及其表达载体的构建

AtHOS10基因对植物冷调节起到重要作用,可以通过控制ABA合成来改变植物的脱水胁迫耐性。本文利用PCR方法从Columbia生态型的拟南芥基因组中扩增出冷调节基因AtHOS10,并插入克隆载体。序列分析表明,克隆片段长3453bp,与目前发表的序列完全一致。将pUC-AtHOS10和pBI-HEM进行酶切重组构建表达载体pBI-AtHOS10,然后将表达载体转化导入农杆菌中,为侵染烟草作准备。     

潮霉素磷酸转移酶（hpt）基因的原核表达、蛋白纯化及其抗体制备

从转基因玉米(Zea mays)基因组上成功地克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接,成功构建了pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中进行蛋白表达.在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了HPT蛋白,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白.用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔制备了特异性强、灵敏度高的多克隆抗体.     

牛IL-18融合蛋白的原核表达及生物学活性测定

将牛白细胞介素18(bovine interleukin-18,BoIL-18)的成熟蛋白基因亚克隆到原核表达载体pGEX6p-1中,并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)获得重组菌株。该重组菌经0.3mmol/L IPTG诱导8h,SDS-PAGE电泳表明,BoIL-18融合蛋白获得了高效表达,分子量约为44kD,凝胶薄层扫描分析显示,融合蛋白占工程菌菌体总蛋白的31.8%;用亲和层析法对表达产物进行纯化,检测纯化产物的生物学活性。对外周血单核细胞(PBMC)的增殖实验证明,BoIL-18融合蛋白浓度大于0.10mg/L时,对PBMC有明显的增殖作用;对IFN-γ的诱生实验显示,BoIL-18融合蛋白浓度大于0.20mg/L时,能促进IFN-γ的产生,且随着BoIL-18浓度的增加,对IFN-γ的诱生作用增强。     

猪甲状腺激素应答基因SPOT14(THRSP)的原核表达及其融合蛋白的亲和纯化

甲状腺激素应答基因（thyroidhormone responsive SPOT14,THRSP）是受甲状腺激素诱导表达的核内基因,参与脂肪合成代谢途径限速酶的转录调控,对动物脂肪生成具有重要的调控作用。为进一步研究猪SPOT14基因所编码蛋白质的生物学功能,本实验将猪SPOT14（GenBank登录号:JF₉51726）的ORF片段与表达载体pET-28α（+）进行重组,获得的重组子pET-28α（+）-S14,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL2l（DE3）感受态细胞,重组菌经IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析显示,目的蛋白分子量约为20.91kD,且主要以包涵体形式存在,最佳诱导条件是37℃1mmol/LIPTG诱导5h。将获得的包涵体用6xHisNi-NTA纯化柱纯化后,采用Western blot进一步检测到了21kD目的蛋白的表达。重组质粒pET-28α（+）-S14在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地得到了表达,不仅为SPOT14基因生物学功能的研究,而且为进一步研究S14蛋白功能,了解脂肪代谢调控机制提供了基础资料。     

山羊FGF1O基因的克隆及其表达分析

成纤维细胞生长因子10(fibroblast growth factor 10,FGF10)是一种极其重要的生长因子,能促进小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)前体脂肪细胞的分化.为了获得山羊(Capra hircus)FGF10基因序列,研究其组织表达特性,确定其在肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式,并分析FGF10mRNA表达水平与肌内脂肪沉积的关系,本研究以简州大耳羊(C.hircus)为实验动物,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术克隆FGF10基因,采用Ⅱ型胶原酶消化获得山羊原代肌内前体脂肪细胞,利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测FGF10在成年山羊不同组织中的表达差异及其在肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达水平,并将基因表达水平与肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量进行关联分析.结果显示,克隆得到山羊FGF10基因(GenBank登录号:KT899958)序列1 252 bp,其中开放阅读框642 bp,编码213个氨基酸,与绵羊(Ovis aries)和牛(Bos taurus)的该基因同源性达100％,具有跨膜结构域和信号肽结构.FGF10 在山羊肺脏中表达水平最高,显著高于其他组织(P＜0.05),在脾脏和脂肪中也存在较高水平的表达.FGF10 mRNA在成年羊背最长肌中表达量显著高于羔羊与育成羊(P＜0.05),相关性分析结果显示,FGF10 mRNA表达量与山羊背最长肌IMF含量呈显著正相关(P＜0.05).FGF10 mRNA在肌内前体脂肪细胞中表达水平最低,在诱导分化后2d达到最高.本研究结果为进一步阐明FGF10基因在山羊肌内脂肪沉积中的分子机制提供了理论依据.     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性检测

肥胖基因(ob)编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5!端的CCC转变为大肠杆菌(Escherichiacoli)常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆到原核表达载体pET5a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.1mmol/LIPTG诱导,获得分子量约为16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的55%。重组蛋白纯化后,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

棉花MADS-box蛋白基因（GhMADS-13）的克隆和表达分析

一组具有MADS-box结构域的转录因子在控制花器官的诱导与发育中起着重要作，以中棉所36（CCRI）均一化全长cDNA文库为基础，结合EST测序分析，分离获得一个棉花的MADS-box基因全长cDNA。该基因cDNA全长1079bp，包含一个732bp的完整的开放阅读框，编码234个氨基酸，具有典型的MADS-box结构域和完整的K区，命名为GhMADS-13（GenBank：FJ409870）。与拟南芥、葡萄等植物的AGL6类基因具有高度的同源性。实时定量RT-PCR分析表明，GhMADS-13在CCRI36的花器官发育中早期表达量逐步增加，后期有下降趋势。推测GhMADS-13可能在开花诱导和花器官发育过程中起着重要作用。     

花生抗黄曲霉相关ARAhPR10基因克隆及其原核表达

花生黄曲霉污染已成为制约我国花生及花生制品出口贸易的关键因素。基于花生抗黄曲霉相关EST序列,RT-PCR法克隆花生ARAhPR10基因（gb｜EU661964.1）,开放读码框471bp,编码157个氨基酸,分子量16.9kD,等电点5.03。与已报导AhPR10（gb｜AY726607）相似性为49.3％。推导氨基酸序列含有PR10家族的高度保守“P-loop”基序（G＊GG＊G）和Betv1保守疏水结构域“GVALP PTAEK ITFET KLVEG PNGGS IGKLT LKY”,推测ARAhPR10是该花生PR10家族的新成员。其基因组扩增序列长度561bp,两个外显子间存在一个长度为87bp的内含子。原核表达ARAhPR10的融合蛋白约25kD,Ni^＋-NTA树脂亲和纯化后获得电泳单一条带。纯化的ARAhPR10融合蛋白具有体外核酸酶活性,预测其具有抗黄曲霉活性。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为ARAhPR10功能研究奠定了基础。     

青花菜花粉外壁蛋白基因的克隆与表达特征分析

花粉外壁蛋白参与多种植物生理进程,在花粉发育过程中起着重要的作用。本试验以青花菜保持系‘WN12-95B’为材料,利用RT-PCR技术克隆得到青花菜花粉外壁蛋白（PCP）基因。结果显示,该基因全长578 bp其中开放阅读框长度为561 bp共编码186个氨基酸。该蛋白为疏水性蛋白,在第1~24位有一个信号肽序列,预测相对分子量为18.82 kD等电点为10.91。青花菜PCP蛋白的二级结构主要由a-螺旋和不规则卷曲构成,不含β-转角。系统进化分析表明青花菜花粉外壁蛋白与同属植物的进化关系相近,其中与甘蓝进化关系最近。采用qRT-PCR技术分析青花菜PCP基因的表达特性,结果显示该基因仅在花蕾中表达,具有明显的组织特异性。青花菜Ogu不育系及其保持系不同发育阶段花蕾中PCP基因差异明显,表明其在花粉发育中具有重要的作用。本研究结果为进一步研究PCP基因在青花菜花粉发育过程中的作用奠定基础。     

巴西橡胶树一个编码含有C2结构域蛋白cDNA的克隆及表达分析

本研究根据从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的一个EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码含有C2结构域蛋白的cDNA（命名为HbC2）。序列分析表明,HbC2长为1185bp,含有813bp的阅读框,140bp的5＇-UTR和232bp的3＇-UTR,编码270个氨基酸,分子量为30.9KD,等电点为6.29,含有保守的C2结构域。半定量RT-PCR分析表明HbC2在花、芽、叶、胶乳和树皮中都有表达,其中在胶乳中表达量最高。茉莉酸可抑制HbC2的表达,乙烯对HbC2的表达没有影响。此研究为进一步研究C2蛋白基因在橡胶树中的生物学功能奠定基础。