苹果球壳孢腐烂病菌在中国的适生性及其入侵风险

为明确我国禁止进境的植物检疫性真菌有害生物——苹果球壳孢腐烂病菌Sphaeropsis pyriputrescens在中国的适生性以及入侵风险,采用专家评判的生物学建模方法确立了其适生性评判标准,运用ArcGIS软件分析其在我国的适生范围和适生程度;同时采用多指标综合评判法量化分析该病菌入侵我国的风险等级。结果表明,苹果球壳孢腐烂病菌在我国具有很广阔的适生范围,中、高度适生区随季节变化明显。1—4月,中、高度适生区从南到北逐渐扩大;6月,高度适生区扩展到东北和新疆北部;9—10月,在苹果采摘前期和采摘期,苹果球壳孢腐烂病菌处于侵染活跃期,其高度适生区域面积最大,包含了陕西、河北、山东、甘肃、辽宁、河南、山西等我国苹果和梨主产区。按照有害生物多指标综合评判法,对15项评估指标进行赋值,计算所得风险综合评价值R为2.54,该病菌入侵我国的风险等级属特别危险。     

苹果和梨球壳孢腐烂病

2001年11月至2002年1月，美籍学者C．L.Xiao博士在美国华盛顿州的冬梨（品种：d’Anjou，属西洋梨）上发现一种不明真菌造成的储藏期果实腐烂，病梨来自14个果园，烂果率2％-8％，平均4％；2002年3月至5月，又从储藏的19个果园的病梨中分离到这种真菌，烂果率2％-21％，平均6％。经病原形态鉴定和致病性测定，将引起这种果实储藏期腐烂的真菌确定为球壳孢属一新种Sphaeropsis pyriputrescens Xiao ＆ J．D．Rogers。2003年3月至7月间，作者又在华盛顿州的储藏期苹果上发现该病害，发病品种为Golden Delicious,Granny Smith和Red Delicious，其中在RedDelicious上造成的损失高达24％。C．L．Xiao提议将此新病害称为“苹果和梨球壳孢腐烂病”（Sphaeropsis rot of appple and pear）。     

实时荧光PCR检测瓜炭疽病菌

采用实时荧光PCR技术建立了瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)的检测方法。根据瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因序列,设计了该病菌特异性引物和TaqMan探针,并对所设计的引物和探针的反应条件进行了优化。采用本试验建立的实时荧光PCR方法对瓜上的其他菌株及近似菌株进行检测,可将瓜炭疽病菌与其他病原菌区分开。灵敏度试验表明,25μL体系中只要有39.6pg的核酸量就可以被检测到,检测灵敏度达到1.584pg/μL,比普通PCR检测灵敏度高100倍。同时对田间采集的病株和未知样品进行的检测证明了引物和TaqMan探针的特异性。     

油棕猝倒病菌实时荧光PCR检测方法

油棕猝倒病菌(Pythiums plendens)是我国进境植物检疫性有害生物。本试验根据P.splendens rDNA ITS区序列,设计了实时荧光PCR引物pyspF/pyspR及荧光探针pyspT,建立了P.splendens荧光PCR检测方法,检测灵敏度为0.012pg/μL。     

洋葱腐烂病菌PCR检测方法的建立

为了快速准确检测洋葱腐烂病菌（Burkholderia gladioli pv. alliicola,简称Bga）,根据GenBank中Bga与相关种的序列差异设计特异引物BG5/BG7和探针Bga-P,建立了Bga常规PCR和荧光PCR检测方法。测试结果表明,引物和探针对供试的11株Bga菌株表现为阳性反应,其他64株供试菌株和空白对照均为阴性。常规PCR和荧光PCR方法的检测灵敏度分别为24 pg和240 fg菌体DNA。美国、法国、意大利等国进境的80批次洋葱种子样品的检测结果显示,这两种方法的阳性检出率分别为7.5%和12.5%。选取阳性样品进行病菌分离,成功从2批次法国进境洋葱种子中分离到目的菌。本文建立的洋葱腐烂病菌PCR检测方法可为口岸检测部门提供更高效、灵敏和特异的检测手段。     

应引起检疫重视的苹果和梨球壳孢腐烂病

2004年肖长林(C.L.Xiao)报道了华盛顿州苹果和梨上发生的一种病原菌Sphaeropsispyriputres-cens,该病原菌主要引起储藏期苹果和梨的果实腐烂。本文对该病的发现、危害和症状以及病原菌形态、生物学特性、分离和鉴定方法等几个方面进行了综合概述,旨在为我国的进口美国水果检验检疫工作提供理论参考。     

实时荧光定量PCR法检测十字花科细菌性黑斑病菌

为有效防控我国的检疫性有害生物十字花科细菌性黑斑病菌Pseudomonas syringae pv.maculicola在国内的传播与蔓延,通过设计1对特异性引物3539,利用132株靶标和非靶标菌为模板进行PCR扩增,建立了实时荧光定量PCR法,并进行了模拟种子带菌试验。结果显示,引物3539为只针对十字花科细菌性黑斑病菌扩增出的特异性产物;在模拟种子带菌检测中,常规PCR对菌悬液的检测限为10~5CFU/m L,实时荧光定量PCR的检测限为10~3CFU/m L,其中10~8CFU/m L菌液的Ct值最低,为22.90,10~3CFU/m L菌液的Ct值最高,为35.73,且不同浓度菌液间的Ct值均有显著差异;不同带菌率模拟种子的检测结果表明,常规PCR和实时荧光定量PCR能检测到的带菌率分别为0.5%和0.1%。研究表明,实时荧光定量PCR法不仅可用于病种的检测,也可用于病害的早期诊断。     

苹果壳色单隔孢溃疡病菌

苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeria stevensii Shoemaker)是我国新修订的进出境动植物检疫性有害生物名录之一,目前在我国无分布。本文主要从地理分布、寄主范围、症状及危害、形态特征、生物学习性、检疫鉴定方法、防治措施等方面对该菌进行了综述,同时对其传入中国的风险进行评估,评估结果R值为2.17,传入总体风险高,口岸应加大检疫力度,严防该菌的传入。     

利用实时荧光PCR技术检测风信子黄腐病菌

风信子黄腐病菌是我国禁止入境的病原细菌之一,我国目前尚无该病的发病报道.本研究根据风信子黄腐病菌基因组16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer保守序列,设计并合成了1对特异性引物和1条具有稳定点突变特异性探针进行实时荧光PCR检测,风信子黄腐病菌有很强的荧光信号,供试的其它7种病原细菌菌株均没有荧光产生.与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用.经优化反应条件,建立了稳定的风信子黄腐病菌实时荧光PCR检测方法.     

梨火疫病菌的实时荧光PCR检测

 根据梨火疫病菌16S~23S间的ITS保守序列,设计并合成了一对特异性引物REA/FEA,应用荧光染料SYBR Green I,对10个梨火疫的菌株和其它相关参试菌株进行了检测。结果表明,10个梨火疫菌株都产生荧光信号而其它参试菌株都不产生荧光信号,成功建立了梨火疫病菌的实时荧光PCR检测方法。整个检测过程只需3h,完全闭管,降低了污染的机会,无需PCR后处理。检测的灵敏度是4个菌体细胞,比常规PCR电泳检测提高了10倍。用该特异性引物对梨枝条浸泡液进行实时荧光PCR检测,结果可特异性检测到目标菌的存在,并且检测的灵敏度是24个菌体细胞,比常规PCR电泳检测提高10倍。     

丁香疫霉病菌PCR和实时荧光PCR检测

 为了快速、准确地检测丁香疫霉病菌 (Phytophthora syringae, PSY),根据GeneBank中PSY的ITS序列设计特异引物Psy1/Psy2和探针P-Psy,建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。利用引物Psy1/Psy2扩增供试的26株PSY能得到585 bp的预期目标条带,但扩增其它61个非PSY供试菌株不能得到预期产物,检测灵敏度为12 pg菌丝DNA;探针P-Psy对供试26株PSY表现为阳性扩增,而对其它菌株和空白对照均表现为阴性扩增,检测灵敏度可达120 fg菌丝DNA,比常规PCR高100倍;引物Psy1/Psy2和探针P-Psy对5 g土壤中PSY卵孢子的检测灵敏度分别为20 000个和200个。样品检测试验表明两种PCR方法可用于口岸植物检疫中快速、准确和特异地检测丁香疫霉病菌。     

基于TaqMan MGB探针的葡萄茎枯病菌实时荧光PCR检测方法

 葡萄茎枯病菌是我国进境植物检疫性有害生物。带菌植物材料是病害传播的重要载体,准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行口岸检疫措施及研究病害防控措施的有力工具。根据葡萄茎枯病菌及其近似种的细胞骨架蛋白(Actin)基因序列差异,设计并合成1对引物和1条特异性TaqMan-MGB探针,建立了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测方法。通过对反应体系的优化,确定了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR最佳反应条件:引物终浓度为0.6 μmol·L^-1,探针终浓度为0.6 μmol·L^-1。灵敏度试验结果显示,最低检测限为总DNA含量20 pg(20 μL反应体系)。此方法快速灵敏,整个反应1 h即可完成,检测过程完全闭管,无需PCR产物后续处理,为快速检测葡萄茎枯病菌提供了重要参考。该方法用于口岸疑似菌株检测,可成功检测出葡萄茎枯病菌。本研究建立的基于TaqMan MGB探针的荧光定量PCR检测方法为葡萄茎枯病菌的早期快速检测监测提供了有力工具。     

基于TaqMan MGB探针的葡萄茎枯病菌实时荧光PCR检测方法

 葡萄茎枯病菌是我国进境植物检疫性有害生物。带菌植物材料是病害传播的重要载体,准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行口岸检疫措施及研究病害防控措施的有力工具。根据葡萄茎枯病菌及其近似种的细胞骨架蛋白(Actin)基因序列差异,设计并合成1对引物和1条特异性TaqMan-MGB探针,建立了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测方法。通过对反应体系的优化,确定了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR最佳反应条件:引物终浓度为0.6 μmol·L^-1,探针终浓度为0.6 μmol·L^-1。灵敏度试验结果显示,最低检测限为总DNA含量20 pg(20 μL反应体系)。此方法快速灵敏,整个反应1 h即可完成,检测过程完全闭管,无需PCR产物后续处理,为快速检测葡萄茎枯病菌提供了重要参考。该方法用于口岸疑似菌株检测,可成功检测出葡萄茎枯病菌。本研究建立的基于TaqMan MGB探针的荧光定量PCR检测方法为葡萄茎枯病菌的早期快速检测监测提供了有力工具。     

穿刺巴斯德芽菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

以穿刺巴斯德芽菌16S rDNA片段为靶标,通过对荧光定量PCR反应条件的摸索,建立该菌的荧光定量PCR检测方法.所选靶点最适退火温度60℃,正、反向引物的最佳浓度搭配为900、300 nmol/L;以Ct值和质粒拷贝浓度对数为坐标轴建立标准曲线,回归方程为y=-3.200×logx+ 34.43,R2值为0.998,PCR扩增效率为105.4％,对含穿刺巴斯德芽菌芽胞的土壤样品检测阈值为2×103个/g土壤.该方法敏感度高、特异性好,能够运用于穿刺巴斯德芽菌的定性、定量检测.     

Infection of apple fruit by Sphaeropsis pyriputrescens in the orchard in relation to Sphaeropsis rot in storage

Sphaeropsis rot, caused by Sphaeropsis pyriputrescens, is an important postharvest disease of apple in the United States. The objectives of this study were to determine the timing of apple fruit infection in the orchard in relation to development of Sphaeropsis rot in storage and to identify infection courts and mode of penetration by S. pyriputrescens on apple fruit. Fruit of apple cvs Red Delicious, Golden Delicious, and Fuji were inoculated in the orchard from 3 weeks after petal fall to 2 weeks before harvest at 5 to 6-week intervals in three consecutive seasons. All fruit were harvested and stored at 0?ºC to monitor decay development. Light and scanning electron microscopy were used to examine the infection courts and mode of penetration of the fungus on/in the host tissues. At harvest, the fungus was re-isolated from the stem (pedicel), sepal, anther, or filament of the inoculated fruit, but decay did not develop on fruit. Sphaeropsis rot developed on inoculated fruit during cold storage beginning 1–3 months after harvest. Stem-end rot was prevalent on cv. Golden Delicious, whereas calyx-end rot was prevalent on cv. Fuji. Both stem- and calyx-end rots were common on cv. Red Delicious. Infection also occurred at lenticels on fruit skin, particularly on cv. Golden Delicious, but at low incidence. Relationships between the incidence of Sphaeropsis rot in stored apple fruit and the timing of inoculation in the orchard varied with cultivar and year. On cv. Red Delicious apples, the incidence of Sphaeropsis rot generally increased as the timing of infection approached harvest. Histological studies indicated that infection took place through natural openings of plant organs such as stomata on stems and sepals and lenticels on fruit skin. Fungal penetration also was observed at micro-cracks on the stem and sepal and at trichome sockets where mechanical damage occurred in sepals. Direct penetration was observed on the stem and sepal of fruit, but most invasions were restricted between the cuticle and the epidermis. Our results indicate that wounding is not required for infection of apple fruit by S. pyriputrescens, though it may facilitate infections.     

二重荧光定量PCR检测转基因大豆DAS81419

本文针对大豆内源基因Lectin和转基因大豆DAS81419品系的5′端插入位点序列,设计特异性引物及探针,建立了同时检测转基因大豆DAS81419品系和大豆内源基因Lectin的二重荧光定量PCR方法,运用15种转基因大豆、3种转基因玉米、1种转基因油菜、1种转基因水稻和非转基因大豆对该方法进行了特异性评价,并分析了该方法的灵敏度和稳定性。结果显示,该方法能准确从20种转基因样品和1种非转基因样品中检出靶目标,检测结果与待检样品信息一致,表明本方法具有良好的特异性;灵敏度高达0.01%;并具有良好的重复性。该方法特异性强、灵敏度高、稳定性强,适用于各口岸实验室进行转基因大豆DAS81419的快速、准确的检测。     

一种改进的尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法

为实现荧光定量PCR对土壤病原真菌数量更为高效、灵敏的检测,本研究将液体培养的孢子悬浮液和长年耕作的水稻土制作成孢子浓度为4×10~1~4×10~6 spore/g的带菌土,采用MoBio PowerSoil@DNA Isolation Kit提取模拟带菌土壤总DNA,引入常规PCR预扩增包含qPCR目标序列的1 446bp片段,以预PCR产物为模板进行qPCR,构建荧光定量PCR标准曲线。研究结果表明:以试剂盒提取的带菌土壤总DNA为模板绘制的qPCR标准曲线相关系数r为0.985,检测下限为4×10~3 spore/g土;引入预PCR后,qPCR标准曲线相关系数r为0.974,检测下限为4×10~2 spore/g土,较未引入时提高了10倍,结合不同土壤病原真菌的特异性引物,该检测方法可为土壤病原真菌的有效定量检测提供技术支撑。     

长孢轮枝菌Taq〖KG-*4〗Man-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法

长孢轮枝菌是一种在我国局部地区新近出现且危害性极大的植物病原真菌?根据长孢轮枝菌及其近似种的actin序列差异, 设计并合成特异性引物和探针, 建立了长孢轮枝菌的实时荧光PCR检测方法?特异性试验结果表明, 该检测方法能特异性检测长孢轮枝菌; 灵敏度试验结果表明, 最低检测限量为10 μL反应体系中总DNA含量10 pg; 实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.8 μmol/L, 探针终浓度0.8 μmol/L, 优化后的整个反应过程约1 h?实际样品检测结果表明, 该方法可用于疑似受长孢轮枝菌侵染的萝卜样品检测与初筛?此方法快速?灵敏, 检测过程完全闭管, 无需PCR后续处理, 为早期快速检测长孢轮枝菌提供了重要参考?     

利用TaqMan探针实时荧光PCR方法检测香石竹细菌性萎蔫病菌

 根据香石竹细菌性萎蔫病菌基因组16S-23S rRNA保守序列,设计并合成了一对特异性引物和一条具有稳定点突变特异性探针,建立了对香石竹细菌性萎蔫病菌的TaqMan实时荧光PCR检测方法。除香石竹细菌性萎蔫病菌外,还对其他7种病原细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明,只有香石竹细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他病原细菌均没有荧光产生。与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,能检测到浓度为0.4 pg/μL的DNA,且能直接用于苗木等样品的检测,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。