橡胶树HbDHAR2基因克隆及表达分析

脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)通过调节抗坏血酸水平在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要作用.为明确橡胶树DHAR基因的序列特征、表达特性以及潜在的生物学功能,采用RT-PCR技术,从橡胶树中克隆了DHAR基因HbDHAR2.该基因开放阅读框为639 bp,编码212个氨基酸.预测HbDHAR2蛋白等电点为5.69,分子量...     

巴西橡胶树HbCytc1的克隆及表达分析

橡胶树寒害和干旱逆境响应均与活性氧代谢和淬灭有关,研究表明细胞色素c1通过参与抗坏血酸的再生在抗旱、活性氧淬灭等逆境中发挥作用。为研究细胞色素c1基因在橡胶树寒害和干旱逆境响应中的作用机制,采用5'/3'末端快速扩增技术从巴西橡胶树‘热研7-33-97’叶片中克隆了一个细胞色素c1基因,通过生物信息学软件分析,可知其推导氨基酸含有特征性Cyt_c1家族结构域,将其命名为HbCytc1。HbCytc1全长1 351 bp,ORF933 bp。根据c DNA序列推导出该蛋白氨基酸,利用DNAman与其他植物中的同源Cytc1基因进行序列比对,发现橡胶树HbCytc1与蓖麻RcCytc1(XP_002509561.1)、毛果杨PtCytc1(XP_002313590.1)、克莱门柚CcCytc1(XP_006441506.1)和烟草NsCytc1(XP_009804309.1)氨基酸的相似性分别为91%、92%、89%和87%。系统进化分析显示,HbCytc1与RcCytc1、PtCytc1位于同一分支。表达分析结果显示,该基因在花、叶片和胶乳中表达,在树皮中不表达。在干旱、机械伤害和白粉菌侵染处理下,均显著上调该基因在橡胶树叶片中表达。结果表明HbCytc1受逆境反应诱导,参与橡胶树抗逆过程。为揭示细胞色素c1的功能和橡胶树抗逆响应的研究提供理论指导。     

木薯MeCIPK1基因克隆及表达分析

CIPK蛋白是一类植物特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,已在多个物种中被证实参与逆境胁迫应答。本研究利用PCR技术从木薯栽培种KU50中克隆得到一个CIPK家族基因,命名为Me CIPK1,该基因的开放阅读框全长为1 137 bp,编码379个氨基酸。生物信息学分析表明Me CIPK1蛋白含有CIPK家族保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和NAF结构域,与橡胶树和麻疯树中的氨基酸序列同源性最高。利用荧光定量PCR研究Me CIPK1在多种处理下的表达模式,结果表明Me CIPK1在转录水平受到ABA、高盐胁迫、干旱胁迫和低温的抑制作用,同时受到氧化胁迫的诱导作用,故此推测Me CIPK1在木薯应答多种非生物胁迫的过程中可能会发挥重要作用。本研究结果为后期深入分析木薯Me CIPK1基因的功能提供理论基础。     

巴西橡胶树SNARE蛋白全长cDNA克隆及其序列特征分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中筛选到一个与SNARE蛋白同源性较高的基因片段,根据其序列信息设计特异引物, 采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得了长度为1 070 bp的全长cDNA克隆R295。序列分析表明该基因包含600 bp的开放阅读框,5’-UTR为93 bp, 3’-UTR为377 bp,编码199个氨基酸。该基因编码的蛋白具有一个SNARE coiled-coil保守区、一个典型的VAMP基元及一个羧基端的CAAX基元。同源分析表明该蛋白属于一类特殊的longins蛋白。RT-PCR检测表明它在胶乳中特异表达,在叶中没有表达。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

巴西橡胶树水解酶基因克隆与表达分析

磷是植物生长发育所需的大量重要元素,而缺磷是提高橡胶产量的重要限制因子,研究橡胶树耐低磷胁迫的分子机制,对提高橡胶树磷养分的利用效率具有重要意义。利用低磷胁迫差减文库获得的EST,通过RT-PCR和RACE技术克隆橡胶树应答低磷胁迫基因,并利用实时荧光定量PCR技术进行表达分析。结果表明,从橡胶树中克隆到1个应答低磷胁迫的水解酶基因Hbhyd,全长1860 bp,包含1个1479 bp的完整阅读编码框(ORF),编码56.1 kD(492aa)蛋白,经NCBI同源性分析,HbHyd编码的氨基酸序列与蓖麻水解酶的氨基酸序列一致性为84%。利用荧光定量PCR分析Hbhyd的表达水平,可知在低磷磷胁迫处理下,HbHyd在橡胶树根中表达量明显上调。Hbhyd基因在橡胶树应答低磷胁迫过程中上调表达,该基因的克隆有助于提高橡胶树磷素吸收利用效率。     

中间锦鸡儿CiMYB185基因克隆及表达分析

为进一步了解植物抗逆境胁迫的机理,本研究以中间锦鸡儿为试验材料,从实验室已建立的转录组数据库中选取转录因子CiMYB185编码基因作为研究对象。利用PCR技术分别以cDNA与g DNA为模板对CiMYB185基因进行全长克隆。测序结果表明:CiMYB185基因的开放阅读框为909 bp,编码303个氨基酸,其基因组DNA序列长度为1 592 bp,含有1个内含子和2个外显子。序列分析发现该基因所编码蛋白的N端包含2个MYB结构域,属于典型的R2R3-MYB类蛋白;利用染色体步移技术克隆得到908 bp的ATG上游启动子序列,序列中包含一些与光反应和激素相关的元件。该研究为进一步了解植物抗逆境胁迫的机理奠定了基础。     

巴西橡胶树HbUBC22基因克隆与表达分析

泛素蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway, UPP）是细胞内最重要的且具有高度选择性的蛋白质降解途径,而泛素结合酶E2/UBC是该途径的一个关键酶。本研究通过对巴西橡胶树同源EST序列拼接和RT-PCR扩增的方法,克隆了一个巴西橡胶树的泛素结合酶基因HbUBC22,该基因的开放阅读框（ORF）共807 bp,编码268个氨基酸,编码蛋白含有一个保守的UBC结构域和一个高度保守的半胱氨酸催化位点。系统进化关系分析发现,HbUBC22蛋白与蓖麻、杨树、油茶和葡萄的UBC蛋白的同源性最高,分别为89%、85%、85%和81%;在拟南芥基因组中,HbUBC22则与AtUBC22的同源性最高达到73%。表达谱分析结果显示,HbUBC22受乙烯利和茉莉酸甲酯诱导显著上调表达。原核表达分析结果表明,经IPTG诱导后,HbUBC22能够在大肠杆菌中表达出目标蛋白。本研究结果为进一步研究HbUBC22在橡胶树中的生物学功能奠定了良好基础。     

芒果转录因子NAC的克隆与表达模式分析

NAC转录因子在植物生长发育、信号传导和逆境胁迫应答方面起重要的作用。本研究根据芒果c DNA-SCo T差异显示中发现的c DNA片段设计特异引物,通过改良RACE技术得到了芒果NAC基因的全长c DNA序列。序列分析显示,该c DNA全长为1 167 bp,开放阅读框长度为1 002 bp,编码334个氨基酸,推测其分子量为37.41 k D,等电点为8.76,属于NAM基因家族,命名为Mi NAC。利用实时荧光定量技术对Mi NAC基因在芒果4℃低温胁迫、盐胁迫和PEG-6000胁迫后0、24 h、48 h和72 h时叶片和茎中表达模式进行分析,实验结果显示,这三种逆境处理均诱导芒果Mi NAC基因的表达,其中Mi NAC基因对4℃低温胁迫响应程度最高,其次是PEG胁迫和盐胁迫。结果表明,该基因参与了芒果逆境胁迫的分子调控。     

兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因的克隆及其表达特性

克隆同色兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因DFR,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。采用RT-PCR和RACE技术从花中克隆DFR的全长cDNA,用生物信息学方法分析序列特征,并用半定量RT-PCR研究其在不同组织的表达。分离到DFR,该cDNA全长1267 bp,具有1个1074 bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸。序列分析表明,该DFR蛋白含有1个NADB_Rossmann superfamily保守结构域,1个NADP(H)结合域和1个底物特异性结合域,其与文心兰、石斛兰和大花蕙兰等的DFR同源性在75%~80%。系统进化树显示,该DFR蛋白与兰科植物的DFR蛋白亲缘关系比较近。半定量RT-PCR表明,该DFR在成熟花和营养叶中的表达量最高,在子房、苞叶、萼片和花瓣中的表达量相当,在唇瓣中的表达量次之,在蕊柱中的表达量较唇瓣中的低,在花茎中的表达量最低,在根中几乎检测不到。原核表达结果表明,该DFR在大肠杆菌中获得表达。从兜兰中克隆到花色代谢途径中的关键酶基因DFR,该基因可能参与调控花色素的合成。     

巴西橡胶树Profilin基因克隆及生物信息学分析

为了研究橡胶树中Profilin 蛋白的功能,利用橡胶树Profilin 基因部分已知序列设计引物,采用 3′-RACE技术获得Profilin 基因完整开放阅读框,该基因编码131 个氨基酸,含有一个保守的PROF结构域。在HbPro1 蛋白中没有预测到跨膜区和信号肽,二级结构分析表明HbPro1 属于混合型蛋白。对 25 个Profilin 蛋白系统进化分析表明,HbPro1 在进化上具有保守性,属植物类Profilin 蛋白家族。 HbPro1 基因的克隆和生物信息学分析为深入研究其功能奠定了基础。     

橡胶树原生质体的分离及红色荧光蛋白的瞬时表达研究

目的：分离巴西橡胶树松散愈伤组织原生质体,建立目标基因在橡胶原生质体的瞬时表达系统。方法：以巴西橡胶树松散愈伤组织为材料,酶解分离原生质体,通过电击介导的转化方法,将编码红色荧光蛋白（RFP）的植物表达载体转入原生质体中,用激光扫描共聚焦显微镜检测原生质体中RFP的表达情况。结果：分离出大量高纯度的橡胶原生质体,成功获得转基因原生质体细胞,RFP在原生质体中得到成功表达。初步建立了橡胶原生质体瞬时表达系统。     

巴西橡胶树膜结合NAC转录因子HbNTL1的克隆及生物信息学分析

本实验根据巴西橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,克隆了橡胶树膜结合NAC转录因子,HbNTL1的cDNA和基因组DNA序列。生物信息学分析显示HbNTL1基因包含6个外显子和5个内含子,开放阅读框(ORF)为1704bp,编码了567个氨基酸。HbNTL1编码蛋白的相对分子量为62.52 kDa,理论等电点PI为4.62,N-端具有保守的NAC结构域,高度变异的C-端有一个跨膜结构域(TM)。序列比对和系统进化分析表明HbNTL1蛋白属于NAC转录因子家族中的NAC2亚族,推测其可能与橡胶树生长发育和胁迫应答有关。     

Cd胁迫下生物质高粱SoHMA3基因克隆及表达分析

重金属转运P1B型ATP酶对促进金属离子的吸收、运输、积累、分配和解毒至关重要。其中HMA3蛋白可能通过将镉螯合至液泡从而有助于金属解毒,本研究以不同浓度Cd处理生物质高粱幼苗为材料,克隆获得了SoHMA3基因的全长序列,cDNA全长3179 bp,编码877个氨基酸,编码蛋白的理论分子量为94.44 kD,理论等电点为6.4,为跨膜蛋白,该蛋白属于HAD超家族成员,对该氨基酸序列进行聚类分析表明,其与玉米和水稻的同源性最高,而与芦笋最低。实时定量PCR分析表明,SoHMA3基因在生物质高粱地上部和地下部均有表达,不存在组织特异性;镉胁迫下,该基因在地上部无显著响应,在地下部有显著响应,表明生物质高粱SoHMA3的表达受到Cd胁迫的影响,参与了生物质高粱对Cd的解毒。本研究结果为进一步探究生物质高粱对Cd的吸收、转运及解毒机理提供基础资料。     

橡胶树大小橡胶粒子的差速离心分离及其差异表达蛋白质的研究

为了鉴定巴西橡胶树胶乳中大小橡胶粒子之间的差异表达蛋白质以及揭示橡胶生物合成的分子机制,采用差速离心的方法,从橡胶树的新鲜胶乳中分离纯化总橡胶粒子、大橡胶粒子和小橡胶粒子,用扫描电镜和SDS-PAGE以及质谱等方法分别检测和鉴定大小橡胶粒子的分离效果及其差异表达蛋白。结果表明,大小橡胶粒子可用差速离心法得到有效的分离和纯化,它们在SDS-PAGE电泳图谱上表现出差异表达的橡胶粒子蛋白,如分子量为22.0 kDa、24.5 kDa和120 kDa蛋白等,并对其中分子量为24.5 kDa的小橡胶粒子蛋白（SRPP）进行了质谱分析。橡胶树大小橡胶粒子差速离心法的建立,为大小橡胶粒子差异表达蛋白质的分离和鉴定奠定了一定的基础,将进一步促进橡胶树橡胶粒子的起源和发育,以及橡胶生物合成分子机制的研究。     

小麦类钙调素TaCML79基因的克隆和表达分析

为了研究小麦类钙调素基因的功能和在植物逆境响应中的分子机制,以电子克隆结合RT-PCR的方法,在小麦中克隆到一个类钙调素基因TaCML79。该基因的开放阅读框长度为588bp,编码的蛋白长度为195个氨基酸,推测的分子量为20.45kDa,等电点为4.6,属于酸性蛋白,具有2个典型的和一个不完整的EF-hand结构域。多序列比对和系统进化树分析表明,TaCML79与野生稻的ObCML35和水稻的OsCML10亲缘关系较近,相似性分别为84.6%和86.8%。该基因的表达在根和地上部分受到热激、NaCl、渗透和冷胁迫的诱导或抑制,初步推断该基因可能与植物抗逆有密切的关系。     

高温和盐胁迫下硅对辣椒CaMADS-box基因表达的影响

为了探索非生物胁迫下硅对辣椒Ca MADS-box基因表达的影响,以豫椒101为材料,在对辣椒Ca MADS-box基因片段同源克隆的基础上,对其编码的部分蛋白进行氨基酸同源性分析、理化性质预测、亚细胞定位预测和进化树分析,探讨了硅处理后辣椒Ca MADS-box基因在高温胁迫、盐胁迫下表达量的变化,结果表明,克隆得到的Ca MADSbox基因所编码的蛋白为亲水性蛋白,含有MADS结构域,属于MADS基因家族,亚细胞定位在细胞核中,分子进化树表明其与茄属和烟草属亲缘关系最近,相似性达到67%。荧光定量分析表明,Ca MADS-box基因在高温胁迫和盐胁迫后表达量都呈现出先升高后下降的模式,高温胁迫下48 h达到峰值,而盐胁迫在24 h达到峰值,硅处理能够诱导Ca MADS-box基因表达,在高温胁迫和盐胁迫下都在12 h达到高峰值,这表明Ca MADS-box是一个硅快速响应基因,推测硅处理在缓解辣椒高温胁迫和盐胁迫等非生物胁迫方面具有重要作用。