褪黑素在牛卵母细胞体外受精中的抗氧化作用

为探讨褪黑素(MLT)对牛卵母细胞成熟、精子获能和胚胎发育的抗氧化效果。在体外培养液中添加10-9 M MLT,以评估牛卵母细胞成熟率及胚胎发育效果;同时利用目测法、低渗膨胀法、JC-1和考马斯亮兰染色法评估不同浓度MLT(0 M、10-3 M、10-4 M和10-5M)添加在牛精子获能液经上游法处理45min后对精子质量的影响。结果表明:与对照组相比,添加10-9 M MLT既可显著提高牛卵母细胞的成熟率(62.5%vs 77.8%)(P0.05),又可明显刺激受精后胚胎体外发育的卵裂率(53.2%vs 67.6%)(P0.05)和囊胚率(20.3%vs35.4%)。在精子获能液中添加10-4 M MLT上游处理45 min后,其精子活力(84.6%vs71.6%)、质膜完整率(88.8%vs 75.2%)、线粒体高膜电位百分率(83.0%vs 70.2%)和顶体完整率(87.0%vs 74.4%)均显著高于对照组(P0.05)。这些结果有助于优化IVF技术体系,利于体外胚胎生产效率提高。     

添加褪黑素对牛卵母细胞及其ICSI操作后胚胎发育效果的影响

为探讨抗氧化剂褪黑素(MLT)对牛卵母细胞体外成熟及胞浆单精子注射(ICSI)显微操作后早期胚胎体外发育的影响。在牛卵母细胞体外成熟培养液中,分别添加0 M、10~(-10) M、10~(-9) M、10~(-8) M MLT,通过统计核成熟率,评估不同浓度的MLT对牛卵母细胞体外成熟的影响。于24h后收集核成熟的牛卵母细胞进行显微操作,同时在显微操作液中分别添加0 M、10~(-10) M、10~(-9) M、10~(-8) M MLT,经体外培养后评估MLT对ICSI处理后胚胎体外发育的影响。结果表明:与对照组相比,在成熟液中添加10~(-9) M MLT(73.8%vs 81.3%)(P0.05)可显著提高牛卵母细胞成熟率;同时在显微操作液中添加10~(-9) M MLT,与对照组相比,牛卵母细胞ICSI后胚胎体外发育的卵裂率(81.3%vs 85.5%)差异不显著(P0.05),但囊胚率(14.3%vs 22.6%)显著提高(P0.05)。因此,添加10~(-9) M MLT有助于优化ICSI技术体系,提高显微授精后胚胎体外生产效率。     

L-肉毒碱对牛精液体外保存时间及品质的影响

精液体外孵育保存会使精子品质下降,抗氧化剂L-肉毒碱可促进激活的脂肪酸从细胞质到线粒体基质的转运,减少ROS产生和脂质过氧化反应的发生。研究分析了牛精液体外保存过程中不同浓度L-肉毒碱(LC)(0、2、10和15mmol/L)和不同孵育时间(2、4、6h)对牛精子活力、质膜完整性、线粒体活性和顶体完整性的影响。结果表明:与对照组相比,在牛精液体外保存稀释液中添加10mmol/L和15mmol/L的LC均可显著(P0.05)提高精子活力(33.0%vs 45.6%,42.4%)、质膜完整率(61.2%vs 73.6%,68.4%)和顶体完整率(81.4%vs 88.4%,86.3%),而线粒体活性则是10 mmol/L LC组效果最好;将筛选的最佳浓度10mM LC组于27℃体外孵育2、4、6h后,其精子的活力、质膜完整率和线粒体高膜电位百分率均显著高于对照组(P0.05),顶体完整率仅在孵育6h后与对照组差异不显著(P0.05)。由此可见,LC可保护精子功能和结构免受损伤,不仅能改善牛精液体外保存的品质参数,又可延长牛精液体外保存的时间。     

添加咖啡因、亚牛磺酸对牛精子功能的影响

为研究获能液中添加咖啡因和亚牛磺酸对牛精子功能的影响,本研究将荷斯坦牛冻精解冻后分别添加在含不同浓度咖啡因(0、2.5、5.0、7.5mmol/L)或亚牛磺酸(0、5、10、20、40μmol/L)的获能处理液中,且每个处理组加入约200μL的精液,在CO_2培养箱里经上游处理45min,以评估咖啡因和亚牛磺酸对牛精子活力、顶体及质膜完整性的影响,进而探讨在获能液中亚牛磺酸替代咖啡因的效果。结果显示,添加2.5、5.0mmol/L咖啡因组经上游法获能处理后的牛精子活力和顶体完整率均显著高于对照组(P0.05),且2.5mmol/L咖啡因组精子活力最高;添加10、20μmol/L亚牛磺酸组经上游法获能处理后的牛精子活力、顶体完整率和质膜完整率均显著高于对照组(P0.05),且20μmol/L亚牛磺酸组的精子功能参数值最高;将筛选的最佳浓度2.5 mmol/L咖啡因和20μmol/L亚牛磺酸采用同样的方法处理,发现20μmol/L亚牛磺酸组的精子顶体完整率和质膜完整率均显著高于2.5mmol/L咖啡因组和对照组(P0.05)。因此,20μmol/L亚牛磺酸可以替代2.5mmol/L咖啡因用于体外受精体系中的精子获能处理,有助于提高精子功能参数。     

谷胱甘肽、咖啡因、染料木黄酮及其组合对牛冷冻精液精子运动性和体外受精的影响

为了探究还原型谷胱甘肽(GSH)、咖啡因(caffeine)和染料木黄酮(genistein)及其组合对牛冷冻精液解冻后精子运动能力和体外受精后早期胚胎发育的影响,将精液解冻后用分别添加不同组合GSH、caffeine和genistein的Sp-TALP和Fert-TALP培养基处理,2h后用计算机精子辅助分析(CASA)系统分析精子运动参数;并在受精滴中分别添加不同组合的GSH、caffeine和genistein,统计卵裂率、桑椹胚发育率和囊胚发育率。结果表明:(1)SpTALP培养基中添加5mM GSH+5mM caffeine,精子活率(TM)、平均曲线速度(VCL)以及平均鞭打频率(BCF)均显著高于10μM genistein+5 mM caffeine(P0.05)。(2)FertTALP培养基中添加5 mM GSH+5 mM caffeine和10μM genistein,直线运动精子活率(PM)均显著高于对照组(P0.05);同时5mM GSH+5mM caffeine也显著提高了精子运动参数VCL、BCF以及平均移动角度(MAD)(P0.05)。(3)在Fert-TALP培养基中添加5mM GSH+5mM caffeine,与Sp-TALP培养基相比,精子的VCL显著增加(P0.05),直线性(LIN)、摆动性(WOB)以及非前向运动(C级)精子百分率均显著降低(P0.05)。(4)受精滴中添加5mM GSH+5mM caffeine以及10μM genistein,卵裂率和桑椹胚发育率与对照组相比有较大幅度的提高,但差异不显著(P0.05)。10μM genistein处理组的囊胚发育率最高,但与对照组差异不显著(P0.05)。因此,10μM genistein或5mM caffeine+5mM GSH处理冻精,可以改善牛冷冻精子运动性和生存能力,并轻微促进体外胚胎的发育。     

添加咖啡因、亚牛磺酸对牛精子功能的影响

为研究获能液中添加咖啡因和亚牛磺酸对牛精子功能的影响,本研究将荷斯坦牛冻精解冻后分别添加在含不同浓度咖啡因（0、2.5、5.0、7.5 mmol/L）或亚牛磺酸（0、5、10、20、40 μmol/L）的获能处理液中,且每个处理组加入约200 μL的精液,在CO₂培养箱里经上游处理45 min,以评估咖啡因和亚牛磺酸对牛精子活力、顶体及质膜完整性的影响,进而探讨在获能液中亚牛磺酸替代咖啡因的效果。结果显示,添加2.5、5.0 mmol/L咖啡因组经上游法获能处理后的牛精子活力和顶体完整率均显著高于对照组（P<0.05）,且2.5 mmol/L咖啡因组精子活力最高;添加10、20 μmol/L亚牛磺酸组经上游法获能处理后的牛精子活力、顶体完整率和质膜完整率均显著高于对照组（P<0.05）,且20 μmol/L亚牛磺酸组的精子功能参数值最高;将筛选的最佳浓度2.5 mmol/L咖啡因和20 μmol/L亚牛磺酸采用同样的方法处理,发现20 μmol/L亚牛磺酸组的精子顶体完整率和质膜完整率均显著高于2.5 mmol/L咖啡因组和对照组（P<0.05）。因此,20 μmol/L亚牛磺酸可以替代2.5 mmol/L咖啡因用于体外受精体系中的精子获能处理,有助于提高精子功能参数。     

添加褪黑素对牛精液品质的影响

为探讨褪黑素(melatonin,MLT)在牛精液保存中的抗氧化作用,本研究利用目测法、低渗膨胀法和考马斯亮兰染色法分析了不同MLT浓度(0、10^-3、10^-4和10^-5 mol/L)和不同孵育时间(1、4和8 h)对精子活力、质膜和顶体完整性的影响。结果发现,与对照组相比,在稀释液中分别添加10^-3和10^-4 mol/L MLT均可显著提高精子活力、质膜完整率和顶体完整率(P＜0.05),且10^-3 mol/L MLT添加效果最佳;MLT(10^-3 mol/L)组在27 ℃孵育1、4 h后,其精子的活力、质膜完整率和顶体完整率均显著高于对照组(P＜0.05)。因此,添加10^-3 mol/L MLT可明显改善牛精液品质,提高牛精液的保存时间和保存质量。     

诱导牛精子体外获能的培养基及方法

用去透明带金黄地鼠异种精子体外穿透试验,检测冻精复苏经各种处理后的精子穿卵率。发现在４种基本培养基（ＢＯ、ｍＢＷＷ、ＴＹＨ、ＨａｍＦ１０＋ＲＰＭＩ－１６４０）中不加亚牛磺酸时,牛精子不能耐受较高浓度（４μｍｏｌ／Ｌ）钙离子载体（ＩＡ）的刺激（以１０ｍｉｎ计）;而低浓度ＩＡ（低于４μｍｏｌ／Ｌ）处理精子不能诱导获能。生物活性物质,如肝素、咖啡因、亚牛磺酸、肾上腺素单独或联合低浓度ＩＡ处理精子,短期（６ｈ）内也不能诱导获能。当基本培养基中含有亚牛磺酸时,牛精子能耐受高浓度ＩＡ（１０μｍｏｌ／Ｌ）的刺激,并使牛精子获能;亚牛磺酸与肾上腺素、咖啡因联合使用,并在获能液中添加透明质酸酶时,穿卵率进一步提高,获能效果显著改善。以ＨａｍＦ１０＋ＲＰＭＩ１６４０为主的混合培养基,在牛精子的存活时间、穿卵率等方面优于ＢＯ、ｍＢＷＷ、ＴＹＨ培养基。结果表明,用Ｆ１０和１６４０的混合培养基,添加亚牛磺酸、肾上腺素、咖啡因、透明质酸酶,经１０μｍｏｌ／ＬＩＡ处理牛精子１０～１５ｍｉｎ,是快速诱导牛精子体外获能的有效方法     

葡萄糖在牛体外受精及胚胎发育中的影响

在牛精子获能液中添加不同浓度的葡萄糖,应用体外培养技术对牛精子体外获能及早期胚胎发育进行研究,通过观察顶体反应、超激活、活率和早期胚胎发育率,筛选出获能液中最适葡萄糖浓度及其有利于牛早期胚胎发育的最佳浓度.结果表明:葡萄糖是精子获能和维持超激活运动的主要能源物质,其代谢过程中产生的活性氧在牛精子体外获能、受精过程中起重要作用,高浓度(超过9.15 mM)葡萄糖有利于获能的完成;但是对早期胚胎发育不利,对早期胚胎发育来说其最适添加量为6.10 mM,此时的囊胚率最高.     

钙离子载体对牛精子体外受精及胚胎发育的影响

在牛精子获能液中添加不同浓度的钙离子载体,应用体外培养技术对牛精子体外获能及早期胚胎发育作了研究。通过对顶体反应、超激活、活率和早期胚胎发育率的观察,筛选出获能液中最适的钙离子载体浓度,作用时间及其有利于早期胚胎发育的最佳浓度。结果表明:钙离子载体在诱导牛精子获能上存在一个浓度-时间阈值,其最佳浓度和时间组合是0.1μM处理2min或者0.15μM处理0.5min,此时的囊胚率最高;钙离子载体的添加不能诱导牛精子获能的发生。     

不同浓度肝素对塔里木马鹿精子体外获能效果的影响

为了探讨不同浓度肝素对塔里木马鹿精子体外获能的影响,试验随机取塔里木马鹿冻融精子,添加到SP-TALIP获能液中并添加不同浓度(0,10,20,50,100μg/m L)的肝素,在显微镜下检测0,2,4,6,8小时时的精子活力,试验采用金霉素(CTC)染色法检测精子获能率及顶体反应率等指标,探讨不同浓度肝素对塔里木马鹿精子活力、存活时间、获能率、顶体反应率的影响。结果表明:精子活力随肝素浓度升高而呈下降趋势,4 h后10μg/m L和20μg/m L肝素组精子活力显著高于其他组(P0.05),其中20μg/m L肝素组精子存活时间最长,显著高于其他组(P0.05)。随着培养时间的延长,各试验组精子获能率与对照组相比明显提高,2小时、4小时时20μg/m L肝素组精子获能率显著高于其他组(P0.05);各试验组精子顶体反应率与对照组相比有升高趋势。说明获能液中添加20μg/m L肝素可有效诱导塔里木马鹿精子体外获能。     

褪黑素对湘中黑牛精子特性及体外胚胎发育的保护作用

本文旨在探讨褪黑素对湘中黑牛精子特性及体外胚胎发育的保护作用,通过不同浓度的褪黑素处理精子,测定冻融湘中黑牛精子运动指标参数,然后用褪黑素处理过的精子用于体外受精,随后分析胚胎发育和凋亡率以及抗氧化相关基因的表达。结果发现10~(-5)和10~(-3) mol/L褪黑素可显著提高质膜完整性、线粒体的活性和顶体完整性,降低了细胞内的活性氧水平(P0.05),10~(-3) mol/L组褪黑素处理的精子体外培养囊胚数显著高于其他组,细胞凋亡率显著低于其他组(P0.05)。10~(-5)和10~(-3) mol/L组Bcl-2相关X蛋白(Bax)基因转录水平显著低于对照组,10~(-3)组B细胞淋巴瘤2(Bcl2)、过氧化氢酶(Cat)转录程度显著高于对照组(P0.05)。表明褪黑素能够改善牛冻融精液的质量,提高体外胚胎发育保护作用。     

白藜芦醇对牛精液冷冻保存的抗氧化作用研究

为了研究白藜芦醇对牛精液冷冻保存效果的影响,本试验在牛精液冷冻稀释液中添加白藜芦醇,测定冷冻-解冻后精子的总抗氧化能力、丙二醛含量和谷胱甘肽过氧化物酶活力。结果表明,随着白藜芦醇浓度的升高(15~150μM),精子T-AOC和GSH-Px活力逐渐增强,MDA含量降低。稀释液中添加150μM白藜芦醇时,精子GSH-Px活力和MDA含量分别达到113.3μmol/L和96.14nmol/mL,显著高于对照组(P0.05);100μM组精子T-AOC最高,但与150μM组差异不显著(P0.05);白藜芦醇浓度为200μM时,T-AOC及MDA含量显著低于对照组(P0.05),但GSH-Px活力与对照组差异不显著(P0.05)。     

抗氧化剂对马精子低温及冷冻保存效果的影响

试验旨在研究不同抗氧化剂对马精子低温保存及冷冻效果的影响。选取6匹英纯血种公马作为试验动物,以INRA82液作为基础稀释液（对照组）,分别添加谷氨酰胺（0.015 g/mL）、甘氨酸（0.019 g/mL）、半胱氨酸（0.024 g/mL）、甲硫氨酸（0.015 g/mL）、牛磺酸（0.063 g/mL）、维生素C（0.4 mg/mL）、维生素E（0.5 mg/mL）、褪黑素（0.001 mg/mL）制备成含有不同抗氧化剂的低温保存和冷冻保存稀释液,将浓缩处理后的马精子分别置于上述稀释液中保存或冷冻,检测低温保存48 h后精子运动参数,评价抗氧化剂对精子低温保存的影响;检测精子冻融后运动参数、精子质膜完整性、线粒体膜电势及顶体完整性,评价抗氧化剂对精子冷冻效果的影响。结果表明,精子低温保存48 h后,添加牛磺酸组活精子比例和前向运动精子比例显著高于对照组（P<0.05）,添加维生素C组前向运动精子比例显著高于对照组（P<0.05）。冷冻解冻后结果表明,添加不同抗氧化剂没有改善精子冻融后活精子比例和前向运动精子比例,但添加甲硫氨酸显著延长了精子体外存活能力（P<0.05）;添加不同抗氧化剂精子质膜完整性与对照组间无显著差异（P>0.05）,但甲硫氨酸和甘氨酸组有高于对照组的趋势;添加维生素E和甲硫氨酸组精子线粒体膜电势显著高于对照组（P<0.05）,不同抗氧化剂组精子顶体完整性与对照组间均无显著差异（P>0.05）。结果提示,低温保存时添加牛磺酸和维生素C可以提高精液低温保存效果;冷冻时添加甲硫氨酸能提高精子质膜完整性和线粒体膜电势,且能够延长精子冻融后的存活时间。     

猪卵母细胞体外受精条件的优化

猪卵母细胞体外受精(in vitro fertilization,IVF)技术为受精和胚胎早期发育机理等基础理论的研究及生产实践提供了重要的研究手段。虽然猪IVF的研究已经取得了一些进展,但其囊胚发育率仍然较低,亟需建立更为稳定、高效的体外受精方法。本试验通过比较精子浓度,精子获能处理,不同精卵共孵育培养体系以及在卵母细胞成熟过程中添加不同激素等影响猪卵母细胞体外受精胚胎发育能力的因素,以求找到最佳的猪卵母细胞体外受精体系。结果显示:在精子浓度为1×10~5~1×10~7/mL,5×10~6/mL的精子浓度显著提高体外受精效率(P<0.05);以茶碱、咖啡及咖啡因联合使用肝素作为获能物质处理精子,发现2.5 mmol/L茶碱处理组体外受精效率显著提高(P<0.05);通过比较不同的受精体系,发现使用40个卵/500μL体系显著提高体外受精效率(P<0.05);在卵母细胞成熟液中添加不同激素组合,发现添加10IU/mL PMSG,10IU/mL HCG和2.5IU/mL FSH激素组合,体外受精效率显著提高(P<0.05)。本试验结果表明,在M199中添加10IU/mL PMSG,10IU/mL HCG和2.5IU/mL FSH体外成熟培养卵母细胞,以5×10~6/mL精子浓度,2.5mmol/L茶碱作为获能物质处理精子,40个卵/500μL共孵育的IVF体系效果最佳,其卵裂率为(61.33±0.77)%,囊胚率为(28.33±1.08)%。本试验将为深入研究猪IVF提供理论参考。     

肝素浓度对辽宁绒山羊精子体外获能的影响

在TALP液中添加不同浓度(25、50、100μg/mL)的肝素对辽宁绒山羊精子进行获能处理,在显微镜下检测处理1、2、3、4、5h后的精子活力,用考马斯亮蓝染色法检测获能处理0.5、1、2、4h后的精子获能状况,探讨肝素浓度对绒山羊精子活力、存活时间、获能率的影响。结果发现,在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下,精子活力随肝素浓度升高而下降,3 h以后25μg/mL肝素组精子活力显著高于其它肝素组(P<0.05)。添加肝素组获能率显著高于对照组(P<0.05),各肝素组精子获能率差异不显著(P>0.05)。对照组精子存活时间最长,25μg/mL肝素组精子存活时间为10.12 h,显著高于其它两组(P<0.05)。表明25μg/mL肝素处理辽宁绒山羊精子体外获能较为适宜。     

CLC对冻融牛精子体外获能及抗氧化、抗凋亡能力的影响

本研究目的是评价CLC对牛冻融精子获能、抗氧化及抗凋亡能力的影响。试验分对照组和CLC处理组(0.5、1.0、1.5及2.0 mg/mL),检测冻融牛精子体外获能后的酪氨酸磷酸化水平以及冻融牛精子抗氧化基因和细胞凋亡基因的表达。结果:1)在0.5 mg/mL CLC处理组冷冻效果最好,与对照组和1.0 mg/mL CLC处理组相比无显著差异;2)冻融牛精子获能处理后,在1.0 mg/mL CLC处理组精子蛋白酪氨酸磷酸化水平最高,与对照组相比无显著差异;3)在0.5 mg/mL CLC处理组冻融牛精子抗氧化基因CAT、GPX和SOD的表达量与对照组相比显著升高(P<0.05);4)在0.5和1.0 mg/mL CLC处理组凋亡基因Caspase-3、Caspase-8和BAX的表达量与对照组相比显著降低(P<0.05)。结论:添加CLC可以改进冻融牛精子获能和抗氧化、抗凋亡能力。     

孕酮对牛精子体外受精及胚胎发育的影响

通过在牛精子获能液中添加不同浓度的孕酮,应用体外培养技术对牛精子体外获能及早期胚胎发育进行了研究。通过对顶体反应、超激活、早期胚胎发育率及其与精子孵育时间对精子活率的观察,筛选出获能液中最适孕酮浓度及其有利于牛早期胚胎发育的最佳浓度。结果表明,单独添加孕酮不能诱导牛精子体外获能;孕酮只能诱导获能精子发生顶体反应,而且有一个剂量依赖关系,以1μg/mL的添加效果最好。当浓度超过1μg/mL、作用时间超过4h时,精子活率下降;获能液中添加孕酮,无论剂量多少,对胚胎体外发育无明显的促进作用。     

诱导牛精子体外获能方法的研究

用去透明带的金黄地鼠卵异种精子体外穿透试验,检测冻精复苏,经各种处理后的精子穿卵率,结果表明,B0培养基,经咖啡因2mmol/L,肝素50μg/ml处理,并添加亚牛磺酸70μmol/L和透明质酸酶1g/L,是诱导牛精子体外获能的有效方法。     

牛磺酸对种公猪精液品质、血清激素含量及精浆抗氧化能力的影响

本试验旨在研究牛磺酸(Tau)对种公猪性欲、精液品质、血清激素含量及精浆抗氧化能力的影响。选用24头年龄、体重相近的健康成年大约克夏种公猪,随机分为4个组,每组6个重复,每个重复1头猪。各组分别饲喂牛磺酸添加水平为0(对照组)、2、4、6 g/kg的饲粮,试验期90 d,分为1~45 d和46~90 d 2个阶段。结果表明:1)试验46~90 d时,添加6 g/kg牛磺酸显著提高了种公猪的性欲(P0.05)、采精量(P0.01)、精子活力(P0.05),4 g/kg牛磺酸改善了精子密度和精子畸形率(P0.05);2)与对照组相比,6 g/kg牛磺酸水平组极显著提高了种公猪血清促黄体素(LH)含量(P0.01),显著提高了睾酮(T)含量(P0.05);3)试验46~90 d时,6 g/kg牛磺酸显著降低了种公猪精浆丙二醛(M DA)含量(P0.05),显著提高了超氧化物歧化酶(SOD)活力(P0.05),4 g/kg牛磺酸显著提高了谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力(P0.05)。由此可见,饲粮中长期添加牛磺酸可以调控种公猪血清激素含量,增加精浆抗氧化能力,进而增强种公猪性欲,提高种公猪精液品质,本试验条件下牛磺酸适宜添加水平为6 g/kg。