水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法的优化

[目的]了解玻璃化冷冻一解冻及不同孤雌激活条件对水牛卵母细胞发育潜能的影响,为构建完善的水牛卵母细胞孤雌激活培养体系奠定基础.[方法]利用玻璃化冷冻法对水牛体外成熟卵母细胞进行冷冻保存1～2d,解冻复苏后进行孤雌激活,以新鲜的体外成熟卵母细胞为对照,探讨离子霉素浓度、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)浓度和处理时间对玻璃化冷冻复苏后水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响.[结果]与新鲜的体外成熟卵母细胞相比,玻璃化冷冻—解冻复苏后水牛体外成熟卵母细胞孤雌激活的卵裂率、4-细胞率、8-细胞率和囊胚发育率均极显著降低(P＜0.01).水牛体外成熟卵母细胞经玻璃化冷冻—解冻复苏后,以3.5 μmol/L离子霉素激活5 min联合2mmol/L 6-DMAP培养2h的孤雌激活效果最佳,其卵裂率、4-细胞率、8-细胞率和囊胚发育率分别为60.6％、45.1％、33.7％和14.8％.[结论]水牛体外成熟卵母细胞经玻璃化冷冻—解冻复苏后,其激活阈值发生改变,因此不宜采用与新鲜体外成熟卵母细胞一致的激活程序进行孤雌激活.     

玻璃化冷冻对猪卵母细胞体外发育能力的影响

采用猪未成熟(GV期)和体外成熟(MⅡ期)卵母细胞分组进行冷冻保护剂毒性试验,试验组经冷冻液处理,对照组不用冷冻液处理。结果表明,GV期与MⅡ期卵母细胞相比,两者经冷冻保护剂处理后,其存活率、体外受精胚卵裂率均无显著差异(P>0.05);试验组GV期卵母细胞存活率、体外成熟率及体外受精胚卵裂率虽略低于对照组(85.9%,72.4%和50.9%对91.3%,73.9%和53.3%),但差异不显著(P>0.05);试验组MⅡ期卵母细胞存活率虽显著低于对照组,但卵裂率与对照组无显著差异(P>0.05)。表明所用冷冻液及其处理程序,对卵母细胞无明显毒性。分3组对猪卵母细胞进行冷冻保存试验:I组为对照组;II组为GV期卵母细胞冷冻组;III组为MⅡ期卵母细胞冷冻组。结果表明,经开放式拉管(Open pulled straw,OPS)法玻璃化冷冻后,GV期和MⅡ期卵母细胞均获得较高的形态正常率,但GV期卵母细胞冷冻后存活率要显著高于MⅡ期卵母细胞(P<0.05)。经玻璃化冷冻后,GV期卵母细胞的体外成熟率和卵裂率均明显低于新鲜卵母细胞(42.6%和7.79%对73.9%和53.3%,P<0.05),MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后未获得卵裂。在GV期卵母细胞冷冻组,154枚卵母细胞冷冻后经体外成熟、体外受精及体外培养,共有12枚发生卵裂,其中6枚发育至8-细胞,3枚发育至16-细胞,3枚发育至桑椹胚。本研究表明,所用冷冻方案更适合于猪GV期卵母细胞的冷冻保存。     

猪卵母细胞不同孤雌激活方法的研究

通过对不同电激活参数的摸索,电激活和化学激活联合的研究,以确定适合于猪卵母细胞孤雌激活的最佳方案。结果表明,体外成熟猪卵母细胞在电场时程60μs,1次直流脉冲的条件下,电场强度1.6kV/cm时其卵裂率(88.68%)和桑葚胚率(81.13%)较其他各组高。在电场强度为1.6 kV/cm,1次直流脉冲的条件下,脉冲时程20μs时,卵母细胞卵裂率仅为75.38%,桑葚胚率为64.62%;40和80μs时,卵裂率分别是84.62%和77.17%;100μs时,卵母细胞的卵裂率和桑葚胚率都明显下降。在电场强度为1.6kV/cm,电场时程为60μs的条件下,2次电脉冲激活卵母细胞的卵裂率(87.50%)、桑葚胚率(81.25%)和1次电脉冲的卵裂率(88.68%)、桑葚胚率(80.13%)之间无显著性差异(P﹥0.05),但两者均显著高于3次电脉冲的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)。成熟卵母细胞经电刺激(ES)后,分别用CB(7.5μg/mL)、CHX(10μg/mL)、6-DMAP(2 mmol/L)、CB(7.5μg/mL)+CHX(10μg/mL)、CB(7.5μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理4 h,ES+CB+CHX和ES+CB+6-DMAP组卵裂率显著高于其他3组,但其桑葚胚率差异不显著。结果显示,电场强度为1.6 kV/cm,电场时程60μs,1次脉冲的电刺激对体外成熟的猪卵母细胞(IVM)孤雌激活效果最好;1次或2次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,过高脉冲对细胞反而有伤害作用;电激活和化学激活联合应用可提高猪卵母细胞的卵裂率。     

抗冻剂对水牛卵母细胞冷冻后孤雌发育的影响

试验主要探索了不同抗冻剂组合对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻解冻后孤雌发育替力的影响.通过对3种抗冻剂组合(Ⅰ:20%乙二醇(EG)+20%二甲基亚砜(DMSO);Ⅱ:20%EG+20%1,2-丙二醇(PROH);Ⅲ:20%EG+20%PROH+10%DMSO)的毒性试验,发现试验组的形态正常率均低于对照组(p<0.05),但Ⅰ组的分裂率、8细胞率和囊胚率与对照组无显著差异(p>0.05).并以抗冻剂Ⅰ组做冷冻液,探讨了解冻液中蔗糖梯度浓度(A:0.5,0.25,0.10 mol/L与B:0.62,0.42,0.31 mol/L)对卵母细胞冷冻-解冻效果的影响.B组的形态正常率显著高于A组(p<0.05),且B组的分裂率和囊胚率与对照组无显著差异(p>0.05).最后比较了3种抗冻剂组合对卵母细胞冷冻解冻后的孤雌激活发育效果.3组的形态正常率、分裂率和8-细胞率之间无显著差异(p>0.05),但均显著低于对照组(p<0.05),其中Ⅰ组的囊胚率与Ⅱ、Ⅲ组及对照组差异均不显著(p>0.05),Ⅱ组和Ⅲ组的囊胚率显著低于对照组(p<0.05).结果表明:采用抗冻剂组合Ⅰ冷冻水牛MⅡ期卵母细胞,解冻时采用B组解冻液去除抗冻剂,可以取得较好的冷冻保存效果.     

玻璃化冷冻水牛MⅡ期卵母细胞的初步研究

为建立玻璃化冷冻保存水牛MⅡ期卵母细胞的有效程序.试验比较了3种冷冻保护剂组合(Ⅰ:20%乙二醇 20%二甲基亚砜:Ⅱ:25%乙二醇 25%二甲基亚砜:Ⅲ:25%乙二醇 25%甘油)和3种玻璃化冷冻方法(毛细玻璃管法、铜环法及半麦管法)对水牛MⅡ期卵母细胞的毒性和冷冻效果的影响.结果表明,Ⅲ组的卵母细胞形态正常率显著低于I和Ⅱ组(P<0.05),且Ⅲ组的存活率也显著低于Ⅰ组(P<0.05).而Ⅰ和Ⅱ组的卵母细胞形态正常率和存活率没有显著差异(P＞0.05).进一步孤雌激活发现,Ⅰ组的卵裂率显著高于Ⅲ组(29.17±4.81%,5.56±11.11%,P<0.05),Ⅰ组的囊胚发育率显著高于Ⅱ和Ⅲ组(8.33士2.23%,2.43±2.87%,1.86±3.71%,P<0.05).然而Ⅱ和Ⅲ组间的卵裂率和囊胚发育率没有差别(P＞0.05).采用铜环法的回收率显著高于半麦管法(P＜0.05),但和毛细玻璃管法之间差异不显著(P＞05),冻后卵母细胞孤雌激活后的卵裂率和囊胚发育率差异不显著(P>0.05).3种冷冻保护剂中Ⅰ组的细胞毒性作用最小.Ⅲ组的细胞毒性作用最大;铜环法和毛细玻璃管法能有效冷冻保存水牛的MⅡ期卵母细胞.     

玻璃化冷冻水牛MII期卵母细胞的初步研究

为建立玻璃化冷冻保存水牛MⅡ期卵母细胞的有效程序,试验比较了3种冷冻保护剂组合(Ⅰ:20%乙二醇+20%二甲基亚砜;Ⅱ:25%乙二醇+25%二甲基亚砜;III:25%乙二醇+25%甘油)和3种玻璃化冷冻方法(毛细玻璃管法、铜环法及半麦管法)对水牛MⅡ期卵母细胞的毒性和冷冻效果的影响。结果表明,Ⅲ组的卵母细胞形态正常率显著低于Ⅰ和Ⅱ组(P<0.05),且III组的存活率也显著低于Ⅰ组(P<0.05),而Ⅰ和Ⅱ组的卵母细胞形态正常率和存活率没有显著差异(P>0.05)。进一步孤雌激活发现,Ⅰ组的卵裂率显著高于Ⅲ组(29.17±4.81%,5.56±11.11%,P<0.05),Ⅰ组的囊胚发育率显著高于Ⅱ和Ⅲ组(8.33±2.23%,2.43±2.87%,1.86±3.71%,P<0.05),然而Ⅱ和Ⅲ组间的卵裂率和囊胚发育率没有差别(P>0.05)。采用铜环法的回收率显著高于半麦管法(P<0.05),但和毛细玻璃管法之间差异不显著(P>0.05),冻后卵母细胞孤雌激活后的卵裂率和囊胚发育率差异不显著(P>0.05)。3种冷冻保护剂中Ⅰ组的细胞毒性作用最小,Ⅲ组的细胞毒性作用最大;铜环法和毛细玻璃管法能有效冷冻保存...     

CB·氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养中的作用

[目的]研究CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中的作用,为优化相关技术体系提供依据。[方法]卵母细胞经体外成熟培养,采用不同孤雌激活方法(Ele.+CB组、CB组、Ele.组、对照组),研究CB在激活中的作用。激活后采用PZM3培养液,并去除氨基酸成分,探索氨基酸对体外培养胚胎的作用。[结果]CB+Ele.组的卵裂率显著地高于其他3组(P<0.05),囊胚率为32.7%,囊胚细胞数为61.4,而其他3组均未出现囊胚。电激活(脉冲电压100 V/mm,脉冲时程100μs,脉冲次数1次)联合CB处理,可激活卵母细胞体外发育至囊胚,CB有助于提高卵裂率、囊胚率。添加氨基酸的培养液中的卵母细胞的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著提高(P<0.05),表明氨基酸能提高猪孤雌激活胚胎培养效果。[结论]添加CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中能提高胚胎的培养效果。     

小鼠卵泡卵母细胞的一步冷冻研究

通过对冷冻液和平衡时间的筛选,研究了裸露小鼠卵泡卵母细胞的一步冷冻。结果表明:当冷冻液含25％的1,2—丙二醇和0.25mol/L的蔗糖,平衡时间为10min时,冷冻效果最为有效,解冻后存活率和形态正常率分别达66.2％和58.1％.解冻后形态正常的卵泡卵母细胞可以发育成熟,成熟率为22.7％。     

猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻保存技术研究

旨在探讨提高猪GV期卵母细胞冷冻保存效率的可能途径。将EDS、EFS40和ES冷冻保护液用作卵母细胞冻前、冻后程序的处理,但不冷冻,比较3种冷冻保护剂对猪GV期卵母细胞的毒性作用;采用ES液作玻璃化液,比较常规细管法、OPS法和电镜铜网法3种冷冻载体对猪GV期卵母细胞的冷冻效果;并以ES液作玻璃化液,OPS管为冷冻载体,将猪GV期卵母细胞分5组,即对照组、CB+离心处理组、直接冷冻组、CB+冷冻组、CB+离心+冷冻组进行对比处理,比较各处理卵母细胞的冻后存活率与发育率。结果表明,在不同冷冻保护液中,以ES液组合作为玻璃化冷冻液时的毒性作用最低,与对照组间无明显差异(P>0.05);在3种冷冻载体中,用OPS法冷冻猪GV期卵母细胞,所获冻后存活率明显高于电镜铜网法和细管法(65.4%对45.0%和38.6%,P<0.05),并可获得最佳的冻后成熟率(43.3%);猪GV期卵母细胞单纯经细胞松弛素B和离心极化处理,不会严重影响卵母细胞的存活,但卵裂率显著低于对照组(39.0%对52.1%,P<0.05);细胞松弛素B处理或细胞松弛素B+离心极化处理后再进行玻璃化冷冻,并不能提高卵母细胞的冻后存活率与发育率。采用OPS法直接进行GV期卵母细胞的玻璃化冷冻,可获得7.8%的冻后卵裂率,并能获得桑椹胚发育,是一种有效的猪卵母细胞冷冻保存技术。     

凋亡抑制剂Z-VAD-FMK在猪卵母细胞冷冻保存中的应用

在猪MII期猪卵母细胞冷冻解冻后的孵育液中添加凋亡抑制剂Z-VAD-FMK,通过检测线粒体膜电位、早期凋亡、胚胎发育和相关基因表达等研究Z-VAD-FMK对冷冻后卵母细胞的影响。结果表明:(1)冷冻后线粒体膜电位(0.91)与新鲜卵母细胞(1.33)相比显著降低,添加Z-VAD-FMK显著提高了线粒体膜电位(1.19);(2)冷冻后卵母细胞的早期凋亡率(57.65%)与新鲜卵母细胞(8.37%)相比显著升高,存活率(61.45%)、孤雌激活卵裂率(13.18%)和囊胚率(3.10%)与新鲜卵母细胞(98.97%、89.41%和41.40%)相比显著下降,冻后孵育液中添加Z-VAD-FMK处理能显著降低其早期凋亡率(32.82%),并显著提高其存活、孤雌激活卵裂和囊胚的发育能力(73.21%、39.83%和10.79%);(3)冷冻后死亡受体途径和线粒体途径中促凋亡基因表达显著增加,抗凋亡基因表达显著降低,加入Z-VAD-FMK后促凋亡基因表达显著下降,抗凋亡基因表达显著增加。总之,在冻后孵育液中添加凋亡抑制剂Z-VAD-FMK能提高卵母细胞膜电位水平,降低细胞凋亡和相关基因表达,从而达到提高冻后猪卯母细胞体外发育能力的目的。     

卵丘细胞和细胞骨架稳定剂对绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响

[目的]为了提高绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻的效果。[方法]以未冷冻的卵母细胞为对照,研究卵丘细胞存在与否以及不同浓度的细胞骨架稳定剂对绵羊成熟卵母细胞冷冻保存的影响。[结果]卵丘细胞存在与否对绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻没有影响。在所有细胞松弛素B处理组中,用7.5、10.0μg/ml细胞松弛素B处理的绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻后获得较高的囊胚率(P<0.05),分别为8.1%、7.8%;在所有紫杉醇处理组中,用0.5μmol/L紫杉醇处理的绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻后获得的囊胚率最高为10.1%(P<0.05)。[结论]细胞骨架稳定剂细胞松弛素B或紫杉醇可以提高绵羊成熟卵母细胞的玻璃化冷冻效果。     

绵羊卵母细胞OPS玻璃化冷冻效果初报

比较了绵羊卵母细胞不同发育阶段对OPS玻璃化冷冻效果的影响,同时比较了程序化冷冻与OPS玻璃化冷冻的效果。结果显示:成熟培养0h(GV期)、16h、24h、26h的卵母细胞玻璃化冷冻、解冻后形态正常数差异不显著()P<0.05),培养24h卵母细胞冷冻保存后,分裂卵数、囊胚发育数与培养0h、16h、26h试验组差异显著(38.3%VS13.3%、26.7%、28.3%;11.7%VS0%、5.0%、8.3%,P<0.05),而培养16h、26h两个试验组之间差异不显著(P<0.05);程序化冷冻方法(参考胚胎程序化冷冻)、OPS玻璃化冷冻与不冷冻三组试验在形态正常数、分裂卵数和囊胚发育数上差异都极显著(20.0%VS54.1%、100%;6.7%VS37.5%、78.3%;0%VS11.4%、23.3%,P<0.01)。     

玻璃化冷冻对猪卵母细胞超微结构的影响

猪体外成熟培养的卵母细胞用平皿-微滴法玻璃化冷冻,冷冻解冻后对其超微结构损伤和正常的体外成熟培养的卵母细胞进行了电镜观察比较。结果表明,玻璃化冷冻的卵母细胞解冻后有不同程度的结构损伤,包括:透明带破裂;微绒毛几乎消失;有的部位质膜模糊甚至破裂;质膜下皮质颗粒减少;线粒体膨胀,电子致密度下降,嵴消失;大量囊泡在质膜周围变形融合;细胞基质出现空白区。玻璃化冷冻引起卵母细胞结构损伤是导致卵母细胞解冻后存活力下降和受精率降低的主要原因。     

Vitrification of Bovine Oocytes by Open Pulled Straw

Bovine oocytes cultured in vitro for 6 hours or 22 hours were cryopreserved in different vitrification solutions (EFS40, EFS50, EDFS30 or EDFS40) by the two-step method with OPS (open pulled straw).The best results were achieved by using EDFS30 to cryopreserve the oocytes either for in vitro fertilization or for chemical activation. The blastocyst rates were 12% and 17% in 6 hour and 22 hour cultures respectively following in vitro fertilization. If frozen-thawed oocytes were continued in culture up to 24 hours, and were activated by chemicals, the blastocyst rates were 22% and 24% in 6-hour and 22-hour groups respectively.There were no statistical differences between frozen and fresh oocytes (P ＞ 0.05).     

In Vitro Developmental Potential of Cloned Embryos Derived from Bovine Somatic Cells and Rabbits Oocyte

180 reconstituted embryos were produced by nuclear transplantation using bovine ear fibroblasts at G0 or non-G0 stage as donor nuclei and oocytes collected from superovulated multiparous or young rabbits as recipients. After cultivation in two kinds of medium M199+ 10%FBS or RD+ 10%FBS, 112 of them developed to 2-cell stage (62.2%) and 26 to morula stage (14.4%) and 20 of them eventually developed to blastocyst stage (11. 1% ). There is no significant difference for the cleavage rates in two groups of reconstituted embryos derived from G0-stage and non-G0 stage donor cells respectively. However, G0-stage donor cells could result in higher rate of 8-cell - 16-cell stage embryos significantly (P＜0.05), as well as higher rate of blastocysts (P＜0.01). It seems that using two different culture systems had no significant effects on the cleavage rate, morula rate or blastocyst rate (P＞0.05).     

猪卵母细胞冷冻保存研究

【目的】本研究试图通过比较猪卵母细胞超低温冷冻保存方法、冷冻承载工具、冷冻卵母细胞的类型，从而有效地保存猪卵母细胞;【方法】利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞，以台盼蓝染色、二乙酸荧光素（FDA）染色鉴定卵母细胞冷冻后的成活率，以体外成熟和体外受精鉴定卵母细胞冷冻后的发育能力，研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。【结果】（1）程序化法冷冻保存中，9%乙二醇（EG），10%二甲基亚砜（DMSO），10%甘油（Gly）均对猪MII期卵母细胞有冷冻保护作用，极显著高于对照组（FDA染色成活率33.8%，25.8%，23.5% vs 2.5%，P <0.01），且以9%EG的效果最好，显著高于另外两组（ 33.8% vs 25.8%，23.5%, P <0.05）。（2）玻璃微细管（GMP）法是猪卵母细胞超低温冷冻的较好方法，以普通的麦管（Straw）法进行的程序化冷冻为对照组，GMP管法显著提高猪卵母细胞的冷冻成活率（分别为63.3%和34.5%，P<0.05）。（3）在玻璃化冷冻方法中，不同的冷冻液载体对猪卵母细胞冷冻成活率有影响。以EFS40为冷冻液，Straw和GMP管作冷冻液载体，卵母细胞的成活率分别为45.0%和65.9%，二者差异显著（P <0.05）。（4）用Straw的程序化冷冻法和用GMP管的玻璃化冷冻法对猪GV期卵母细胞冷冻均有效，但二者差异显著（成活率分别为30.0%和59.7%，P<0.05）。冷冻后继续培养，分别有2.8%和6.3%的卵母细胞周围颗粒层发生扩散。（5）冷冻对MII期卵母细胞的发育潜能影响较大，用新鲜精液使其受精，仅有4.9%的受精卵分裂，极显著低于对照组的49.5%（P<0.01）；发育至4-细胞期的比例为1.7%，但未能发育至8-细胞期以上胚胎。【结论】选用MⅡ期卵母细胞、以GMP管为冷冻承载工具、应用玻璃化冷冻方法能够较好地保存猪卵母细胞，为进一步完善猪卵母细胞超低温冷冻保存技术体系提供了参考依据。     

Effects of Chemical Activation on the Parthenogenetic Development of Porcine in vitro Maturation Oocytes

The objective of this study was to determine the effects of ionomycin combined with cytochalasin B (CB), cycloheximide (CHX), or 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) on the activation of porcine oocytes. In Experiment 1, in vitro matured oocytes were activated with 15,20,25 or 30 mmol L-1 ionomycin separately. Activation rates of 20,25 mmol L-1 and 30 mmol L-1 treatments were higher (P<0.05) than that of 15 mmol L-1 treatment. In Experiment 2, in vitro matured oocytes were activated with 20 mmol L-1 ionomycin for 10,20,30,40 or 50 min and then incubated with 2 mmol L-1 6-DMAP for 6 h.Cleavage and blastocyst rates [(72.40±13.02)％, (25.37±11.43)％] after treatments for 40 min were higher (P>0.05) thanthose of the other treatments. In Experiment 3, matured oocytes were activated with ionomycin and then incubated with 7.5 mgmL-1 CB, 10 mg mL-1 CHX, 2 mmol L-16-DMAP, 7.5 mg mL-1 CB + 10 mg mL-1 CHX or 7.5 mg mL-1 CB + 2 mmol L-1 6-DMAP for6 h. The rates of activation, cleavage and blastocyst of 2 mmol L-1 6-DMAP treatment [(86.05±4.29)％, (61.77±8.10)％ and(21.62±3.31)％] were higher (P<0.05) than those of 7.5 mg mL-1 CB treatment. In Experiment 4, matured oocytes wereactivated with ionomycin and then incubated with 2 mmol L-1 6-DMAP for 3.5, 5.5 or 7.5 h. Cleavage rates and blastocyst rates of 5.5 h treatment [(66.59±14.36)％ and (25.40±10.16)％] were higher (P>0.05) than those of other treatments. In conclusion, activation of porcine oocytes appears to be most successful using the combination of ionomycin (20 mmol L-1,40 min) followed by 6-DMAP (2 mmol L-1, 5.5 h).     

LH Plays a Role to Enhance the Nuclear and Cytoplasm Synchronization During In vitro Maturation of Ovine Oocytes

This study is aimed to investigate the effect of luteinizing hormone (LH) on maturation and fertilization in vitro of ovine oocytes.The ovine oocytes were cultured in vitro in medium with or without LH,and then checked by confocal laser scanning microscope to observe the distribution of cortical granules stained with FITC-LCA during different maturation periods.Similarly,some in vitro matured oocytes were also fertilized in vitro for analysis of their developmental potentiality further.After being cultured in vitro for 4 h,there were significant differences about the rate of germinal vesicle break down (GVBD) between the treatment (with LH) and the control groups (without any hormones) (36.76% vs 18%,P<0.05).Further,there were also significant differences of the cleavage and blastocyst rates between these two groups (67.15% vs 42.37%,21.9% vs 12.71%,P<0.05,respectively).The distribution of cortical granules appeared to spread from the edges to the central site of sheep oocytes following their delaying durations of maturation in vitro.It can be concluded that LH may play a role to delay the occurence of GVBD,prolong the maturation duration of cytoplasm,and enhance the nuclear and cytoplasm synchronization of ovine oocytes matured in vitro and finally improve their in vitro developmental potentiality.