用SDS—PAGE分析鸡毒霉形体广西分离株的结构蛋白

应用SDS－PAGE对鸡毒霉形体（Mycoplasma gallisepticum,MG)4个标准株和5个广西分离株的结构蛋白进行了比较分析。结果，在凝胶电泳图谱中10－100ku蛋白分子质量之间，F株缺少87ku蛋白带，Y3株在最靠近87ku蛋白带的上方和下方各缺少1条蛋白带，H2株和Y2株缺少64ku蛋白带，CH株缺少29ku蛋白带，97、75、43ku处的蛋白带为4个MG标准株和5个MG分离株所共有。表明9个MG供试菌株的结构蛋白都存在一定的差异，广西MG分离株的结构蛋白呈现多样性。     

茯苓多糖对点带石斑鱼非特异性免疫力的影响

为研究口服茯苓多糖对点带石斑鱼非特异性免疫力的影响,将茯苓多糖按05、0、200、350、500 mg/kg的剂量添加到基础饵料中,饲养点带石斑鱼[(83.25±8.94)g]28 d。每7 d取样1次,测定血清中酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、补体C3、补体C4、白蛋白/球蛋白(A/G)值,以及血液白细胞数和白细胞吞噬能力。结果表明:茯苓多糖能降低点带石斑鱼血清A/G值,提高血清补体C3含量,提高血液白细胞数和白细胞吞噬率。茯苓多糖对点带石斑鱼血清中ACP活力、LZM活力和补体C4含量影响不明显,但能降低血液白细胞吞噬指数。茯苓多糖能提高点带石斑鱼非特异性免疫力,建议饲料中茯苓多糖添加量为50~200 mg/kg,连续喂食28 d。     

鸡蛋卵黄蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

本文对43枚采自不同品种、不同个体的鸡蛋中的卵黄蛋白进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。共出现18个类型、16条区带,单个鸡蛋中出现其中的7～11条区带。根据各区带迁移率的不同,由快到慢暂命名为ABCDEFGHIJKLMNoP带。其中AGHIK带为所有试验蛋所共有,其它区带出现的频率似乎存在品种间的差异。与血清蛋白电泳结果比较发现卵黄蛋白G带具有类似血清清蛋白的迁移率;卵黄蛋白的A到F带迁移率在血清前清蛋白范围内。认为卵黄蛋白中存在类似于血清清蛋白及前清蛋白的组份,与某些报道不同。     

EDTA对鸭疫里氏杆菌外膜蛋白表达及免疫原性的影响

用加入金属离子螯合剂EDTA的TSB(胰酪胨大豆肉汤)培养基,培养鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)Ⅰ型,将未加入EDTA的TSB培养的RAⅠ型菌株作对照。比较后发现,加入EDTA组的外膜蛋白(OMPs)的SDS-PAGE图谱发生改变,从34 ku~100 ku增加了多条蛋白条带,特别是39 ku,60 ku和110 ku蛋白浓度较大。电泳胶经Western-blot(康复血清作为一抗,自制酶标兔抗鸭为二抗),与对照组相比,实验组增加了39 ku条带。实验证明,加入金属离子螯合剂EDTA对外膜蛋白的表达和免疫原性均有影响。     

蓖麻蚕血淋巴蛋白凝胶电泳分离

1.四龄眠前1天蛋白带图谱(1)白血系统共同具有蛋白带13条,最多素白17条,最少兰白15条。(2)黄血系统共同具有蛋白带9条,最多是中花黄、白黄16条,最少为小花黄13条(3)白、黄血系统共同具有9条带。2、五龄上簇前2天血液蛋白图谱(1)白血系统共同具有15条带,最多素白17条,最少兰白15条。(2)黄血系统共同具有带12条,最多小花黄、大花黄17条,最少是兰黄14条。(3)黄、白血系统共同具有带12条。3、四、五龄蚕及血色系统血液蛋白图谱的异同。(1)五龄蚕血液蛋白图谱宽狭明暗比四龄清楚。(2)黄血系统品种,南一、中花黄、花白黄5龄比4龄多1～2条。(3)白血系统蛋白带多于黄血系统,五龄蛋白带一般比4龄多。     

蛋氨酸对2个规格斜带石斑鱼生长性能、血清生化指标及肝脏酶活性的影响

本试验旨在研究饲料蛋氨酸(Met)对小规格[初始体重为(9.75±0.05) g]和大规格[初始体重为(102.60±0.14) g]斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)生长性能、血清生化指标和肝脏酶活性的影响,探究2个规格斜带石斑鱼的Met需求量及其对营养物质的利用能力差异。通过添加晶体DL-Met,配制Met水平分别为0. 70%(0. 7M)、0. 85%(0. 85M)、1. 00%(1. 0M)、1.20%(1.2M)、1.40%(1.4M)、1.60%(1.6M)、1.90%(1.9M)和2.20%(2.2M)的8种等氮等脂的饲料。将同一规格斜带石斑鱼随机分为6组,每组3个重复,小规格斜带石斑鱼每个重复放养30尾鱼,分别投喂0.7M、1.0M、1.2M、1.6M、1.9M和2.2M饲料8周;大规格斜带石斑鱼每个重复放养20尾鱼,分别投喂0.7M、0.85M、1.0M、1.2M、1.4M和1.6M饲料10周。结果表明:1)小规格斜带石斑鱼各组增重率和蛋白质效率均显著高于大规格斜带石斑鱼(P0.05)。2)小规格斜带石斑鱼0.7M组血清总蛋白、总胆固醇和甘油三酯含量显著低于大规格斜带石斑鱼(P0.05),血清葡萄糖含量显著高于大规格斜带石斑鱼(P0.05)。3)小规格斜带石斑鱼1.2M组肝脏谷草转氨酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性显著低于大规格斜带石斑鱼(P0.05),肝脏超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷丙转氨酶活性显著高于大规格斜带石斑鱼(P0.05)。综合以上结果,以特定生长率为判据,经二次曲线模型拟合可得出,小规格和大规格斜带石斑鱼对Met的最适需要量分别为饲料的1.40%(占饲料蛋白质的3.16%)和1.07%(占饲料蛋白质的2.38%)。与大规格斜带石斑鱼相比,在饲料Met水平低时,小规格斜带石斑鱼对葡萄糖调节能力较弱,随着Met水平升高,小规格斜带石斑鱼对糖和蛋白质的利用均得到改善。     

大鲵皮肤水溶性蛋白质成分分析及活性鉴定

该试验旨在研究大鲵(Andrias davidianus)皮肤水溶性蛋白成分及其活性,揭示大鲵皮肤黏液的蛋白组分,鉴定具有潜在功能活性的蛋白质。通过物理和化学刺激的方法收集大鲵皮肤黏液,制备大鲵皮肤黏液水溶性蛋白样品,并通过SDS-PAGE垂直电泳、细菌凝集试验、氧化物清除效率试验以及蛋白质谱Label-free分析大鲵皮肤黏液水溶性蛋白的成分以及活性。结果表明:大鲵皮肤黏液中含有多种水溶性蛋白,分子量介于10～300 kDa之间,其中50 kDa分子量以上蛋白条带较为丰富,在100 kDa分子量以上含有较多蛋白,14 kDa以下蛋白含量较少。大鲵皮肤黏液水溶性蛋白对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABST)2种自由基具有清除能力,说明其具有一定的抗氧化活性。大鲵皮肤黏液水溶性蛋白对大肠杆菌和嗜水气单胞菌2种细菌具有较强的凝集作用,暗示大鲵皮肤水溶性蛋白具有一定的抗菌活性。蛋白质谱Label-free分析表明这些蛋白是由66种蛋白质组成;通过分子注释有20种蛋白与免疫抗病功能相关,2种蛋白与抗氧化活性相关。研究揭示大鲵皮肤黏液水溶性蛋白含有66种蛋白,分子量介于10～300 kDa,活性鉴定结果显示大鲵黏液水溶性蛋白具有抗氧化活性和抗菌活性。     

配合饲料饲养赤点石斑鱼研究

赤点石斑鱼(Epinephelus akarra)是我国东南沿海及东南亚一些国家和地区海水网箱养殖的名贵经济鱼类。目前,国内外养殖石斑鱼的饵料主要是小杂鱼和虾蟹等。随着近海渔业资源减少,作为饵料的新鲜小杂鱼数量越来越少,满足不了海水养殖业的发展需要。为了解决这个问题,我们于1992年8月在福建霞浦进行了配合饲料饲养赤点石斑鱼的研究。     

雁鹅消化系统EST和SOD同工酶电泳分析

为了对雁鹅的深入研究和开发利用等提供生化指标依据,试验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳方法,对其消化系统中的食道、胃、小肠下段、小肠上段、肝脏、胰脏等6种器官组织中的酯酶(EST)和超氧化物歧化酶(SOD)同工酶进行分离分析。结果表明:共分离出EST_1~EST_(13)、电泳迁移率为0.70~0.04的13条谱带,6种器官组织中分离出的谱带数分别为6,8,10,10,9,10条,其中EST_(13)为肝脏中的特有谱带,EST_1为胰脏中的特有谱带;共分离出SOD_1~SOD_(19)、电泳迁移率为0.80~0.07的19条谱带,6种器官组织中分离出的谱带数分别为7,8,9,7,11,19条,其中SOD_1、SOD_7、SOD_8、SOD_(13)、SOD_(14)、SOD_(15)、SOD_(18)、SOD_(19)等为胰脏中的特有谱带。各器官组织中EST和SOD同工酶谱带分布和酶活力有所不同,存在明显的组织特异性。     

梅花鹿结核病间接ELISA方法的建立

为了建立鹿结核病的快速检测方法,试验采用亲和层析方法纯化梅花鹿血清IgG,并免疫兔,制备兔抗梅花鹿IgG抗体,辣根过氧化物酶(HRP)进行标记,通过ELISA和Western-blot对HRP标记的兔抗梅花鹿IgG抗体进行鉴定。同时合成结核分枝杆菌38 ku基因,并与pET-22b(+)质粒连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,诱导表达和纯化38 ku蛋白,以38 ku蛋白作为包被抗原,以HRP标记的兔抗梅花鹿IgG抗体作为二抗,建立间接ELISA方法。利用建立的间接ELISA方法对结核菌素皮肤试验检出的20份阴性血清和10份阳性血清进行验证。结果表明：对梅花鹿血清IgG进行纯化,得到大小分别约为50 ku和25 ku的蛋白质;制备的HRP标记的兔抗梅花鹿IgG抗体可特异性识别梅花鹿血清IgG,在抗体浓度稀释比例为1∶20 000时仍有很好的结合效果;38 ku蛋白作为抗原的最佳包被浓度为1μg/mL,被检梅花鹿血清的最佳稀释比例为1∶100,HRP标记的兔抗梅花鹿IgG抗体的最佳稀释比例为1∶10 000;间接ELISA方法能够准确区分结核菌素皮肤试验确定的阳性和阴性梅...     

四种血清型鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白免疫原性分析

采用超声波裂解和超速离心法提取1型、2型、10型与11型鸭疫里默氏杆菌(Ra)的外膜蛋白(Omp),经SDS-PAGE分析,以上4个血清型Ra的Omp均由13～17个蛋白多肽组成,其分子质量大小为20～120 ku,相同血清型的电泳图谱相似,不同血清型的电泳图谱差异较大.交叉免疫印记试验结果表明,4种血清型在44～69 ku有交叉反应的蛋白多肽.     

Molecular cloning and expression analysis of interferon regulatory factor 8 (IRF8) in turbot, Scophthalmus maximus

Mucus immunoglobulin (Ig) of flounder (Paralichthys olivaceus) was purified by the combination of salting-out, Sephacryl S-300 gel filtration chromatography and DEAE Sepharose chromatography. According to the SDS-PAGE and native-PAGE, the purified mucus Ig showed apparent molecular weights of 72 kDa (heavy chain) and 26 kDa (light chain), and a total molecular weight of 798 kDa, which indicated mucus IgM was in tetrameric form. Purified mucus Ig was used to immunize the Balb/C mice, nineteen hybridomas secreting monoclonal antibodies (mAbs) against flounder mucus Ig were obtained by indirect enzyme-linked immunosorbent assay, and three of them designated as 1A-M2, 1C-M10 and 3F-M9 were cloned by limiting dilution. In Western blotting, the three mAbs specifically reacted to the heavy (H) chain of mucus Ig, but not reacted with serum Ig of flounder, whereas mAb 2D8 against serum Ig previously produced could react with the H chain of both mucus and serum Ig, indicating the composition of the mucus and serum Ig H chains was different. Meanwhile, surface Ig positive (sIg+) lymphocytes in the peripheral blood, spleen, skin and gills of healthy flounder, were analyzed by flow cytometry using mAb 1A-M2 and mAb 2D8, and the results revealed that both mAbs were reactive with the sIg+ lymphocytes. The positive reactivity rates for mAb 1A-M2 were 38.64% in the peripheral blood, 23.6% in the spleen, 16.56% in the skin and 6.26% in the gills, while the positive reactivity rates for mAb 2D8 were 48.89%, 33.7%, 15% and 6.02%, respectively, suggesting mucus Ig was similar, but not identical, to serum Ig. These results generated important mucosal immunological information and gave a valuable insight into understanding the mucosal immunity in flounder.     

鸡甘露聚糖结合凝集素的分离纯化及初步鉴定

本研究采用CNBr活化的Sepharose 4B亲和柱进行亲和层析,从鸡血清中分离纯化甘露聚糖结合凝集素（MBL）,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）方法测定其分子质量和构型。电泳图谱显示,在分子质量为33ku-34ku处出现两条带,表明鸡MBL具有多聚体形式。研究结果为进一步深入研究禽类MBL分子的特性奠定了基础。     

不孕奶牛宫颈黏液相关ASA免疫印迹分析

为探讨和分析免疫性不孕奶牛和可孕奶牛宫颈黏液ASA能够识别的精子膜抗原及其差异,本试验通过提取精子膜总蛋白,对24头免疫性不孕奶牛和14头可孕奶牛宫颈黏液ASA能够识别的精子抗原进行了比较分析。免疫印迹试验结果显示,不孕奶牛宫颈黏液ASA对分子质量为88-90ku、66ku、55~57ku、25-27ku的精子膜抗原有特殊免疫性反应,识别抗原率为100％（24／24）、100％（24／24）、87．5％（21／24）、70．8％（17／24）;而可孕奶牛宫颈黏液AsA对分子质量为88-90ku、55-57ku、25-27ku的识别率仅为21．4％（3／14）、14．2％（2／14）、14．2％（2／14）,可孕奶牛宫颈黏液不能识别分子质量为66ku#~精子膜抗原。结果表明,不孕奶牛宫颈黏液ASA~g够识别更多的精子膜抗原,这些精子膜抗原可能与免疫性不孕有密切相关,对其深入的研究将有助于免疫性不孕相关精子膜抗原的筛选和鉴定。     

绵羊精浆蛋白质组2-DE图谱的构建及初步分析

本研究比较了丙酮沉淀法制备蛋白质不同上样量对绵羊精浆蛋白质二维电泳图谱的影响。结果显示,精浆总蛋白经SDS-PAGE电泳,得到分子质量在14.4~116 ku的28条蛋白质条带。二维电泳图经PDQuest 8.0分析,上样量为0.8、1.0、1.2 mg时检测出的蛋白质点分别为207±10、281±13和374±16个,分子质量基本分布在20~80 ku、等电点为4~9的区域内,随着上样量的增加,分子质量在20~80 ku的蛋白质点明显增多,但每个分子质量区间的蛋白质点所占的比率较为恒定。研究结果表明,采丙酮沉淀制备精浆蛋白结合合适的上样量能够建立绵羊精浆全蛋白质图谱,为进一步研究绵羊精浆蛋白质组学奠定基础。     

Production of monoclonal antibodies against serum immunoglobulins of black rockfish (Sebastes schlegeli Higendorf)

The present study was undertaken to produce monoclonal antibodies (MAbs) against immunoglobulin (Ig) purified from black rockfish (Sebastes schlegeli Higendorf) serum using protein A, mannan binding protein, and goat IgG affinity columns. These three different ligands were found to possess high affinity for black rockfish serum Ig. All of the Igs purified eluted at only 0.46 M NaCl concentration in anion exchange column chromatography and consisted of two bands at 70 kDa and 25 kDa in SDS-PAGE; they also had similar antigenicity for MAbs to Ig heavy chain in immunoblot assays. Therefore, black rockfish Ig is believed to exist as a single isotype within serum. The MAbs produced against Ig heavy chain reacted specifically with spots distributed over the pI range from 4.8 to 5.6 with a molecular weight of 70 kDa on two dimensional gel electrophoresis immunoblot profiles.     

猪细胞周期蛋白依赖性激酶2多克隆抗体的制备与鉴定

为研究猪细胞周期蛋白依赖性激酶2(pCDK2)的生物学功能,本试验构建重组原核表达载体pET28a-pCdk2,转化大肠杆菌BL21 (DE3)受体菌,用IPTG诱导重组蛋白(rpCDK2)表达并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定,蛋白经纯化及与弗氏佐剂乳化后免疫家兔制备多克隆抗体。分别用Western blotting和免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性。结果显示,成功表达了rpCDK2蛋白,该蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,可溶性rpCDK2蛋白分子质量约为38 ku,包涵体rpCDK2蛋白在38~43 ku间有3种不同分子质量形式;IPMA检测结果显示,所制备的pCDK2蛋白多克隆抗体与猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)免疫染色呈特异性反应,且Western blotting分析显示,多克隆抗体与这两种细胞的总蛋白反应出现4条特异性条带(分子质量在34~50 ku之间),可能跟pCDK2的多种磷酸化形式有关。本试验利用原核表达系统成功制备了rpCDK2蛋白,并制备了免疫活性和特异性良好的pCDK2蛋白多克隆抗体,为该蛋白生物学功能及相关疾病研究提供了基础材料。     

Preparation and Identification of Polyclonal Antibodies against Porcine Cyclin Dependent Kinase 2

In order to research the biofunction of porcine cyclin dependent kinase 2 (pCDK2), this study prepared polyclonal antibodies against pCDK2.The recombinant prokaryotic expression plasmid pET28a-pCdk2 was constructed and transformed into BL21 (DE3), IPTG was used to induce the expression of recombinant pCDK2 (rpCDK2) which was then analyzed by SDS-PAGE and Western blotting.The expressed proteins were purified and emulsified with freund's adjuvant, the mixture was used to immunize the rabbits to prepare polyclonal antibodies against pCDK2.The immunocompetence of the antibody was identified by immunoperoxidase monolayer assay (IPMA), and the specificity was confirmed by Western blotting.The results showed that rpCDK2 was successfully expressed by prokaryotic expression system, and the expression products showed two forms:Solubility and inclusion body(IB), the molecular weight of the solute rpCDK2 was about 38 ku, however three different molecular weight forms (from 38 to 43 ku) of IB were observed.IPMA results showed that polyclonal antibodies against pCDK2 protein showed perfect activity which could recognize pCDK2 expressed in PK-15 cells and ST cells specifically.Western blotting analysis showed that four bands with different molecular weight forms (from 34 to 50 ku) were observed when the polyclonal antibodies against pCDK2 protein reacted with the total protein extracted from PK-15 and ST cells.In conclusion, the rpCDK2 protein was successfully expressed by prokaryotic expression system, the prepared rabbit polyclonal antibodies against pCDK2 protein showed wonderful activity and specificity, and the study provided basic material for the research of protein biofunction and related diseases.     

用美国白蛾核型多角体病毒表达家蚕促前胸腺激素基因

携带有家蚕促前胸腺激素PTTH基因的重组转移载体pHcMU1PTTH(含有麻蝇毒素IA信号序列 )与美国白蛾核型多角体病毒 (HcNPV)基因组DNA共转染SPIM细胞 ,经 2轮空斑纯化 ,筛选出重组病毒HcNPVPTTH+ ,SDSPAGE和Westernblot分析表明 :在细胞培养上清中可检测到PTTH的存在 ,说明麻蝇毒素IA信号序列可被SPIM细胞识别。用抗PTTH的兔血清进行Westernblot分析可显示分子量为2 0ku左右的 2条带 ,但当培养液内加入衣霉素时 ,仅出现 1条分子量小于 1 8ku的信号带 ,推测 2条信号带的产生与糖基化修饰不一致有关     

伪狂犬病病毒gE/gI基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为获得具有生物活性的伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)gE/gI蛋白,建立PRV抗体快速检测方法。将含有PRV gE、gI基因的质粒pFastBacdual-GP67-gE/gI转化至宿主菌,经位点特异性重组和蓝白斑筛选后获得重组杆粒rBacmid-gE/gI,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。采用悬浮的Sf9细胞进行发酵并纯化产物,SDS-PAGE和Western blot分析镍柱纯化后的重组蛋白。结果显示,重组杆粒在4800 bp处克隆出预期大小的条带,表示重组杆粒构建成功。SDS-PAGE和Western blot表明,在50 ku和65 ku处出现预期大小的条带,能与PRV标准阳性血清特异性反应,不与PRV gE/gI缺失疫苗免疫血清反应。结果表明gE/gI重组蛋白具有良好的反应原性,为PRV抗体快速检测及区分PRV野毒感染和疫苗免疫奠定了基础。