高山松miR171a及其靶基因的鉴定与表达分析

以裸子植物高山松为试验材料,利用笔者所在实验室前期构建的高山松miRNA数据,通过生物信息学方法筛选与高山松生长发育相关的miR171a,并通过基于RNA连接酶的cDNA末端快速扩增法(RLM-5′RACE)验证得出,GRAS家族转录因子(Unigene10015)和肌动蛋白结合蛋白(Unigene83401)的基因为...     

胡杨miR1444b在拟南芥中正调控植物抗旱性

目的miR1444b是木本植物特异miR1444家族中的一员,能够参与植物对金属胁迫的响应,但在干旱胁迫响应中的功能尚不明确。方法本实验克隆得到了胡杨MIR1444b基因(peu-MIR1444b)及其启动子(pro-peu-MIR1444b),将peu-MIR1444b基因在模式植株拟南芥中过表达,对转基因植株进行正常浇水、甘露醇模拟干旱和自然干旱条件处理,研究peu-MIR1444b的功能。结果克隆得到的pro-peu-MIR1444b和peu-MIR1444b与Phytozome数据库收录的毛果杨基因组序列相似性分别为99.61%和98.82%。利用PlantCARE数据库分析发现,pro-peu-MIR1444b序列中包含逆境相关的TC-rich repeats元件和受干旱诱导的MYB结合位点MBS。实时荧光定量PCR分析显示miR1444b在转基因拟南芥中表达量显著高于野生型,预测的靶基因葡聚糖合成酶Ⅳ(AT3G14570.2)表达量明显下调,初步确定葡聚糖合成酶Ⅳ在拟南芥中被peu-miR1444b负调控。在250 mmol/L甘露醇模拟的干旱胁迫条件下,转基因拟南芥株系TG-2和TG-5萌发率分别显著高于野生型20.83%和26.67%,根长分别显著高于野生型56.83%和52.60%(P < 0.05)。土壤自然干旱8 d测得转基因拟南芥的光合速率、气孔导度、叶片水分利用效率、PSⅡ最大光化学效率和过氧化物酶(POD)活性均显著高于野生型(P < 0.05)。结论胡杨miR1444b可以促进根系生长增加植物的吸水能力,负调控葡聚糖合成酶Ⅳ提高植物的渗透调节能力,维持植物在水分亏缺条件下的光合效率,保证植株正常生长,在拟南芥中正调控植物抗旱性。      

miR156a在不同海棠花瓣色泽形成中的作用

【目的】为了揭示miR156a对观赏海棠花瓣花色苷形成的调控作用。【方法】以观赏海棠‘王族’、‘印第安魔力’、‘当娜’3个品种不同时期花瓣为试验材料,确定pre-miR156a基因序列,并对miR156a的靶基因进行预测。通过分光光度法和qRT-PCR分析花瓣中花色苷含量和miR156a相对表达量的差异。【结果】3个品种不同时期海棠花瓣中miR156a的含量有明显差异,miR156a随着花瓣增长相对表达量逐渐增多,随着颜色变深相对表达量逐渐减少。【结论】在海棠花瓣中,miR156a负调控花色苷生物合成。     

高山松miR482a的鉴定及其表达分析

以裸子植物高山松(Pinus densata)为试验材料,利用实验室前期构建的高山松miRNA数据库,通过生物信息学方法筛选了与生长发育相关的miR482a,并通过RLM-5′RACE的方法验证了NBS-LRR抗性蛋白(Unigenes45569)是高山松miR482a的靶基因。通过PCR方法克隆得到高山松miR482a前体序列是130 bp,并可形成稳定的茎环发夹结构,但其成熟序列的碱基保守性较差。系统进化显示pdemiR482a与裸子植物欧洲云杉的进化关系较近。经qRT-PCR分析表明,pde-miR482a在根中表达量最高,其次是在茎中。而靶基因Unigenes45569在根和茎中的表达水平相对较低,暗示pde-miR482a可以通过调控靶基因NBS-LRR抗性蛋白(Unigenes45569)而参与高山松的生长发育。     

异源表达Peu-miR473 a增强拟南芥的抗旱性

为了探究胡杨miR473a基因的功能,本文克隆了miR473a的前体Pre-Peu-miR473a,并利用农杆菌花序侵染法将其遗传转化入拟南芥。通过普通PCR和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色检测获得CaMV35S: miR473a过表达植株,然后对转基因和野生型植株在甘露醇模拟高渗环境与土壤自然干旱条件下的生长状况及各项生理指标进行评价。结果表明,胡杨miR473a前体长度为100 bp,与毛果杨前体序列相似度为100%,可以形成完美的二级茎环结构。相比于野生型,过表达胡杨miR473a的拟南芥在200 mmol/L甘露醇胁迫条件下的萌发率、根长和生长状况都优于野生型;在土壤干旱处理条件下,转基因拟南芥的株高、相对含水量、脯氨酸含量以及光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光合效率均显著高于野生型10%以上(P0.05)。半定量PCR检测显示:Peu-miR473a参与胡杨受干旱胁迫的正调控,杨树中预测的靶基因Potri.012G093900、Potri.007G100200、Potri.009G165300、Potri.004G204400受干旱胁迫的负调控;拟南芥中预测的靶基因AT1G24530、AT5G45000、AT5G46070及AT3G52950在转基因株系中表达量下降。初步预测它们有可能被miR473a靶向调控。本研究表明,miR473a基因在干旱胁迫条件下通过调控植株的抗脱水能力和渗透调节能力发挥一定抗旱作用。      

利用CRISPR/Cas9系统编辑拟南芥ILR3基因及功能验证

拟南芥转录因子ILR3(IAA-Leucine Resistant 3)在铁稳态的调节、葡萄糖异硫氰酸盐(glucosinolate,简称GLS)的生物合成和病原体响应方面起到重要作用。为更深入探索该转录因子在植物体内的更多功能,利用YAO基因启动子驱动Cas9在拟南芥中表达,成功获得ILR3基因编辑突变体。测序结果及序列分析结果表明,在ILR3编辑拟南芥中,该基因编码区发生了碱基缺失或插入,导致蛋白ILR3保守结构域丢失。并且,这些基因编辑突变体T2代幼苗与T-DNA插入突变体ilr3-2在缺铁环境下表现出相同的性状,进一步验证ILR3转录因子在植物对铁的吸收及体内平衡的作用,也为深入研究其更多生物学功能奠定了工作基础。     

紫娟茶树miR828a靶基因WER的克隆及生物信息学分析

为进一步了解mi R828a靶基因WER的功能及生物学特性,通过RACE方法对紫娟茶树WER基因进行克隆,并使用生物信息学Protparam、Signal P、SWISS-Mo DEL等工具对其序列进行分析。结果表明,WER基因全长885 bp,含有一条276 bp的完整开放阅读框,编码92个氨基酸,与番樱桃So MYB114具有较高的亲缘性;WER属于不稳定亲水蛋白,具有跨膜结构域,亚细胞定位于质膜和线粒体上,推测WER蛋白在质膜和线粒体上发挥信号转导的作用。     

花椰菜BraERF023a的克隆及在响应盐和干旱胁迫中的功能

【目的】在前期从花椰菜中筛选、鉴定出多个逆境胁迫应答相关ERF(Ethylene-responsive factors)转录因子的基础上,对其中一个未知功能的转录因子BraERF023a进行克隆,并阐释其在盐及干旱胁迫条件下的表达特征及功能。【方法】对花椰菜中的BraERF023a进行克隆,采用MEGA 6等生物学软件对其序列特征进行分析,采用qRT-PCR方法分析BraERF023a在盐及干旱胁迫条件下的表达特征,进而构建过表达载体并转化拟南芥,对BraERF023a过表达转基因拟南芥株系在盐及干旱胁迫下的表型、生存率进行观察、分析。【结果】序列分析证实,花椰菜BraERF023a编码区长度为597 bp,编码含198个氨基酸的蛋白质,其内含有一个AP2保守结构域。BraERF023a在十字花科芸薹属植物中具有很高保守性。转录表达模式分析显示,盐及干旱胁迫条件均可显著诱导花椰菜BraERF023a的表达。进一步的功能分析显示,在盐及干旱胁迫处理条件下,过表达BraERF023a的转基因拟南芥株系比野生型对照生长势更好,植株生存率更高,盐及干旱耐受能力明显增强。【结论】BraERF02...     

GA3介导miR171s及其靶基因VvSCLs调控葡萄种子发育的作用分析

[目的]鉴定vvi-miR171s成员及其靶基因,明确vvi-miR171s成员及其靶基因在葡萄种子发育中的重要作用及其响应赤霉素(Gibberellin,GA)调控种子发育的表达模式.[方法]以'魏可'葡萄('Wink')果实为试材,利用miR-RACE技术鉴定vvi-miR171a/b/e/f/g/h的成熟体序列;...     

Inhibition of miR397 by STTM technology to increase sweetpotato resistance to SPVD

As a critical food crop, sweetpotato(Ipomoea batatas(L.) Lam.) is widely planted all over the world, but it is deeply affected by Sweetpotato Virus Disease(SPVD). The present study utilized short tandem target mimic(STTM) technology to effectively up-regulate the expression of laccase(Ib LACs) by successfully inhibiting the expression of mi R397. The upstream genes in the lignin synthesis pathway were widely up-regulated by feedback regulation, including phenylalanine ammonialyase(PAL), 4-coumar...     

香蕉 miR164-NAC 调控模块的鉴定与分析

【目的】了解香蕉 MIR164 和 NAC 基因家族以及 miR164-NAC 调控模块在香蕉后熟和低温胁迫应答过程中扮演的角色,为其在香蕉品种改良和分子育种方面的研究提供理论基础。【方法】以‘巴西蕉’为试材,通过高通量测序结合生物信息学分析,利用 miRBase、NCBI 数据库以及 Clustal、TBtools、MCScanX、iTOL 等软件对香蕉 miR164 和 NAC 家族成员的染色体定位、结构、理化性质及系统发育关系等进行分析。通过降解组测序验证并结合转录组数据,明确了香蕉中多个 miR164-NAC 调控模块。分别设置后熟和低温实验,利用小分子RNA 杂交和 qRT-PCR 分析 miR164-NAC 调控模块在香蕉后熟和冷害两种过程中的表达模式。【结果】在香蕉中共鉴定出 6 个 miR164 家族成员,其中 4 个位于编码基因内部、2 个位于基因间区。系统进化分析发现,测序丰度较高的多条香蕉 MIR164s 基因前体均与番木瓜聚为一类,暗示香蕉 MIR164 基因家族的起源与双子叶植物更为接近。香蕉基因组共编码 222 个 NACs 成员,不均匀分布在所有 11 条染色体上。在香蕉 NACs 中共鉴定出134 对同源基因,包括 4 对串联重复基因和 130 对区段复制重复基因,表明香蕉 NACs 基因进化的主要动力来源于区段复制事件。针对香蕉、拟南芥和水稻 NACs 蛋白比较系统发育的分析,将该家族划分为 23 个亚群,结合转录组数据证实香蕉 NACs 基因存在广泛的冗余性和表达特异性。理化分析结果表明,几乎所有香蕉 NACs 蛋白均为亲水性,且仅有不到 15% 属于稳定蛋白。验证了香蕉中 miR164-NAC176/165 调控模块,香蕉 miR164 的积累受乙烯诱导且随果实后熟逐渐增强,而该调控模块中受 miR164 负调控的 MaNAC176/165 基因在果实后熟过程中的表达量逐渐降低。冷害条件下,香蕉 miR164 同样被明显诱导,导致其靶向的 MaNAC176 和 MaNAC165 也出现不同程度的下调表达。【结论】MaNAC176 和 MaNAC165 很可能是香蕉后熟的转录抑制子,而 miR164 通过负调控 MaNAC176/165 促进香蕉后熟。同时,这一模块也很可能是香蕉发生冷害的一个关键调控通路。确定了香蕉后熟和冷害响应的关键 miR164-NAC 候选模块,可为后续的克隆及功能分析奠定基础。     

拟南芥种子萌发及幼苗生长对干旱和NaCl胁迫的响应

为获得胁迫因子处理拟南芥的最佳浓度及其生长的临界胁迫浓度,以期进一步采用拟南芥基因缺失突变体,以PEG模拟干旱胁迫和NaCl作为盐胁迫因子,在室内培养条件下探讨了拟南芥种子萌发、幼苗生长、根长及渗透调节物质丙二醛和脯氨酸含量的变化。结果发现:干旱和高盐胁迫影响种子萌发的半抑制浓度分别为10%(PEG-6000)和150 mmol/L;幼苗生长的临界值分别为25%(PEG-6000)和250 mmol/L NaCl。随着干旱胁迫和NaCl胁迫程度的增加,丙二醛及脯氨酸的含量均明显增加。表明随着胁迫条件的加重,拟南芥幼苗质膜受到氧化性伤害,并通过合成脯氨酸等渗透调节物质的机制对胁迫因子产生响应。     

红麻miR394基因的克隆及CRISPR/Cas9载体构建

为探明miRNA在红麻中的功能,以红麻基因组DNA为模板,根据红麻microRNA(miRNA)高通量测序数据结果,克隆红麻miR394前体基因序列,并构建CRISPR/Cas9载体。结果表明红麻miR394前体基因序列大小为175bp,用Mfold在线软件分析,其前体序列能形成稳定的二级结构。根据红麻miR394前体基因序列,设计合适的CRISPR/Cas9靶标序列,利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以AtU3b和AtU6-29质粒为模板,使用Overlapping PCR法构建AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒,使用Golden Gate Cloning方法成功把靶标AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒构建到pYLCRISPR/Cas9载体中,并将构建好的载体命名为pCas9-miR394。分离红麻叶片原生质体,将pCas9-miR394载体转入红麻叶片原生质体中进行瞬时表达,测序结果表明:2个靶点Target site 1(T1)和Target site 2(T2)处都发生碱基突变,表明pCas9-miR394载体在红麻原生质体中具有靶向切割的活性。     

拟南芥热激因子AtHsfA1a对热胁迫中抗坏血酸过氧化物酶的调控

[目的]为了研究拟南芥热激因子AtHsfA1a对热胁迫中抗坏血酸过氧化物酶(APX,EC1.11.1.7)的调控.[方法]以内源A tHsfA1a基因沉默的转基因拟南芥及野生型植株为材料,热胁迫后,采用分光光度法分析APX酶活性的变化,采用实时荧光定量PCR研究APX基因的表达水平,采用染色质免疫沉淀技术研究AtHsfA1a与APX基因启动子区的体内结合情况.[结果]在热胁迫下内源AtHsfA1a基因沉默植株中的APX的活性和mRNA的表达量均低于野生型,内源AtHsfA1a基因沉默的植株中未筛选出APX基因启动子区片断,而野生型则筛选出APX基因启动子区片断.[结论]AtHsA1a对APX调控是直接的.该研究为进一步认识AtHsfA1a对植物耐逆境的作用及其应用提供理论依据,对揭示植物耐递境机理有重要意义.     

运用MSAP研究镉胁迫对拟南芥幼苗基因甲基化的影响

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,并在环境胁迫响应中起重要作用。运用甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术研究0、0.5、1.5、5.0 mg·L-1Cd2+处理对拟南芥幼苗全基因组DNA甲基化水平的影响,结果表明:(1)不同浓度镉处理19 d后,叶片数、地上部鲜重无明显变化,但根长受到显著抑制;(2)选取10对引物扩增DNA酶切产物,所得三个镉处理造成的拟南芥基因组MSAP%均高于对照(35%);(3)随着镉处理的增大,拟南芥基因组甲基化(M)型条带依次减少,去甲基化(D)型条带逐渐增加,并且条带亮度也有所变化;(4)将特异性条带克隆测序后发现,mRNA、假设蛋白、表达蛋白、用于编码假定蛋白的mRNA序列V型质子ATP酶亚组、叶绿体中光合体系II CP47基因、叶绿体DNA、rRNA重复单元、核糖体蛋白等多种序列均存在甲基化修饰现象。这些特异序列可为我们寻找镉胁迫的生物标记物及胁迫响应的机理研究提供一定的依据。     

拟南芥中1个新snoRNA基因的鉴定

核仁小分子RNA（snoRNA）分为box C／DsnoRN A,boxH／ACA snoRNA和MRPRNA3类,前2类以数量繁多,基因组织形式复杂,功能多样而成为snoRNA的主要研究对象。笔者综合运用生物信息学方法,在拟南芥基因组中发现了一个新的box C／DsnoRNA．AthZ270,对其序列结构、基因组织形式和功能进行了分析。