吡咯伯克霍尔德菌WY6-5的溶磷、抑菌与 促玉米生长作用研究

【目的】筛选兼具高效溶磷和抑菌作用的微生物,检测其溶磷效果和抑菌活性,鉴定抑菌代谢产物,并分析筛选微生物对植物生长的作用,为新型多功能抑菌微生物菌肥的研发提供材料。【方法】采集信阳毛尖茶车云山茶厂百年龄茶树根际土壤,稀释后涂布难溶性无机磷或难溶性有机磷培养基表面,培养后检测溶磷活性,测定溶磷圈直径,筛选具有高效溶磷作用的微生物,进行后续溶磷效果分析。高效溶磷菌WY6-5接种于培养液和土壤中,检测不同培养时间下,可溶性磷含量的变化规律,分析菌株WY6-5的溶磷活性;玉米盆栽土壤中接种菌株WY6-5菌液,种植27 d后分析玉米植株长势,检测溶磷菌WY6-5对苗期玉米生长的影响;采用双皿对扣培养法,验证菌株WY6-5产挥发性物质的抑菌作用,检测其对不同病原真菌的广谱抑菌效果,气相色谱串接质谱（GC-MS/MS）分析挥发性代谢物质,鉴定主效抑菌成分。【结果】筛选到3个兼具有降解难溶性无机磷和有机磷作用的微生物菌株,尤以菌株WY6-5溶磷效果最优。培养基培养条件下,对难溶性无机磷的溶解直径达2.3 cm,溶磷圈直径与菌落直径比为4.6;对难溶性有机磷溶解直径3.6 cm,溶磷圈直径与菌落直径比达7.2。表型观察、生理生化鉴定和系统发育树分析表明,菌株WY6-5为乳白色细菌,16S rRNA序列与Burkholderia pyrrocinia CIP 105874和Burkholderia stabilis CIP 106845两个菌株的同源性最高,进化树中聚成独立一支。另外,WY6-5与Burkholderia pyrrocinia具有高度相同的生理生化反应结果。因此,本研究将WY6-5鉴定为吡咯伯克霍尔德菌（Burkholderia pyrrocinia）。WY6-5在液体培养和土壤中均具有较好的溶磷活性,20 d培养时间内,液体培养液中磷含量最高达520.4 mg·L ^-1,为对照组176倍;土壤试验3—20 d期间,WY6-5处理组可溶性磷含量均高于对照组,且在盆栽试验中,能高效促进苗期玉米植株的生长,处理组叶长、叶宽、叶片数、茎粗、株高、鲜重等指标显著优于对照组;同时,菌株WY6-5还可产生挥发性抑菌物质,高效广谱抑制8种重要病原真菌的生长,抑菌率最高达100%,经GC-MS/MS检测发现,挥发性物质含有一种主效抑菌物,相对丰度达97%以上,鉴定为二甲基二硫。 【结论】吡咯伯克霍尔德菌（Burkholderia pyrrocinia）WY6-5分离自茶树根际土壤,在培养基、培养液和土壤环境下,均具有高效的溶磷效果,将难溶性的无机磷转化为植物可吸收的可溶性磷,并促进苗期玉米植株的生长;同时该菌还可产生挥发性抑菌物质二甲基二硫,高效抑制8种重要植物病原真菌的生长,抑制率最高达100%。菌株WY6-5兼具有提升土壤磷肥力、促进植物生长和和抑制真菌病害等多种重要作用,具有较好的生物学功能。     

枯草芽胞杆菌制剂用途广

<正>枯草芽胞杆菌制剂是农业部2006年发布的允许使用的微生态饲料添加剂。该制剂选取大自然中优势的枯草芽胞杆菌,经培养、发酵、干燥等工艺制成的含有大量活菌的产品。因为形成芽胞,枯草芽胞杆菌制剂能耐酸、耐碱、耐盐、耐高温和挤压,因而耐饲     

枯草芽胞杆菌芽胞表面展示外源蛋白的研究进展

枯草芽胞杆菌是一种生物安全的革兰氏阳性细菌,在营养匮乏的环境下,可形成具有强抗逆性的芽胞。枯草芽胞杆菌的芽胞由核心、皮层、孢子外套蛋白三部分组成,目前已成功利用枯草芽胞杆菌芽胞外套蛋白CotB、CotC、CotG、CotX和OxdD为载体,将酶蛋白、抗原蛋白或荧光标记蛋白等展示于芽胞表面。芽胞表面展示的蛋白通常具有较好的稳定性、易于纯化和安全性好等优点,可应用于医药、食品及饲料工业等领域,具有较大的应用前景。详细介绍了枯草芽胞杆菌芽胞的分子特点及芽胞表面展示系统的构建过程及其应用前景,为芽胞表面展示载体的基础及应用研究奠定基础。     

枯草芽胞杆菌α-淀粉酶高产菌株的选育

以Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１４１４０为出发菌株，经亚硝基胍反复多次处理和筛选，该菌α－淀粉酶酶活从８０００Ｕ／ｍｌ提高到３４２００Ｕ／ｍｌ，并探讨了一种高效的α－淀粉酶选育方法．另外在摇瓶培养过程中，探讨了培养基碳源、氮源对该菌株产酶特性的影响．     

枯草芽胞杆菌防治棉花黄萎病药效试验

正近年来,国内外在棉花黄萎病防控方面多集中于拮抗微生物的研究,其中土壤习居菌枯草芽胞杆菌的研究和应用较为普遍,部分产品在生产中得到应用,并取得一定效果。本试验田间验证枯草芽胞杆菌菌剂随水滴施,对棉花黄萎病的控制效果,为此菌剂在生产中应用提供依据。     

短小芽胞杆菌抑菌蛋白TasA基因克隆及功能分析

为了研究短小芽胞杆菌Bacillus pumilus DX01菌株的抑菌相关基因的功能,采用PCR方法从DX01基因组DNA中扩增出编码TasA基因的全长DNA序列,并构建原核表达载体pET2-TasA,在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达获得TasA基因的融合表达蛋白,分别利用悬滴法和平板打饼法检测融合蛋白对玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)分生孢子萌发和对玉米小斑病菌及水稻稻瘟病菌菌丝体生长的抑制活性,结果表明TasA融合蛋白对这2种植物病原真菌的生长有着显著的抑制作用。TasA基因包含1个780bp的完整开放阅读框(GenBank:KC692521),编码259个氨基酸残基;该序列与B.subtilis菌株PEBS2501(GenBank::FJ713581)、B.amyloliquefaciens HF-01(GenBank:JF781312)和B.subtilis菌株BWST7003(GenBank:AP012496)同源抑菌蛋白基因序列相似性达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析检测到约32.3kDa的融合蛋白;经Ni-NTA柱纯化后的融合蛋白对供试病原菌均有显著的抑制作用。经测定发酵液的TasA融合蛋白产率为28μg/mL,短小芽胞杆菌抑菌蛋白TasA基因具有良好的抑菌效果。     

枯草芽胞杆菌Bs-916的全基因组分析

 【目的】对枯草芽胞杆菌Bs-916进行全基因组测序,为今后更好挖掘和利用该菌生防潜力提供较多的分子生物学信息。【方法】通过应用比较基因组学软件与另一测序菌株Bs168进行全基因组序列分析。【结果】Bs-916菌株全基因组大小为3 925 958 bp,GC含量为46.4%,与其它已测序全基因组芽孢杆菌相比,其GC含量最高;预测所得CDS数为4 056个,152个串联重复区域,转座子103个,IS（插入序列）序列数量37个, tRNA 46个,rRNA 39个;比较基因组学分析其含有8个NRPS/PKS基因簇,其中bacillomycin L,macrolactin,difficidin这3个基因簇在比较菌株Bs168中不存在;该菌还含有植酸酶基因、comAPQX及sfp等与生防因子相关的基因。【结论】Bs-916菌株全基因组含有多种抗菌物质编码基因簇,是一类具有极大生防潜力的典型根际革兰氏阳性菌株。该菌株全基因组序列的测定及其遗传操作方法的可行性,有利于其次生代谢产物的开发和利用。次生代谢产物具有潜在的应用价值,有望在未来开发成独特的农业生物工程制剂。     

芽胞杆菌BJ-10的鉴定及其抑菌活性与防病作用

【目的】为了明确芽胞杆菌(Bacillus sp.)BJ-10的分类地位、抗菌物质特性和生防能力。【方法】利用PCR扩增并测序获得了芽胞杆菌BJ-10的gyrB基因序列,通过序列比对和聚类分析初步确定其分类地位;采用平板对峙的方法检测了BJ-10的抑菌谱;通过不同温度和pH处理测试了BJ-10发酵液中抗菌物质的稳定性;室内盆栽试验检测了BJ-10对甜瓜白粉病和细菌性果斑病的防治效果。【结论】初步鉴定菌株BJ-10为解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens);BJ-10对测定的9株植物病原真菌和1株病原细菌均具有不同程度的抑制作用;BJ-10发酵液中的抗菌物质具有较好的热稳定性和抗酸碱能力;室内盆栽试验结果显示芽胞杆菌BJ-10稀释发酵液对甜瓜白粉病和甜瓜细菌性果斑病均具有较高的防效。     

枯草芽胞杆菌对斑节对虾饲养池水净化作用的初步研究

将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)制剂施放于斑节对虾(Pcnaeus monodon)饲养池，利用血清学鉴定和TCBS培养基平板计数，分别监测养殖池水中B.subtilis和弧菌(Vibrio)的消长情况，并定期测定养殖水体的pH值、总碱度、COD值和亚硝酸盐、H2S浓度等水化学指标，研究了B.subtilis制剂对斑节对虾饲养池水水质的净化作用。结果表明，在饲养池中添加B.subtilis制剂后，池水的COD值、亚硝酸盐、H2S浓度比对照池有显著降低，而总碱度显著上升，pH值维持在8．02—8．60之间，表明B.subtilis制剂对净化斑节对虾饲养池水水质和调节养殖水体微生态结构稳定具有明显的作用。     

拮抗枯草芽胞杆菌的分离鉴定及其发酵优化

为了根治植物病害,提高农业生产率,培养出对植物病原菌具有抵抗作用的防治细菌,从植物根部的土壤中分离出一株对多种病原真菌具有生长抑制作用的枯草芽孢杆菌,在一段时间之后对病原菌菌丝进行细致观察,此菌对层出镰刀菌,串珠镰刀菌,腐皮镰刀菌,尖孢镰刀菌等均具有抑制其活性的作用。经过对16SrRNA序列分析及该菌形态生理特征等各方面的分析,结果表明该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),经过前一过程的提取分析后,继而对其发酵培养基进行了进一步的优化。     

枯草芽胞杆菌 R31 的原生质体制备方法优化

枯草芽胞杆菌R31可用于香蕉枯萎病大田生物防治,但难以开展遗传操作,探讨适合R31的遗传转化方法有利于推动R31的防病分子机理研究。根据R31在LB培养基中的生长曲线和生长状态,对适合原生质体制备和再生所需的培养时间和溶菌酶浓度开展优化,结果显示,R31在LB培养基中培养3~6 h时处于对数生长期,培养7 h后进入稳定期;显微镜观察显示,在对数生长前期,R31菌体以游离方式生长,培养5.5 h左右菌体开始相互连接,并逐渐形成网状结构,培养8 h后菌体形成三维网状结构。游离方式的菌体有利于原生质体制备和再生,兼顾原生质体制备所需的菌体浓度,优化出的最佳培养时间为4~4.5 h,此时最佳的溶菌酶浓度为3.5 mg/m L,原生质体的形成率达到98.45%,再生率达到50.18%,再生细胞占初始细胞的比例达到49.40%。     

绿色荧光蛋白基因对枯草芽胞杆菌的标记

以质粒pAD123为模板扩增出绿色荧光蛋白基因（gfp）序列，扩增产物连接到经酶切的枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）整合载体pAXc，构建重组质粒pAXc-gfp. pAXc-gfp线性化后转入野生型枯草芽胞杆菌B411，gfp编码序列通过同源泉重组整合列到B.subtilis B411染色体上，获得在无抗性选择压力下稳定表达绿色荧光蛋白的重组子B412.     

枯草芽胞杆菌GB519发酵液菌体数量和芽胞率检测方法的比较

为了提高枯草芽胞杆菌GB519发酵液菌体数量和芽胞率的统计效率,本研究采用平板涂布法和平板倾注法进行活菌计数,利用加热除菌法、结晶紫染色法和孔雀绿染色法开展芽胞率检测效率的比较研究。结果表明:平板涂布法与倾注法的菌体计数数量差异不大,误差率相对一致。枯草芽胞杆菌GB519利用结晶紫染色法与孔雀绿染色法检测芽胞率差异不显著。确定了枯草芽胞杆菌GB519加热除菌法菌体致死温度为80℃、时间为15 min,其芽胞量为131.9×10~8CFU/mL,芽胞率为50.1%,与孔雀绿染色法(54.8%)差异不显著,与结晶紫染色法芽胞率(58.7%)差异显著。本研究将为类似的芽胞检测研究提供方法和数据参考。     

枯草芽胞杆菌TL对断奶仔猪生长发育、肠道环境及健康状况的影响

选取120头杜×长×白三元杂交断奶仔猪,随机分成负对照组(基础日粮)、正对照组(基础日粮+2.5g/kg抗生素)、M1组(正对照组+150g/t抗生素)、M2组(正对照组+300g/t抗生素),试验期30d,研究枯草芽胞杆菌TL对断奶仔猪生长发育、肠道环境及健康状况的影响。结果发现:生长性能方面,与正对照组相比,M1组在体质量(断奶后30d)、平均日增重、平均日采食量方面分别提高7.81%(P0.05)、17.14%(P0.01)和33.10%(P0.01),且M1组和M2组可以极显著降低断奶仔猪的腹泻率。血液指标方面,与正对照组相比,M1组血清GSH-Px、T-SOD分别提高9.0%(P0.05)和32.78%(P0.01),MDA降低43.71%(P0.05),猪瘟抗体水平提高14.06(P0.05)。肠道屏障方面,与正对照组相比,M1组可显著提高小肠绒毛高度,降低隐窝深度;与正、负对照组相比,M1组、M2组可显著提高盲肠乳酸杆菌数量,降低大肠杆菌数量。由此得出,枯草芽胞杆菌可显著提高断奶仔猪的生长性能,改善仔猪肠道环境及健康状况。     

补料对发酵工艺中枯草芽胞杆菌ZK8产伊枯草菌素A调控基因的影响

为研究补料对分批发酵工艺中枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）ZK8产伊枯草菌素A的影响,以“氮源+碳源+氨基酸”为补料,应用RT-qPCR技术并结合相关发酵参数分析了3个合成调控基因degQ、degUS、glnR及操纵子itu在发酵过程中的相对表达量差异。结果显示：补料-分批发酵工艺中总氮和还原糖的含量高于分批发酵工艺,生物量和效价分别提高了68.85%和36.67%;补料-分批发酵工艺中degQ、degUS和glnR 3个基因的相对表达量均高于分批发酵工艺,3个基因相对表达量的变化规律与伊枯草菌素A合成规律、操纵子itu的相对表达量变化规律一致。表明流加补料液促进了degQ、degUS和glnR的表达,为菌体提供了丰富的碳源、氮源和伊枯草菌素A的合成前体,促进了伊枯草菌素A的合成。     

苏云金芽胞杆菌SG3-7菌株的鉴定及杀虫活性研究

苏云金芽胞杆菌SG3-7菌株是一株从秦岭山区灌木丛土壤中分离得到的产不规则伴胞晶体的野生菌,本研究对该菌株的伴胞晶体形态、杀虫基因的类型以及杀虫活性等方面进行研究。分析结果表明:SG3-7菌株的内生质粒携带有3个cry基因(cry2Ab、cry4A、cry9Ea),以及1个cyt1Aa型基因。其主要产生130 kDa和60 kDa分子量大小的伴胞晶体蛋白,对鳞翅目的甜菜夜蛾和菜青虫幼虫具有显著的杀虫活性,其LC_(50)分别为29.31μg·mL~(-1)和47.11μg·mL~(-1),但对棉铃虫幼虫无杀虫活性。     

1株枯草芽胞杆菌的鉴定及其产脂肪酶特性

【目的】对1株产脂肪酶细菌MY016进行鉴定并对其产脂肪酶特性进行研究,为后期规模化发酵生产脂肪酶及其在畜牧业中的实际应用奠定基础。【方法】采用形态学观察、生理生化鉴定、16S rDNA测序分析,对实验室分离保存的1株产脂肪酶细菌MY016进行鉴定;通过菌落和芽胞计数、生长曲线测定,对MY016的生长特性进行分析;通过产脂肪酶量和酶活检测、脂肪酶基因扩增和系统进化分析,对MY016菌株的产脂肪酶特性进行探讨。【结果】产脂肪酶细菌MY016经形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA分析,被鉴定为枯草芽胞杆菌。MY016在培养2 h后进入对数生长期,生长迅速;培养10 h其菌液600 nm吸光度最高达到4.7,随后进入稳定期;12 h时活菌数约为5.3×10⁹ CFU/mL;培养22 h后开始二次生长,吸光度最高达5.2;培养46 h后进入衰退期。芽胞观察和计数结果显示,MY016菌株在接种16 h后开始形成芽胞,随着培养时间延长,芽胞形成率逐渐升高,直至72 h完全形成芽胞,芽胞数最高为1.9×10⁹ CFU/mL。产脂肪酶能力检测结果显示,MY016菌株在培养36 h时产酶量达到最大,为246.918 mg/L,然后总酶量逐步降低;48 h时总酶活达到最高,约为281.883 U/L。成功扩增了MY016菌株的脂肪酶基因,并构建系统进化树,结果显示MY016脂肪酶基因与其他芽胞杆菌的脂肪酶基因亲缘关系最近,表明其脂肪酶基因进化保守。【结论】产脂肪酶枯草芽胞杆菌MY016生长迅速、产酶量稳定,总酶活较高,适合后期规模化生产和在畜牧业中推广应用。     

添加枯草芽胞杆菌和营养物净化养殖污水的研究

利用室内试验,研究了加入营养物促进枯草芽胞杆菌净化养殖废水的方法。实验表明外源枯草芽胞杆菌比土著细菌对去除废水中溶解有机物和总氨氮有更强的能力,净化过程可以分为2个连续的阶段:溶解有机物的降解和总氨氮的去除。从起始日到第2d,细菌直接溶解有机物为碳源和氮源,48hCOD去除效率达(57.7±5.5)%,与对照组有显著性差异。在第2d到第5d,碳和磷相对于氮的不足限制了细菌增殖和去除总氨氮;葡萄糖和(或)磷酸盐的加入显著影响总氨氮去除效率,而加入复合维生素和(或)微量元素对其没有影响。同时加入葡萄糖和磷酸盐时,总氨氮去除效率大于85%,并形成悬浮的白色菌胶团。净化养殖废水时,水体中C∶N和N∶P质量比建议分别为5.4∶1和5￣7∶1。水中最高的细菌水平没有超过108CFU·mL-1,估计与细菌菌胶团的形成有关。     

枯草芽胞杆菌B13液体发酵培养条件的优化

枯草芽胞杆菌B13是一种良好的微生态制剂原材料,为了增加枯草芽胞杆菌B13的芽孢产量,研究采用单因素试验对接种量、培养时间、机械搅拌程度、装液量和消泡剂添加量等发酵条件进行了优化。结果表明,接种量0.5%,发酵液中添加4根玻璃棒和0.4%的豆油,装液量为容器的1/10,37℃下以200 r/min的转速振荡培养8~48 h,可获得较高浓度的菌体。     

枯草芽胞杆菌果糖基转移酶基因的克隆及其序列分析

利用自行设计的引物,在枯草芽孢杆菌基因组内获得果糖基转移酶基因,基因和相应蛋白序列分析发现.该基因共1 422个碱基,编码473个氨基酸,与GenBank注册的sacB基因序列有89%的相似性;全长序列有152突变碱基,共造成18个氨基酸的错义突变,但没引起酶保守活性位点的关键氨基酸突变.这结果为后期表达特异连接α1→2糖苷键的果糖基转移酶或者该基因的定点突变打下基础.