猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用特异性好的鼠源抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)单克隆抗体为捕获抗体,兔源多克隆抗体为检测抗体,建立PEDV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳反应条件为:抗PEDV单克隆抗体E1包被质量浓度4.40μg·mL~(-1),37℃包被2h,采用5%BSA封闭液封闭1h,兔抗PEDV抗体工作质量浓度为5.91μg·mL~(-1),酶标二抗稀释度为1∶2000,以OD450nm≥0.381作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应。敏感度可达30μg·mL~(-1)(5×103.12);重复性变异系数小于10%。采用该方法和RT-PCR方法同时检测临床样品42份,阳性样品符合率为92.30%,表明建立的PEDV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高和方便快捷等优点,可用于PEDV快速检测。     

高灵敏小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA检测方法的构建

目的为从天然化合物中高效筛选具有体液免疫抑制活性的先导化合物,本研究将构建高灵敏且价格低廉的小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA检测方法。方法利用山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体、生物素标记的山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2段抗体、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素构建小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA检测方法;通过对包被抗体浓度、检测抗体浓度和链霉亲和素浓度的优化,使检测方法灵敏度达到最高;再利用该检测方法检测体外培养小鼠B细胞上清中IgG浓度验证方法的有效性。结果在山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体浓度达到5μg·mL~(-1),生物素标记的山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2段抗体浓度达到0.25μg·mL~(-1),辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素浓度达到0.5μg·mL~(-1),小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA检测方法灵敏度达到最高(0.05ng·mL~(-1)),线性范围在0.1~10ng·mL~(-1);该检测方法可以高灵敏检测体外培养LPS刺激小鼠B细胞分泌的IgG抗体。结论本研究成功构建高灵敏且价格低廉的小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA检测方法。     

H3N2亚型犬流感病毒实验感染模型的建立

【目的】建立H3N2亚型犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)实验感染模型，了解犬流感的发病特征，为疫苗效力评价奠定基础。【方法】6—13月龄CIV血凝抑制(haemagglutination inhibition,HI)抗体阴性(HI<1:10)比格犬26只，其中3只鼻腔喷雾PBS作为阴性对照，另23只分5组(10、10³、10⁵、10⁶、10⁷ EID₅₀/只)，分别为3、5、5、5、5只/组，每只犬各鼻腔喷雾H3N2亚型CIV(A/canine/China/Huabei-170607/2017(H3N2)，简称HB株)病毒液1mL。观察临床症状、肺脏病变和肺脏组织病理学变化，计算肺实变率，检测病毒和HI抗体效价。【结果】10 EID₅₀剂量感染组，3只犬均未出现明显临床症状，肺脏均无明显眼观病变，肺脏实变率0%，无组织病理学变化，病毒检测均为阴性，HI抗体效价几何平均值(geometric mean titer,GM...     

抗苏云金芽孢杆菌Cry1B毒蛋白质单链抗体的筛选与鉴定

利用人源化噬菌体抗体库筛选抗Bt Cry1B毒蛋白质的单链抗体(Single-chain antibodies,scFv)。将扩增后的噬菌体抗体库与固相化包被的Cry1B毒蛋白质特异性结合,经4轮"吸附-洗脱-扩增"后,富集特异性识别Cry1B毒蛋白质的噬菌体单链抗体。从最后一轮筛选中随机挑取单菌落进行单克隆ELISA鉴定,对阳性克隆进行PCR扩增、DNA电泳鉴定及测序,成功筛选获得8个阳性噬菌体scFvs,经鉴定均有完整外源基因片段插入。挑取阳性值最高的scFv(1E2)建立了基于单链抗体的Cry1B毒蛋白质间接竞争ELISA检测方法。结果表明,Cry1B毒蛋白质对噬菌体scFv(1E2)的抑制中浓度(IC50)为1.075μg/ml,最低检测限(IC10)为0.013 4μg/ml,线性检测范围在0.5μg/ml至4.0μg/ml之间。     

人工合成禽流感M2e/HA0多肽的免疫原性分析

为了解流感病毒M2及HA保守肽段的免疫原性,参照流感病毒M2及HA的氨基酸序列分别设计合成多肽并免疫SPF鸡,设H5和H9亚型禽流感灭活疫苗及空白组作对照。对免疫后2、4、6和8周的血清进行HI和ELISA抗体、MDCK细胞的病毒血清法中和抗体效价和间接免疫荧光抗体检测,8周采血结束后用H9病毒进行攻毒检测。结果表明两种多肽疫苗均不产生HI抗体,针对各自多肽的ELISA抗体效价均显著高于H5/H9常规灭活疫苗对照组。M2e/HA0多肽苗免疫血清最高中和抗体效价为1∶16,远低于H9血清中和效价(1∶256)。间接免疫荧光检测结果显示多肽苗(M2e/HA0)组含荧光颗粒的MDCK细胞比例约20%左右,低于H5和H9灭活疫苗组含荧光颗粒细胞数(分别为50%和70%)。H9亚型禽流感病毒攻毒结果表明,两组多肽免疫后都可以有效抑制排毒,其中M2e免疫组抑制效果略好于HA0免疫组。以上结果提示M2e/HA0多肽具有较好的免疫原性,但其免疫原性弱于常规疫苗。     

比格犬三联高免血清制作与犬细小病毒抗体的检测

以犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)和犬传染性肝炎病毒(ICHV)的灭活强毒接种于7只基础免疫后的比格犬,接种10 d后检测犬体内血清的CPV抗体效价。对抗体效价大于或等于1∶1 280的犬,放血分离血清而得三联高免血清。试验结果为:把效价为1∶320的抗原用于试验的7只犬中,1~6号犬的血清效价均等于或大于1∶1 280,达到高免血清效价要求。而7号犬的血清效价为1∶640,小于1∶1 280,不符合试验要求。     

新型鸭呼肠孤病毒σB和σC蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)NP03株重组σB和σC蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立检测NDRV抗体的间接ELISA方法。优化后的最佳条件为:σB蛋白包被浓度为12.5μg·mL~(-1);σC蛋白包被浓度为6.25μg·mL~(-1);封闭液为15%FBS;血清稀释度为1∶80;酶标二抗稀释度为1∶400;底物37℃显色5min。该方法对MDRV、DHV、MPV和MD-GPV阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。该方法与NDRV全病毒间接ELISA相比较,符合率高达92.5%。本研究进一步丰富了NDRV抗体的检测方法。     

葡萄原花青素和花青素对丙烯酰胺致细胞损伤的保护作用

用丙烯酰胺诱导人结肠癌细胞HT-29和人神经母细胞瘤SH-SY5Y损伤建立细胞损伤模型,研究葡萄籽原花青素和花青素提取物对两种细胞的保护作用。结果表明:用100~700μg·mL~(-1)丙烯酰胺分别对HT-29和SH-SY5Y细胞孵育6和8h,两种细胞存活率分别下降至44.6%~80.5%和52.0%~81.0%,表明丙烯酰胺对细胞均有损伤作用。经葡萄籽提取物或葡萄皮提取物(5、10、20μg·mL~(-1))预先对HT-29细胞孵育1h后,再用300μg·mL~(-1)丙烯酰胺处理6h,HT-29细胞的存活率均显著高于丙烯酰胺损伤组(69.8%),其中10μg·mL~(-1)的葡萄籽提取物和葡萄皮提取物对HT-29细胞的保护作用最强,细胞存活率分别达到92.4%和93.8%。用葡萄皮提取物(5、10、20μg·mL~(-1))和葡萄籽提取物(5μg·mL~(-1))对SH-SY5Y细胞预先孵育1h,同样能够显著增加SH-SY5Y细胞的存活率。其中,葡萄皮提取物的保护作用较强,低、中、高浓度组的细胞存活率分别为80.7%、89.3%、91.5%。葡萄原花青素和花青素具有抑制细胞损伤的作用。     

间接竞争ELISA方法快速检测猪肉组织中的氯丙嗪

[目的]本研究旨在建立一种简单、快速检测猪肉中氯丙嗪(CPZ)残留量的方法。[方法]以CPZ-牛血清白蛋白(BSA)为包被抗原,自制鼠抗CPZ单克隆抗体,在此基础上建立可用于定量检测猪肉中CPZ含量的间接竞争酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),同时优化检测条件并对该方法进行评价。[结果]采用自行制备的特异性鼠抗CPZ单克隆抗体,建立间接竞争ELISA检测方法,优化得到最佳反应条件:抗原包被稀释倍数为1∶10 000,单克隆抗体浓度为1μg·mL~(-1),酶标二抗稀释倍数为1∶1 000,最低检测限为0.51 ng·mL~(-1),线性检测范围为1.37～111.11 ng·mL~(-1)。线性回归直线方程为y=-1.252 6x+2.853 2,相关系数(R~2)为0.986 6,总变异系数(CV)为6.97%,空白猪肉添加回收率为96.90%～118.79%。[结论]建立的间接竞争ELISA方法特异性强,灵敏度、精密度、准确度和重现性良好,可用于猪肉组织中CPZ残留的快速检测。     

粘红酵母RG-31产虾青素发酵条件优化

以粘红酵母RG-31为研究对象,通过单因素试验和正交试验对其合成虾青素的培养基和发酵条件进行初步的研究。试验结果表明:粘红酵母RG-31最适培养基为葡萄糖10 g·L~(-1)、牛肉膏3 g·L~(-1)、酵母粉5 g·L~(-1)、K_2HPO_4 1.5 g·L~(-1)、MgSO_4 0.5 g·L~(-1)、CaCl_2 0.2 g·L~(-1);最适培养条件为pH 6,培养温度28℃,转速240 r·min~(-1),培养时间60 h后,虾青素含量为7.41μg·mL~(-1),是优化前(2.84μg·mL~(-1))的2.61倍,生物量为20.5 g·L~(-1),是优化前(10.8 g·L~(-1))的1.90倍。     

不同疫苗接种对鸡免疫学功能的影响试验

为验证不同疫苗免疫对鸡免疫学功能的影响,采用两批市售的鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗注射14日龄鸡,同时按0.3 mL·只-1注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（细胞源,Re-6株+Re-8株）,并同时设单独注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（细胞源,Re-6株+Re-8株）组和健康对照组,每组鸡各10只,分别于疫苗注射后14、21和28 d,对各组鸡采血,分离血清,进行H5亚型禽流感HI抗体效价测定。结果表明：注射后14、21和28 d,第1组（新支流三联180010900批）组鸡血清中H5亚型禽流感HI抗体效价分别为1:68.6、1:207.9和1:415.6,第2组（新支流三联180020900批）组鸡血清中H5亚型禽流感HI抗体效价分别为1:68.6、1:207.9和1:445.7;第三组单独注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（细胞源,Re-6株+Re-8株）组鸡血清中H5亚型禽流感抗体效价分别为1:64.0、1:194.0和1:388.0,健康对照组鸡血清中H5亚型禽流感HI抗体效价均不高于1:24.3。说明接种2种疫苗试验鸡血清H5亚型...     

检测犬源狂犬病毒中和抗体ELISA方法的建立

为了有效监测犬免疫狂犬病疫苗后的保护效力,以狂犬病毒(Rabies virus,RV)糖蛋白的主要优势抗原表位区G3蛋白(RV G3)作为包被抗原,建立了一种检测狂犬病毒中和抗体效价的间接ELISA方法.通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量为8 mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶3 000.特异性试验表明,该抗原不与犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒阳性血清发生交叉反应;批内和批间重复性试验的平均变异系数都小于10%;敏感性达1∶1 280.此方法检测134份血清样品的结果与美国SYNBIOTICS试剂盒相比,总符合率达95.6%.     

重组Ⅸ蛋白检测犬传染性肝炎病毒抗体间接ELISA方法的建立

[目的]建立用重组蛋白Ⅸ检测犬传染性肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。[方法]分别设置不同抗原包被浓度、包被条件、封闭液等,比较ELISA反应效果。[结果]最佳抗原包被浓度为5.0μg/ml;最佳包被条件为,37℃包被1 h、4℃过夜;最佳封闭液为5%BSA;HRP-羊抗犬IgG的最佳工作浓度为1∶1 600。[结论]建立了检测犬传染性肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白竞争ELISA诊断方法的初步建立

利用表达的重组融合蛋白pGEX-6P-1-VP1作为抗原,用PET-32a-VP1蛋白免疫家兔获得的阳性血清作为FMDV阳性血清的竞争抗体,建立了检测FMDV抗体的竞争ELISA,并进行了条件优化,利用统计学方法计算竞争ELISA的阳性临界值。结果显示,重组蛋白抗原的最适包被质量浓度为1μg·mL~(-1),待检血清、酶标抗体和高免血清的最佳稀释度分别为1∶40、1∶2000和1∶500;与液相阻断ELISA试剂盒相比较,该方法的敏感性为91.3%,特异性为95.1%,符合率为96.7%。结果表明,该方法敏感性好、特异性强、重复性好,可用于O型FMDV血清抗体水平的检测。     

广谱性识别H7亚型禽流感病毒HA蛋白的单克隆抗体制备与鉴定

H7N9亚型禽流感病毒（AIV）的快速进化与变异使得其逃脱现有抗体的识别,为提供H7亚型AIV鉴别诊断所需重要材料,制备可识别H7亚型AIV HA蛋白的单克隆抗体（mAb）。采用差速离心法纯化的H7N9亚型AIV(A/Chicken/Guangdong/SW154/2015)免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,采用血凝抑制（HI）试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）和间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株。结果显示,获得5株稳定分泌抗H7N9 AIV HA蛋白mAb的杂交瘤细胞,腹水ELISA效价均为1∶1 000 000;其中,4株mAb的重链为IgG1,1株mAb的重链为IgG2b,轻链均为κ链。特异性测定结果显示,5株mAb仅与H7亚型AIV反应,不与其他亚型流感病毒发生反应;广谱性测定结果显示,5株mAb均可与不同年份分离出的H7亚型AIV发生反应;HI结果显示,腹水针对H7-Re3抗原株的HI效价为7 log2～12 log2;MDCK细胞微量中和试验结果显示,5株mAb均具有中和活性;Dot blot检测结果显示,5株mAb均可识别H7-Re2抗...     

辛伐他汀片在比格犬体内的药代动力学研究

目的:测定辛伐他汀片在比格犬体内的药代动力学参数,为辛伐他汀片更好地用于临床提供参考。方法:选择3只健康雄性比格犬作为实验动物,根据比格犬与人的等效剂量比值来确定辛伐他汀的给药剂量,口服给药后,用HPLC-MS/MS联用法测定血浆中药物浓度,用WinNonlin V5.2.1软件计算药物动力学参数。结果:辛伐他汀片在3只比格犬体内的主要药动学参数:Cmax分别为5.1 ng·mL~(-1),3.51 ng·mL~(-1),15 ng·mL~(-1);Tmax分别为2 h,2 h,2 h;AUClast分别为29.7961 h·ng·mL~(-1),10.8589 h·ng·mL~(-1),75.5348 h·ng·mL~(-1);T_(1/2)分别为6.361 h,7.0411 h,5.246 7 h。结论:辛伐他汀在3只比格犬体内的药动学参数差异较为明显,与文献报道数据一致,提示临床要注意个体化给药。     

广金钱草多酚的提取工艺及其抗氧化能力的研究

为研究广金钱草多酚的提取条件及其抗氧化能力,通过单因素试验和正交试验研究提取溶剂、乙醇体积分数、料液比、时间、温度、提取次数对广金钱草多酚提取的影响。结果表明,最佳提取条件为:40%乙醇,料液比(g·mL~(-1))1∶40,在40℃浸提40min,多酚得率为(5.20±0.11) mg·g~(-1)。广金钱草多酚对DPPH·自由基、超氧阴离子自由基及亚硝酸根离子的半抑制浓度IC50分别为(1.94±0.02),(40.48±0.48),(134.0±7.6)μg·mL~(-1),Vc对DPPH·自由基、超氧阴离子自由基及亚硝酸根离子的半抑制浓度IC50分别为(6.17±0.03),(136.0±1.9),(188.6±7.3)μg·mL~(-1),表明广金钱草多酚抗氧化能力强于Vc。     

抗O型口蹄疫病毒猪源单链抗体的筛选

为获得抗O型口蹄疫病毒(FMDV)高亲和力猪源单链抗体(scFv),建立抗原抗体(Ag-Ab)共表达细菌展示文库,抗原为FMDV结构蛋白VP1、抗体为高免猪抗体文库。采用细菌展示与流式细胞术结合方法,筛选出14株抗FMDV的scFv。将筛选获得scFv构建至pET28a载体中,经E. coli Rosetta表达,目的蛋白长度约为30ku,与scFv分子质量相符。Western blot结果表明,14株scFv均可与VP1特异性结合。ELISA结果表明,14株scFv均可与灭活O型FMDV特异性结合。应用共表达细菌展示技术,可避免抗原制备,简化操作流程,适用范围广泛;应用流式细胞仪筛选抗体库,可实现准确、快速、高通量筛选。抗FMDV猪源scFv研究可填补同源基因工程抗体空白,为进一步筛选中和抗体奠定基础。     

羊骨胶原肽对去卵巢大鼠的骨质改善作用

[目的]探讨羊骨胶原肽(collagen peptide,CP)对去卵巢大鼠的骨质改善作用,为畜骨的高值利用和骨质疏松非药物防治的研发提供试验依据。[方法]切除大鼠双侧卵巢,设置切卵巢组(OVX)、雌激素组(E_2)、羊骨胶原肽的高、中、低剂量组(CP-H、CP-M、CP-L),另设假手术组(SHAM)。各组8只,饲喂基础日粮,CP各剂量组灌胃相应受试物,SHAM组和OVX组灌胃等体积蒸馏水,E_2组注射雌激素。灌胃9 w后处死大鼠,取股骨进行骨密度、骨矿物质、羟脯氨酸含量测定,并测定血清PINP及β-CTx水平。[结果]OVX组骨密度((1.767±0.031) g·cm~(-3))、骨矿物质(Ca、Mg、Zn、Mn)((9.73±0.14) mg·g~(-1),(0.34±0.01) mg·g~(-1),(30.48±1.48)μg·g~(-1),(1.70±0.24)μg·g~(-1))以及羟脯氨酸含量((1.922±0.12)μg·mg~(-1))均显著低于SHAM组((2.283±0.47) g·cm~(-3),(12.59±2.78) mg·g~(-1),(0.49±0.10) mg·g~(-1),(33.78±0.43)μg·g~(-1),(1.94±0.29)μg·g~(-1),(2.258±0.22)μg·mg~(-1)),血液PINP((3 528.37±154.74) pg·mL~(-1))和β-CTx((529.67±23.63) pg·mL~(-1))水平显著高于SHAM组((2.283±0.47) g·cm~(-3),(2 258.55±140.87) pg·mL~(-1),(370.98±61.89) pg·mL~(-1)),说明骨质疏松模型建模成功,CP各剂量组和E_2组骨密度、所测骨矿物质含量、羟脯氨酸含量均显著高于OVX组,血清PINP及β-CTx水平显著低于OVX组(P0.05)。[结论]羊骨胶原肽可提高去卵巢大鼠股骨密度,抑制骨矿物质和骨有机质的丢失,降低血清骨代谢标志物水平,从而具有骨质改善作用。     

抗甲胺磷单链抗体基因的酵母表达及性质鉴定

为了构建高效表达阳性抗甲胺磷单链抗体(scFv)基因的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris系统,设计引物扩增阳性克隆scFv基因,亚克隆至表达载体pPICZαC,构建重组酵母表达质粒pPICZαC-scFv,线性化pPICZαC-scFv并高效电转P.pastoris(X-33),抗性梯度筛选转化子以获得高效表达菌株,对获得的菌株先后进行表达条件的优化、优化条件下的诱导表达及单链抗体性质研究。结果:获得了稳定高效表达菌株X-33-Pp-Met-28D4-1,该菌株优化条件下的scFv诱导表达量为25 mg/L,纯化产物对甲胺磷的抑制中浓度IC50为93.52μg/mL,抗原抗体亲合常数为2.34×10-8mol/L。因此利用Pichia pastoris表达系统可大量制备功能性抗甲胺磷单链抗体。