精子介导转基因技术研究进展

精子因在授精中的独特作用而被认为是携带外源DNA的理想载体。以精子作为载体制备转基因动物技术以其操作简单、成本低廉、便于大量筛选等优点受到人们的高度重视。文章主要介绍了精子介导基因转移制备转基因动物的基本原理、发展过程、最新研究进展及目前存在的问题。     

转基因动物技术及其应用

本文从原核显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法和体细胞核移植法等5个方面简要介绍了建立转基因动物的方法及应用.     

转基因动物技术及其应用

本文从原核显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法和体细胞核移植法等5个方面简要介绍了建立转基因动物的方法及应用。     

PyTPS 转化花生对其后代耐盐性和品质性状的影响

为了研究条斑紫菜TPS基因（ PyTPS）对花生种子耐盐性和品质性状的影响,利用花粉管通道法,将携带条斑紫菜PyTPS基因的pCAMBIA2300-PyTPS重组载体导入花生,获得了T0转基因植株。利用PCR对T0植株进行了检测,PCR阳性率为34．7％。将部分转基因植株的T2种子进行耐盐试验,利用半定量RT-PCR分析了PyTPS基因在转基因植株中的表达情况,并用近红外技术测定了T2种子的品质性状。结果表明,部分转基因花生种子在盐溶液中的发芽率显著提高,PyTPS基因可在有些转基因植株中表达,有的转基因植株的蛋白质、油酸、亚油酸或脂肪含量发生了明显变化。总之,条斑紫菜PyTPS基因导入花生后,既可提高转基因花生种子的耐盐性,又对部分后代种子的品质性状产生影响。     

根癌农杆菌介导伪狂犬病毒gD基因转化玉米的研究

将克隆的猪伪狂犬病毒保护性抗原基因gD插入质粒pBA002,构建了植物表达载体pBA-gD.利用根癌农杆菌LBA4404介导,将该基因导入甜玉米自交系1132,转化获得84株转基因系.经过点杂交、Southern杂交分析,有23个转基因株系基因组检测到gD基因稳定整合.Northern杂交显示有5个转基因株系的目标基因正确表达.     

花生AhPLDα基因植物过表达载体构建及对拟南芥的遗传转化

为了明确花生AhPLDα基因在响应干旱胁迫信号传导中的功能和作用机制,以ABA处理的冀花4号花生叶片c DNA为模板,用RT-PCR方法扩增AhPLDα1和AhPLDα2的全长CDS片段,采用酶切-连接的方法分别将这2个基因定向克隆到植物表达载体p Bar-F3上,冻融法将重组子转入根癌农杆菌GV3101,利用改良Floral-dip法将过表达质粒转入拟南芥。菌落PCR和酶切结果表明,Ca MV35S启动子驱动的过表达载体重组质粒p Bar-AhPLDα构建正确。通过RT-PCR和qRT-PCR验证,表明AhPLDα1和AhPLDα2基因整合到拟南芥基因组中并能过量表达,获得了阳性转基因纯合株系。干旱胁迫试验表明,转基因植株的耐旱性较野生型明显增强。可见,AhPLDα基因参与了干旱胁迫应答过程,是转基因途径提高作物耐旱性的潜在候选基因。     

3种长江珍稀鱼类精子超低温冷冻保存的初步研究

试验对西伯利亚鲟、美洲鲥鱼和暗纹东方鲀3种长江珍稀鱼类的精液进行超低温冷冻保存技术研究。以解冻后精子的活力为参数,探讨了稀释液、不同种类不同体积分数的保护剂、以及不同的精液稀释比例对实验鱼类精液进行超低温冷冻保存的保护效果。结果显示,3种长江珍稀鱼类以配方2和体积分数为10%甲醇组成抗冻保护剂,西伯利亚鲟精液按1:2稀释倍数,保存10天后检查精子活力,存活率可达(45±5.00)%。暗纹东方鲀精液按1:2稀释倍数,保存20天后检查精子活力,存活率可达(60.5±2.69)%。美洲鲥鱼精液按1:3稀释倍数,保存60天后检查精子活力,存活率可达(80.3±2.58)%。3种珍稀鱼类的精子保存以美洲鲥鱼效果最好。保存方法均采用三步法,在液氮面上方6 cm处平衡10 min,接着在液氮面上平衡5 min,最后投入液氮中冷冻保存。研究结果为保护长江珍稀鱼类的种质资源提供了理论基础。     

pGH和IGF-Ⅰ双基因共表达载体的构建及转双基因猪的获得与检测

旨在构建可高效表达pGH基因和IGF-Ⅰ基因的双基因共表达载体,制备转双基因(pGH+IGF-Ⅰ)猪,以期探索pGH基因和IGF-Ⅰ基因对猪生长发育的影响,为节粮型高瘦肉率新品种猪的培育奠定理论基础。从长白猪耳样中提取总RNA,经反转录RT-PCR获得pGH基因不含终止密码子的编码序列和IGF-Ⅰ基因完整的编码序列,经酶切连接克隆至pc DNA3.1(+)真核表达载体上,构建pc DNA3.1(+)-pGH-IGF-Ⅰ双基因共表达载体。将其转染PK15细胞,Q-PCR检测2个目的基因在PK15细胞中的表达情况。将构建的双基因共表达载体用纳米材料包裹后转染长白猪精子,采用精子载体法制备转双基因猪。PCR及测序鉴定转双基因阳性个体,Q-PCR检测2个目的基因在转双基因猪体内的表达情况。PCR及测序鉴定追踪检测转双基因猪体内pGH基因和IGF-Ⅰ基因的稳定情况。RT-PCR及测序结果表明,成功克隆了长白猪的pGH基因和IGF-Ⅰ基因的编码序列。酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达载体,转染PK15细胞后,Q-PCR检测表明,pGH基因和IGF-Ⅰ基因均在mRNA水平成功表达。母猪妊娠获得13头仔猪,经PCR及测序检测,其中4头仔猪为转双基因阳性,转双基因阳性率为30.76%。Q-PCR检测外源pGH基因与IGF-Ⅰ基因在转双基因猪体内成功表达。1~7月龄均可检测到外源pGH基因与IGF-Ⅰ基因,证明2个外源基因在转双基因猪体内稳定存在,并未随着生长而丢失。在转双基因公猪的精液中均能检测到2个外源基因,证明外源基因存在稳定传代的可能。     

动物转基因技术在转基因牛中的研究进展

本研究综述了目前应用于转基因牛中原核显微注射法、体细胞克隆法、病毒载体法等传统动物转基因技术以及具有应用前景的ZFN技术、TALEN技术和iPS技术等。概述了20年来国内外转基因牛重要的研究进展,并就目前转基因牛在乳腺生物反应器、抗病育种、品种改良主要3个方面的应用进行了介绍。在此基础上,就目前转基因牛育种中存在的问题及今后发展趋势进行了讨论,以促进转基因牛研究的发展。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在转基因玉米中的表达

本研究拟构建携带猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白基因(TGEV-S)的转基因玉米植株并检测其表达情况。首先利用PCR方法自携带TGEV-S基因的重组质粒中扩增2.2kb的S基因片段,然后插入植物表达载体pBAC176中,该表达载体以编码除草剂草甘膦抗性的EPSP基因作为选择标记,目的基因以双增强子的CaMV35S(E35S)及其玉米Hsp70第一内含子为驱动。以授粉后10～12d约0.5～1mm大小的玉米幼胚为受体,用基因枪进行转化,经过愈伤组织诱导、草甘膦抗性筛选和分化再生培养,先后获得74株转化再生植株。利用PCR和Southern blot检测表明,T0代转基因苗有9株检测结果为阳性。T1代转基因玉米株系经PCR检测有14个转基因株系为阳性,初步确定了目的基因在这些转基因玉米中的稳定整合。进而通过间接ELISA分析初步确定目的基因在7个T1代转基因玉米株系获得了表达。研究结果为进一步研究表达TGEV-S转基因玉米的生物学活性奠定了基础。     

转基因鸡及输卵管生物反应器

随着生物制药业的迅速发展,转基因鸡输卵管生物反应器正逐渐成为人们关注的焦点,转基因鸡以其卓越的优势必将成为科学研究的热点和生物制药领域的新兴产业之一。目前,转基因鸡最成功的制备方法即逆转录病毒介导法,并已成功制备出表达标记基因的转基因鸡。本文主要综述了鸡作为生物反应器的优势、转基因鸡发展历程、逆转录病毒载体制备转基因鸡的方法过程和转基因鸡的研究进展,同时也讨论了转基因鸡的意义和可能存在问题。     

粮食主产区生猪产业发展与粮食安全竞协机理研究——基于黑龙江省实证分析

基于生猪产业与粮食安全的相互依存关系,旨在判断两者的协调发展程度,寻找促进两者协调共生的途径。本研究采用协调度计算方法,构建了生猪产业与粮食安全协调度指标体系,对生猪产业与粮食安全之间的耦合协调关系进行了定量分析。研究根据CCDPIFS的取值将生猪产业分为4种模式并以黑龙江省为例进行了实证检验,结果表明黑龙江省生猪产业处于基本协调模式,通过协调度指标可以有效的描述生猪产业和粮食安全的竞协状态,并可以此为依据调整生产实践。本研究得出结论,可以从保持粮食产量、开发“非粮”饲料、提高饲料利用率以及养殖模式选择等方面促进生猪产业与粮食产业的协调共生。     

质体转化开创作物杂种优势利用新途径

普通核雄性不育性能够满足对理想不育系选育的要求，是水稻等作物杂种优势利用的理想遗传元件。只要能解决其不育系繁殖问题，是理想的杂种优势利用方式。通过普通核雄性不育性的可育基因质体转化，将可育基因转移到存在于细胞质中的质体基因组中，可创造普通核雄性不育系的保持系，繁殖出普通核雄性不育系，从而实现三系法利用杂种优势；利用可产生雄性不育性的基因如TA29-barnase通过质体转化，向质体基因组中转移，产生由细胞质中转基因雄性不育基因控制的雄性不育系，任何常规品种都能作为其保持系，转barstar可育基因系(或常规品种)作为恢复系(或父本)，可同样实现三系法利用杂种优势。上述两种途径都是创造植物杂种优势利用的新途径。     

逆转录病毒法制备转基因鸡的方法分析

随着生物制药业的迅速发展,转基因鸡已逐渐成为生物领域研究的热点之一。为建立和优化逆转录病毒法制备转基因鸡技术平台,以pHIT-Myc3为载体,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为标记基因,采用共转染法包装泛嗜性VSV-G假逆转录病毒,浓缩后分别体外侵染鸡胚胎成肌细胞和体内胚盘下腔接种新生种蛋并孵化出雏。分别抽提成肌细胞、孵化5d的全胚和新生雏鸡不同脏器的基因组DNA进行PCR鉴定分析,结果分别在细胞和5d全胚胎及新生雏鸡的胸腺和皮肤中检测到了标记基因EGFP的存在,表明逆转录病毒法成功制备出转基因鸡,同时转基因鸡技术平台中的方法技术条件也得到了有效优化,为转基因鸡的进一步研究提供参考     

转基因大豆发展现状与中国的对策

综述对世界大豆主产国转基因大豆的发展历程进行了回顾,就转基因大豆对于人类、动植物及环境安全可能存在的现实和潜在的影响进行了叙述并对中国大豆产业的未来进行了展望;认为,目前应实行两条腿走路的方针,一方面充分利用中国非转基因大豆这一优势,积极开拓国际市场,亦注重进口非转基因大豆,使中国成为世界非转基因大豆的生产、加工和出口中心;同时加强对大豆生物技术研发的投入力度,早日创造出知识产权属于中国自己的、安全和环保的转基因大豆品种,为中国大豆产业实现新的腾飞提供技术储备。     

Production of Drought and Salt Tolerant Transgenic Cereal Plants

Genetic transformation of cereal plants is a powerful method for producing agronomically useful transgenic plants. Salt and drought stress result in substantial yield losses, which amounts to many billions of dollars each     

根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立

为建立根癌农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系,以花药愈伤组织为受体,研究了农杆菌菌株、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等因素对遗传转化效率的影响。结果表明,农杆菌菌株、共培养温度和共培养时间对转化效率具有显著影响,AS不影响转化效率。2.2万个花药愈伤组织经EHA105菌株侵染后,转入未添加AS的培养基,22℃共培养6d,通过50mgL-1卡那霉素抗性筛选、叶片GUS染色、uidA和NptII基因PCR特异扩增、PCR产物测序及NptII基因Southern检测,鉴定出11株转基因植株,并通过嫁接和次生体胚发生,获得来自8个转基因株系的681株转基因植株,移栽成活253株。     

Production and field performance of transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) expressing alpha-amylase and manganese-dependent lignin peroxidase

Summary Transgenic alfalfa plants expressinBacillus licheniformis alpha-amylase and mangaese-dependent lignin peroxidase (Mn-P) from Phanerochaete chrysosporium were produced using the Agrobacterium tumefaciens transformation system. In each case, there was a range of expression of the introduced gene among independent transgenic plants. Plants producing alpha-amylase showed no alteration of phenotype. Production of Mn-P in alfalfa, howeven, in most cases adversely affected plant growth and development. Affected plants were stunted with yellowing foliage, but survived and produced seed. Results from field trials showed that Mn-P production in transgenic alfalfa reduced dry matter yield and plant height. The extent of these symptoms and yield reduction was, for the most part, related to the level of foreign protein production as estimated by Western analysis. Field data from transgenic plants expressing alpha-amylase showed that there was no effect of foreign protein production on plant performance. Expression of Mn-P was shown to segregate in sexual progeny derived from transgenic plants.Abbreviations Mn-P manganese-dependent lignin peroxidase     

双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的研究

摘 要：通过PCR扩增哺乳动物雄性决定基因SRY来鉴定胚胎的性别在畜牧业生产上已经得到广泛应用,优化技术路线,缩短鉴定时间对后期实验的成功有非常重要的意义。本实验根据猪的SRY基因和GAPDH（内标）基因序列,分别设计并合成两对引物,通过双温PCR反应实现对猪早期胚胎性别的快速鉴定,结果表明：母猪只能扩增出 404bp 的GAPDH基因片段,而公猪能同时扩增出309 bp 的 SRY基因片段和 404 bp 的GAPDH基因片段。阳性率为100 %,鉴定时间较常规时间缩短2个小时。表明该检测方法快速、准确。本方法为在转基因克隆动物研究中快速鉴定胎儿成纤维细胞系的性别提供了可靠的技术保证。