蛋白翻译元件IRES：病毒复制和毒力研究的新宠儿

正真核生物的蛋白翻译,依赖于m RNA 5'端的帽子结构。而口蹄疫病毒(FMDV)、脊髓灰质炎病毒、人丙型肝炎病毒等一些RNA病毒,其蛋白的翻译是通过病毒自身的内部核糖体进入位点(Internal ribosomal entry site, IRES)以非帽依赖性方式完成的,即IRES借助宿主细胞的翻译起始因子和反式作用因子招募40S和60S核糖体形成翻译起始复合     

5'UTR在基因表达调控中的研究进展

5'非翻译区(5'Untranslated Region,5'UTR)在基因表达调控中发挥重要作用,其不仅在翻译水平调控基因表达,还参与真核基因转录、转录后加工、成熟RNA运输等水平的调控。5'UTR介导的基因表达与自身存在的相关调控元件有关,主要包括内部核糖体进入位点、5'UTR二级结构、上游开放阅读框、上游起始密码子以及5'UTR内含子等元件,5'UTR异常可引起基因表达异常并引发疾病。本文综述了5'UTR调控基因表达的研究进展,以期为今后5'UTR的作用机制及相关疾病的诊断与治疗提供新的方向和理论依据。     

RNA结合蛋白核仁素：病毒IRES依赖性翻译起始的重要推手

正内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site, IRES)元件是具有多个类似茎环和假结节结构的复杂RNA片段,其通过多重RNA-RNA和/或RNA-蛋白相互作用,为核糖体的着陆提供平台,以起始转录本的翻译过程。当真核细胞处于饥饿、缺氧和病毒感染等应激条件下,其主导的翻译机制将由帽子依赖性翻译向IRES依赖性翻译转换。经过长期进化,小RNA病毒科和黄病毒科成员,均选择利用其基因组中的IRES元件劫持宿主的翻译系统,     

核糖体内部进入位点介导的翻译起始机制研究进展

真核生物mRNA翻译起始是依赖于帽状结构的。但是一些病毒的自身蛋白合成的起始依赖非帽状结构,这一特点有利于病毒摆脱宿主细胞翻译起始机制对其在细胞内复制的限制。它们利用一种末端为核糖体内部进入位点(IRES)的结构RNA来招募40S和60S核糖亚基组装成不同于帽状结构介导的成熟的核糖体来进行相关病毒蛋白的翻译。IRES元件由一些可以招募翻译因子并作用于mRNA末端的顺式作用元件构成。IRES早在20年前已被发现,但是仅在近几年研究者利用Ⅲ型和Ⅳ型IRES的模型对其进行了相关研究,使人们了解了RNA的二级结构如何控制并操纵核糖体对翻译的起始。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒5'非编码区前导转录调控序列及其侧翼序列的结构与功能解析

为解析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)5'非翻译区(5'UTR)的高级结构与功能,以北美株PRRSV感染性克隆为平台,通过定点突变PCR技术将其5'UTR中一特殊高级调控元件的一级序列进行突变,以改变其二级茎环结构,从而解析该结构的基因调控水平。将突变DNA克隆转染入BHK-21细胞后利用免疫荧光及RT-PCR试验来研究拯救后突变病毒的转录、翻译特性,及通过空斑形态学及病毒生长曲线分析突变病毒的生长特性。结果表明,PRRSV 5'UTR中该高级调控元件的顶端环结构为病毒复制所必需,其只可耐受2个核苷酸的突变;同时发现该调控元件中一保守的茎结构为病毒复制非必需。由此证实了PRRSV 5'UTR中调控病毒复制过程的必需高级结构,为进一步解析PRRSV复制调控元件奠定基础。     

内部核糖体进入位点介导核糖体翻译起始机制

部分正链RNA病毒基因的蛋白质合成是由其自身的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site,IRES)以非依赖5’甲基化帽状结构来实现的。目前,IRES被分为4类,虽然这4类IRES在对其介导的基因合成目的蛋白的机制不同,但是这些不同蛋白翻译机制是依赖IRES与不同真核翻译起始因子相互作用形成特定的复合物来实现的。真核生物翻译是由起始tRNA(Met-tRNAMeti)/eIF2·GTP三元复合物引发,与翻译因子和40S小亚基结合形成43S复合物,43S复合物在eIF1A协助下与起始密码子结合形成48S复合物,在eIF5·GTP促进下60S亚基与40S亚基结合形成80S核糖体。IRES介导翻译通过eIF4G、IRES与eIF4A结合引导43S复合物与IRES结合。Ⅲ型IRES在无eIF3的参与下与40S小亚基的E位点结合并与eIF2·GTP/initiator tRNA形成48S亚基,在eIF5/eIF5B的调控下与60S亚基形成活化的核糖体进行蛋白质翻译。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒5'非翻译区-茎环结构的功能解析

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北美株感染性克隆为平台进行反向遗传操作,利用突变PCR将5'非翻译区(5'UTR)中部分一级序列进行系列突变,以改变5'UTR二级结构中的一保守茎部结构,从而解析PRRSV 5'UTR中结构与功能的关系.通过DNA转染MARC-145细胞观察突变体克隆的感染性,并通过免疫荧光及Northern blot来研究拯救后突变病毒的复制、转录特性,以及通过空斑形态学分析突变病毒的生长特性.结果表明,PRRSV 5'UTR中保守茎部结构的二级结构与病毒的拯救无直接关系,但其一级核苷酸序列却是PRRSV病毒复制所必需的,作者还找到直接调控病毒复制的核心位点.由此证实了5'UTR中调控PRRSV复制过程的必需序列,为进一步解析PRRSV复制过程的调控元件奠定了基础.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组序列,设计一对特异性引物。通过RT-PCR的方法扩增DHV-Ⅰ(A66株)VP3基因并将其5′端起始处稀有密码子同义突变。用限制性内切酶BamHⅠ/SalⅠ消化VP3基因片段和表达载体pGEX-6p-1后构建重组表达质粒pGEX-VP3,转化E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析表明,VP3基因在大肠埃希菌中大量表达,表达产物的分子质量约为52 ku。Western blot检测表明,表达产物能与DHV-Ⅰ阳性血清发生反应,具有反应原性。     

口蹄疫病毒基因组结构及其功能

口蹄疫病毒的基因组结构和功能是开展口蹄疫其他研究如鉴别诊断、新型疫苗研制和疫源追踪等工作的基础。口蹄疫病毒的基因组由5′UTR、ORF和3′UTR及Po ly(A)组成,全长约8 500 nt。VPg可能充当RNA合成引物的作用, 5′UTR 内的Poly(C)和内部核糖体进入位点(internalribosomaentrysite, IRES)是当前研究的热点之一。Poly(C)可能与病毒的感染性有关,IRES 对翻译的起始有重要作用。一般认为Poly(A)越长,病毒的感染性越强。病毒的ORF包括P1、P2、P3基因。L、P2、P3研究的相对较少,其中3A与病毒的宿主嗜性有关,3D为RNA聚合酶,可作为免疫和自然感染动物的鉴别诊断抗原。P1 为口蹄疫病毒的抗原结构,是研究口蹄疫免疫机制和新型疫苗的基础。VP1 可以作为分子流行病学调查,被很多国家所采用。     

脑心肌炎病毒IRES置换不影响口蹄疫病毒的复制和毒力

内部核糖体进入位点(IRES)是微RNA病毒起始蛋白合成的关键元件。为研究IRES元件在病毒致病过程中的作用,本研究以口蹄疫病毒(FMDV)为模型,在已建立的O型FMDV c DNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法以脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES替换FMDV的IRES,构建并拯救出含有EMCV IRES的嵌合病毒(r FMDV-EIRES)。一步生长曲线结果显示r FMDV-EIRES无论是在鼠源BHK-21细胞还是在猪源IBRS-2细胞中的复制能力均与亲本病毒相近。另外,r FMDV-EIRES对乳鼠的致病力与亲本病毒也相同。以上研究结果表明,虽然EMCV IRES与FMDV IRES一级序列存在显著差异,但二者的置换并不影响FMDV的复制和毒力,该结果有助于加深IRES在微RNA病毒复制和致病性功能的认识。     

家蚕传染性软化病病毒(桐乡株)5′端非编码区基因的克隆及序列分析

为了探讨家蚕传染性软化病病毒的复制与翻译机制,利用cDNA 5′末端快速扩增(5′-RACE)技术获得了家蚕传染性软化病病毒桐乡分离株(Bombyxmoriinfectious flacherie virus,BmIFV-2)的5′端非编码区(non-coding region,NCR)。序列比较分析发现:BmIFV-2的5′-NCR由155个核苷酸组成,A+U含量达60.64%,其中包含1个起始密码子AUG;与坂城分离株(BmIFV-1)的5′-NCR相比,BmIFV-2的5′-NCR在5′末端缺少1个核苷酸,但核苷酸识别率为100%(即单核苷酸变异率为0),而且这个缺少的核苷酸并不影响其5′-NCR的二级结构。与已经证实具有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)活性的Iflavirus属的2种病毒EoPV(Ectropis obliquapicor-na-like virus)和VDV-1(Varroa destructorvirus 1)的5′-NCR相比,BmIFV的5′-NCR可能也具有IRES活性。     

一种新的微RNA病毒翻译调节因子的发现及其作用机制

正在微RNA病毒内部核糖体进入位点(Internal ribosomal entry site, IRES)介导翻译的研究中发现,口蹄疫病毒(FMDV)IRES的结构域3和4决定病毒的细胞嗜性(孙超和杨德成等,JGV2014)、结构域4决定病毒的毒力(于力等,中国发明专利ZL 20171 1093774.3和PCT专利WO/2018/090994)。进而对IRES结构域4的二级结构与功能进行更加精细的研究,发现其C351G突变引起细胞PTB蛋白的结合力呈温度依赖性下降、使IRES发生温度依赖性翻译缺陷、由此导致FMDV温度敏感减毒株的产生(杨德成和孙超等,JVI 2020,doi:10.1128/JVI.00990-20)。真     

口蹄疫病毒IRES RNA元件与宿主蛋白eEF1a相互作用抑制病毒复制的研究

口蹄疫病毒(FMDV)内部核糖体进入位点(IRES)是该病毒复制的一种重要RNA元件,介导病毒蛋白的翻译起始,其过程需要多种宿主细胞因子的参与。为筛选与IRES相互作用的宿主蛋白,本研究以生物素标记的FMDV IRES RNA为"诱饵",通过RNA pulldown试验结合质谱分析筛选得到4种有可能与IRES存在相互作用的宿主蛋白,包括eEF1a、RPS3、DDX5和DDX3X。对筛选获得的宿主蛋白评分分析后,针对丰度高的宿主蛋白eEF1a进行IRES RNA pulldown分析以及western blot检测,结果显示eEF1a蛋白与FMDV IRES存在相互作用。激光共聚焦显微镜观察显示,FMDV感染宿主细胞后eEF1a蛋白从细胞核转移至细胞质中,并与FMDV基因组RNA在细胞质中共定位。此外,western blot检测显示,瞬时过表达eEF1a蛋白显著抑制FMDV在BHK-21细胞中的复制。本研究首次证实了宿主蛋白eEF1a能够与FMDV IRES RNA元件特异性结合,并抑制FMDV的复制,为深入了解IRES介导的翻译起始机制以及FMDV在宿主体内复制的分子调控机制奠定了基础。     

鸭肝炎病毒GD株的全基因组序列测定与分析

为了给在分子水平上研究鸭肝炎病毒(DHV)的致病机理奠定基础,进一步丰富DHV的遗传变异和进化信息,试验采用RT-PCR方法分段克隆获得DHV-1 GD株的全基因组序列并进行序列分析。结果表明:GD株的基因组全长7 690 nt[不含Poly(A)尾],5’端和3’端非编码区长度分别为626 nt和314 nt,单一开放阅读框架(ORF)为627～7 376 nt,编码2 249个氨基酸;GD株与DHV-1参考株比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.8%～99.7%和97.7%～99.6%;与中国台湾和韩国新型DHV(DHV-N)相比同源性分别为72.7%～73.2%和81.8%～83.4%;GD株与DHV-1参考株遗传进化关系较密切,处于同一分支,而与DHV-N遗传关系较远,处于不同分支。     

猪瘟病毒N~(pro)蛋白及细胞内环境改变对其IRES活性的影响

位于猪瘟病毒(CSFV)基因组5'端非翻译区(UTR)的内部核糖体进入位点(IRES)在调控CSFV基因组的翻译中发挥重要的作用,为探索CSFV自身蛋白以及细胞内环境改变对IRES活性的影响,本研究构建了包含CSFV IRES在内的荧光素酶报告基因质粒,采用编码CSFV非结构蛋白N~(pro)和NS5A蛋白表达重组质粒转染细胞,或通过葡萄糖剥夺、氨基酸剥夺、氧化应激、血清饥饿等条件分别处理细胞,结果显示N~(pro)蛋白比之前报道的NS5A蛋白具有更显著的IRES抑制效果,并且抑制程度呈浓度依赖性;氨基酸剥夺、氧化应激及血清饥饿时可以显著降低CSFV IRES的活性,而葡萄糖剥夺对其活性无显著影响。本研究明确了CSFV非结构蛋白N~(pro)以及细胞内环境的改变可以调控IRES的活性,为进一步阐明CSFV复制增殖的分子机制提供新的实验依据。     

一株Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因组序列分析

为了研究Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)遗传变异情况,试验采用全基因组序列测定的方法对广东省佛山地区分离到的1株Ⅰ型鸭肝炎病毒进行分析研究。结果表明:不含poly(A)尾的DHV-Ⅰ基因组全长7 690 bp,只含有1个开放阅读框(ORF),编码2 249个氨基酸;将此病毒株与GenBank公布的其他DHV全基因序列进行序列分析,VP1蛋白变异最大,180～220位为高变区,与DHV-Ⅰ参考毒株核苷酸序列同源性在94.0%～97.4%之间,氨基酸序列同源性在97.5%～99.2%之间;对此病毒株进行遗传进化分析,与DHV-Ⅰ参考毒株处于同一分支,与韩国和中国台湾省新型鸭肝炎病毒处于不同分支。     

新型鸭肝炎病毒全基因组序列分析

为了解新型鸭肝炎病毒(DHV)基因组变异情况,本研究将广东地区分离到的1株,山东地区分离到的2株与1型DHV(DHV-1)无抗原交叉性的新型DHV(N-DHV)全基因组序列测定的结果进行了分析。结果表明,N-DHV基因组全长7786nt～7788nt,仅有一个ORF,其结构具有典型的微RNA病毒科病毒基因组特征。ORF编码一个2251aa的聚合蛋白,该蛋白经3Cpro切割产生3个结构蛋白(VP0、VP3、VP1)和8个非结构蛋白(2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D)。与其他N-DHV毒株及DHV-1的抗原性相关VP1蛋白氨基酸序列比对表明,3株病毒之间及与国内分离的N-DHVG株的同源性均在98%以上,与韩国N-DHV同源性均大于92%,与中国台湾地区N-DHV同源性为80.1%～80.9%,与DHV-1的同源性为76.9%～77.3%。3株病毒与韩国N-DHVVP1氨基酸差异位点主要集中在C-端的高变异区。依据微RNA病毒科人肠病毒属血清型分型标准,GD株、SD01株、SD02株与韩国N-DHV和G株属于同一血清型,而与DHV-1和中国台湾地区新型DHV属于不同的血清型。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒的分离与鉴定

利用I型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组的5′端UTR附近区域设计1对引物,以病死鸭肝组织悬液、鸭胚尿囊液毒和鸡胚尿囊液毒为模板,RT-PCR扩增得到336 bp基因片段。经测序分析病死鸭分离病毒与已发表鸭病毒性肝炎DHV-Ⅰ型病毒的基因同源性可达98%,该病毒与已知DHV-Ⅰ毒株之间病毒基因组一级结构有较高的同源性。为进一步验证所分离的病毒为Ⅰ型鸭肝炎病毒,依据Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因特异性引物进行PCR,得到714 bp左右目的片段,证明该病毒为鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的克隆和表达

通过RT-PCR方法克隆出GD株Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)的结构蛋白VP1基因片段,VP1基因片段和原核表达载体pMAL-C2X均以EcoRⅠ、HindⅢ双酶切后构建获得重组质粒pMAL-C2X-VP1,经限制性酶切和序列测序证明,目的基因正确插入表达载体,转入E.coli BL21(DE3),构建重组表达菌E.coliBL21/pMAL-C2X-VP1,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明,DHV-1的结构蛋白VP1能在E.coliBL21(DE3)中表达,获得可溶性重组蛋白,表达产物的分子质量约为69ku。     

樱桃谷鸭感染Ⅰ型鸭肝炎病毒的病理组织学观察

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭发生的一种急性、高度致死性传染病.剖检变化主要表现为肝脏表面不同程度的出血.鸭肝炎病毒在1949年首先发现于美国长岛[1],传统上多将该病毒分为3个血清型,分别为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型(DHV-Ⅰ、DHV-Ⅱ和DHV-Ⅲ),其中中国主要流行DHV-Ⅰ,而DHV-Ⅱ主要流行于英国,DHV-Ⅲ只发现于美国.研究表明,Ⅰ型与Ⅱ型在形态学及基因型上无任何相关性;血清中和试验表明,Ⅰ型与Ⅲ型之间也不存在抗原相关性.