牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的表达及多克隆抗体制备

为高效表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白并制备多克隆抗体,参考牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因组序列设计一对引物,利用RT-PCR扩增出822 bp的E2基因片段,经测序鉴定正确后,将其定向克隆至原核表达载体pET32a(+)中,鉴定正确后,在大肠埃希菌BL21(DE3)细胞内得到了以包涵体表达形式存在的重组融合蛋白,重组蛋白亲和层析纯化后,免疫印迹鉴定表明重组蛋白能够被牛病毒性腹泻病毒阳性血清特异性识别,具有良好的反应活性.将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测定其抗体效价达1∶25 600.本研究所表达的E2蛋白及制备的多克隆抗体,为E2蛋白结构、功能的研究以及抗原表位的鉴定奠定了基础,为进一步开发牛病毒性腹泻病毒快速检测试剂提供了条件.     

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。     

猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株E2蛋白的表达及抗体制备

表达去除SD0803E2基因跨膜疏水区的sE2蛋白并制备其抗体,为猪源BVDV诊断奠定基础。RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2,转化BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1∶256 000;制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合;该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。成功构建pGEX-4T-1-sE2原核表达质粒,诱导其表达的蛋白免疫家兔,成功制备的猪源BVDV SD0803株E2抗体。     

牛病毒性腹泻病毒2型E2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV2)E2蛋白的单克隆抗体,采用表达的E2蛋白免疫BALB/c小鼠,4次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选,获得5株能稳定分泌抗BVDV2 E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Western blot和IFA结果显示,其中1株为BVDV2特异性单克隆抗体,其细胞上清ELISA抗体效价达59049。亚型鉴定结果显示,单克隆抗体属于Ig G1,轻链为κ型。经腹水制备和纯化后,其纯度达85%以上,间接ELISA抗体效价达128000以上,经连续传代20代仍能稳定分泌单克隆抗体。通过杂交瘤融合后筛选出1株针对BVDV2 E2蛋白的单克隆细胞株,为开展免疫学研究和2型牛病毒性腹泻/黏膜病诊断检测方法的建立奠定了基础。     

BVDV-1 E2蛋白抗原表位的串联表达及其多克隆抗体的制备

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）与猪瘟病毒（CSFV）的E2蛋白具有部分同源性,可导致血清学交叉反应。为准确检测BVDV,排除CSFV的干扰,以柔性氨基酸（GSGS）将BVDV-1 NADL株E2蛋白的5个特异性抗原表位（E1～5）串联（E1-E1-GSGS-E2-E2-GSGS-E3-E3-GSGS-E4-E4-GSGS-E5-E5,命名为5BE）,构建原核表达载体pET-28a-5BE,诱导表达重组蛋白His-5BE;将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,并以间接ELISA和Western Blot方法检测多克隆抗体的效价及反应性。结果显示：体外表达获得的重组蛋白His-5BE大小为22 kD;经ELISA检测,制备的His-5BE多抗血清效价至少达到1:160 000;经Western Blot检测,制备的抗血清1:500稀释时具有良好的反应性。结果表明,本研究成功获得了BVDV 5BE重组蛋白及其多克隆抗体,为后续BVDV单克隆抗体制备及检测方法建立奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白纳米抗体筛选及反应原性检测

通过噬菌体展示技术筛选牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白特异性纳米抗体,验证纳米抗体反应原性.使用BVDV灭活疫苗免疫羊驼,分别在第0、21、49及70天采集全血,测得抗体效价后分离全血中淋巴细胞,提取总RNA,反转录后PCR扩增目的片段.目的片段和pCANTAB5E使用限制性内切酶酶切连接后转至TG1感受态细胞...     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2 000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD₄₅₀≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立及临床效果评价

旨在建立一种检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的间接ELISA方法。将BVDV的囊膜蛋白E2基因克隆到原核表达载体pET-32a中进行表达,将纯化后的蛋白作为包被抗原,优化ELISA条件,建立了BVDV抗体间接E2-ELISA检测方法,证实该方法的特异性、敏感性和重复性均较好。用所建立的E2-ELISA方法检测从广西各牛场采集的475份血清样品,检出率为24.8%;与商品化试剂合作比较,符合率为95%。结果表明,建立的E2-ELISA方法简便易行,适用大量样本检测,可用于BVDV的抗体水平监测及牛病毒性腹泻的流行病学调查。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法,利用大肠杆菌表达系统成功表达E2蛋白并纯化,利用纯化后的蛋白作为包被抗原,用方阵法对影响ELISA试验的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。确定E2抗原最佳包被浓度为1μg/mL,最佳血清稀释度为1∶40,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min;最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD_450nm≥0.255。与血清中和试验和商品化试剂盒进行比较,总符合率分别为98%和96%,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与其它常见牛病毒阳性血清均无交叉反应。本研究成功建立了间接ELISA方法,为进一步用于大批量牛血清样本的抗体检测和流行病学研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因生物信息学分析及可溶性表达

为了获得牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2基因的最佳可溶性蛋白,本试验根据GenBank已公布的BVDV E2基因序列,利用DNAStar等软件进行生物信息学分析,截取抗原性和亲水性较高的序列进行稀有密码子优化,串联信号肽序列后合成并连接到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-Opti-E2;转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,经SDS-PAGE和Western blot分析,成功获得大小为43 kDa的BVDV E2基因的最佳可溶性蛋白,且该蛋白特异性较好。本试验E2蛋白的成功表达可为后续ELISA方法的建立和亚单位疫苗的开发奠定基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的截短表达与鉴定

利用牛病毒性腹泻病毒（BVDV）BA株接种MDBK细胞，提取病毒RNA。参照已发表的BVDV基因组序列，利用Oligo6生物学软件设计扩增E2基因的1对引物，引入酶切位点并去掉E2蛋白的跨膜区及疏水区。通过RT-PCR扩增了长约1000bp的E2基因片段，克隆到pMD18-T载体上，酶切并测序鉴定。然后将目的片段进一步定向克隆到pET30a表达载体，转化BL21表达菌。取转化菌培养，并用IPTG诱导，获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后，用免疫印迹与间接ELISA检测表明纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性，为牛病毒性腹泻病毒诊断试剂的研制奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原捕获ELISA检测方法的建立

用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立BVDV抗原捕获ELISA(AC-ELISA)检测方法,优化反应条件并对该方法的稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被质量浓度为5μg/mL,兔多抗血清最佳质量浓度为10μg/mL;单抗在4℃包被12~24 h,多抗在37℃作用1 h为双抗体的最佳反应条件;酶标抗体最适稀释度1∶10000,最适作用时间为1 h;采用1%BSA和1%明胶分别在抗体包被后和加入待检抗原反应后进行两次封闭效果好。用AC-ELISA方法检测临床采集的11份牛腹泻病料和12份健康牛组织样品,同时以病毒分离和RT-PCR检测方法做对比,3种方法符合率很高。研究表明AC-ELISA方法稳定性好,可用于BVDV的临床快速检测。     

牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

将牛病毒性腹泻病毒超免疫血清以常规方法提取IgG，采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶（HRP），建立了从粪样中检测牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗体夹心ELISA。结果，抗体的最佳包被量为150μg／mL，酶标抗体最适工作浓度为1：200；封闭液为50mL／L的兔血清；待检粪样及酶标抗体的感作时间为37℃ 120min；底物显色时间为室温15min。应用建立的检测方法对河北省8个大中型奶牛场298份乳牛腹泻粪样进行了检测，结果，阳性检出率为42．6％。     

牛病毒性腹泻病毒基因2型代表株全基因组序列分析

为了解我国牛病毒性腹泻(BVD)的分子流行病学情况,本研究对分离的3株牛病毒性腹泻病毒基因2型(BVDV-2)代表株全基因组进行序列分析,应用RT-PCR法分段扩增3株BVDV-2(XJ-04、SD-09和QH-09)的全基因组序列,共分为18个片段:A～Q以及5'-UTR和3'-UTR的部分序列。除5'-UTR和3'-UTR部分序列外,A～Q基因片段末端相互重叠。经序列拼接获得3株全基因组序列,全长均为12 284 bp。将测序结果与GenBank登录的瘟病毒科代表毒株序列、自我裂解酶(Npro)、结构蛋白(C、Erns、E1、E2)以及标准株BVDV-1 NADL和BVDV-2 890进行核苷酸以及氨基酸序列同源性分析。结果表明:XJ-04、SD-09和QH-09的全基因组序列同源性高于99.6%,3株BVDV-2分离株与890和NewYork93株亲缘关系最近,属于BVDV-2a亚型。在致细胞病变型的XJ-04、SD-09、QH-09株的NS2/3基因上无外源基因的插入。本研究分离的BVDV-2株为国内首次鉴定国内分离株全基因组序列,为我国BVD的分子流行病调查提供依据。     

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒Changchun184株E2基因在卡介苗中的表达

在成功克隆牛病毒性腹泻一黏膜病痛毒Changchun184株E2基因的基础上,将E2基因与表达载体pMV261连接,构建了重组穿梭质粒pMV261-E2,后电转化到卡介苗中,获得了具有卡那霉素抗性的重组卡介苗,并对重组卡介苗进行菌落PCR鏊定.在45℃下热诱导E2基因在重组卡介苗中的表达,并对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Wesern blotting 分析.结果证明,牛病毒性腹泻-黏膜病病毒Changchun184株E2基因在卡介苗中成功的表达.     

牛病毒性腹泻病病毒Changchun184株E2基因的克隆及在大肠杆中的高效表达

根据GenBank已发表的多个BVDV-1序列的比较分析结果设计引物,应用RT-PCR及套式PCR克隆得到包含Changchun184(CC-184)株E2基因的片段F2/R2,克隆、测序分析结果表明该片段大小为1391bp,软件分析结果表明CC-184株E2基因长度为1122bp(GenBank accession number:AF526380).通过基因操作构建得到表达完整E2蛋白和去除E2蛋白C-端疏水区的重组质粒pET28a-BE2和pET28a-BE2m,转化大肠杆菌并诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE检测结果表明重组菌能表达目的蛋白,其表达量分别占菌体总蛋白的6.25%和35.7%.Western blot分析结果正实表达蛋白为CC-184株E2蛋白.     

Genetic and antigenic characterization of bovine viral diarrhea viruses isolated from cattle in Hokkaido,Japan

In our previous study, we genetically analyzed bovine viral diarrhea viruses (BVDVs) isolated from 2000 to 2006 in Japan and reported that subgenotype 1b viruses were predominant. In the present study, 766 BVDVs isolated from 2006 to 2014 in Hokkaido, Japan, were genetically analyzed to understand recent epidemics. Phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of the 5′-untranslated region of viral genome revealed that 766 isolates were classified as genotype 1 (BVDV-1; 544 isolates) and genotype 2 (BVDV-2; 222). BVDV-1 isolates were further divided into BVDV-1a (93), 1b (371) and 1c (80) subgenotypes, and all BVDV-2 isolates were grouped into BVDV-2a subgenotype (222). Further comparative analysis was performed with BVDV-1a, 1b and 2a viruses isolated from 2001 to 2014. Phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of the viral glycoprotein E2 gene, a major target of neutralizing antibodies, revealed that BVDV-1a, 1b and 2a isolates were further classified into several clusters. Cross-neutralization tests showed that BVDV-1b isolates were antigenically different from BVDV-1a isolates, and almost BVDV-1a, 1b and 2a isolates were antigenically similar among each subgenotype and each E2 cluster. Taken together, BVDV-1b viruses are still predominant, and BVDV-2a viruses have increased recently in Hokkaido, Japan. Field isolates of BVDV-1a, 1b and 2a show genetic diversity on the E2 gene with antigenic conservation among each subgenotype during the last 14 years.     

二重RT-PCR同时检测VSV与BVDV核酸

水泡性口炎病毒(VSV)与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)具有相近的传播途径与类似的检测方法，本文参照文献报道的基因序列，设计合成了两对能分别扩增VSV(202bp)、BVDV(341bp)基因片段的引物，并对PCR扩增条件进行优化，建立了二重RT-PCR方法，可同时检测VSV与BVDV病毒核酸。VSV产物经测序显示与报道的核酸序列同源性为88．6％。二重RT-PCR同时检测VSV与BVDV经济、快速、敏感、特异，可用于实验研究和流行病学调查。     

牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA检测方法的标准化研究

用纯化牛病毒性腹泻病毒免疫蛋鸡制备出的卵黄抗体作为包被抗体,采用自制的单抗为一抗,建立牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法。通过试验确定,抗牛病毒性腹泻病毒卵黄抗体最佳包被浓度为1:50;McAb最适稀释浓度为1:10,HRP-羊抗鼠IgG工作浓度为1:800。通过引入牛病毒性腹泻病毒质控血清进行质控检验,该方法所得检测结果均在质量控制范围内,达到预定标准化要求。标准化的抗原捕获ELISA方法具有特异、灵敏、可靠、方便、快捷等特点,可广泛应用推广,为我国牛病毒性腹泻病毒监测提供了行之有效的技术手段。     

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0的构建与免疫原性分析

利用SacⅠ、HindⅢ限制性内切酶分别对pMG36e与pMD19-T-E0进行双酶切,将目的基因E0整合入穿梭表达载体pMG36e,构建牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0。提取重组质粒pMG36e-E0,进行双酶切鉴定及PCR鉴定。将阳性重组质粒pMG36e-E0转化到大肠杆菌DH5α中进行表达,对表达产物进行SDSPAGE和Western-blotting鉴定。用表达的E0蛋白二次免疫家兔,间接ELISA法检测其血清抗体水平。结果,重组质粒经双酶切得到大小分别约为3 600、691bp的2个片段,PCR扩增出691bp的片段,双酶切与PCR鉴定结果表明目的基因E0正确插入到载体pMG36e中。SDS-PAGE电泳结果表明E0基因在大肠杆菌获得了表达,表达产物相对分子质量大小约为27 000。Western-blotting分析结果证明表达产物能被BVDV阳性血清所识别。ELISA检测结果证明表达的E0融合蛋白能刺激动物产生抗体,具有天然蛋白的免疫原性。