细菌人工染色体技术研究进展

细菌人工染色体是一种新发展起来的DNA栽体系统,它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点.在基因文库构建和基因功能分析等方面有广泛的应用.笔者综述了近年来发展起来的对BAC进行分析和修饰的一些方法.     

运用CRISPR/Cas9系统编辑细菌基因的研究进展

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated proteins 9)系统来源于细菌的适应性免疫防御系统,能通过RNA指导的Cas9核酸酶特异性剪切靶标基因。相比于细菌同源重组编辑系统,CRISPR/Cas9系统在细菌的基因编辑中已展现出独特的优势:操作简便、较高的编辑效率、特异性、可以同时编辑多个靶基因或删除基因簇片段且不对基因组产生任何"伤疤"。虽然这种操作系统还没有达到在真核生物中的成熟应用程度,但目前CRISPR/Cas9系统在编辑细菌基因上已取得了一些重要进展,现将对这些进展进行总结与分析。     

细菌Ⅵ型分泌系统研究进展

病原体在感染的过程中,不仅要努力寻找外在的基本营养物质,又要避免被宿主免疫系统清除.这些过程大多都依赖于某些特殊的蛋白质,这些蛋白质由细菌自身合成及释放,或存在于细菌表面,或释放到细菌的外环境中,或者是注入到宿主细胞内.这些蛋白质参与了细菌的各种重要生命活动,包括菌毛和鞭毛等细胞器的生物合成、营养物质的获取、对宿主细胞的毒力以及对药物抵抗力的形成等.因此,充分了解这些蛋白质从细胞内膜(IM)、细胞周质和外膜(OM)到达细菌表面的运输过程是了解宿主和病原菌之间联系的关键.分子微生物学已经揭示了革兰氏阴性细菌分泌生物学活性外蛋白的多种不同机制,目前备受关注6个分泌系统即Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,V,Ⅵ及Ⅶ型分泌系统[1].所有的分泌系统均持有特殊的成分来介导效应蛋白穿过细菌不同的膜结构(即IM、细胞周质和OM).这些分泌途径可以分为两个主要组群:Sec依赖性和非Sec依赖性[ 2].其中Ⅱ型分泌系统(T2SS)和V型分泌系统(T5SS)用Sec转移酶和氨基端信号肽运输其效应蛋白,Ⅰ型(TlSS)、Ⅲ型(T3SS)、Ⅳ型(T4SS)和Ⅵ型(T6SS)则采用的不依赖Sec转移酶的机制.Ⅵ和Ⅶ(T7SS)型分泌系统是最近被发现的分泌系统[3-5],还不清楚T7SS的机理,但已知T6SS被认为是许多革兰氏阴性致病菌的潜在毒力决定因子,能够促进细菌病原体之间,以及细菌病原体和宿主之间的相互作用.虽然现在对其机制的研究还很缺乏,但已经在不同的动物感染模型中观察到了T6SS表型.     

布鲁菌群体感应系统研究进展

布鲁菌病(布病)是世界上最严重的人畜共患病之一,布鲁菌作为布病的病原可以导致患病动物的流产及人类的马耳他热。群体感应系统对布鲁菌在胞内生存起到重要的作用,它调控着细菌的Ⅳ型分泌系统和鞭毛相关基因的表达。除此之外,布鲁菌群体感应系统在布鲁菌病的诊断与防治方面均有重要的价值。论文对布鲁菌群体感应系统的研究现状进行了系统的介绍。     

布鲁菌二元调控系统研究进展

布鲁菌是一种缺乏典型毒力因子的胞内寄生菌,可以抵御宿主细胞内酸性、缺氧、强氧化性以及营养匮乏等多种不利环境,是形成布鲁菌致病力的重要原因。布鲁菌的二元调控系统可以对这些环境信号进行感应、传递并做出相应的适应。论文对布鲁菌二元调控系统的研究现状及二元调控系统在布鲁菌病防控中的应用进行了系统的介绍。     

细菌群体感应种类及其信号分子的研究进展

<正>细菌的群体感应(Quorum sensing,QS)效应为存在于细菌中,通过响应细菌细胞的密度变化而调节基因表达的机制。随着细菌细胞数目的增加,细菌通过QS的作用产生、释放类激素分子-自诱导物(Autoinducers,AI)并积聚在细菌细胞的外环境中,细菌就是通过这种被称作AI的信号分子的浓度变化来进行信息交流[1]。AI是随着细菌细胞密度的增大而增大的,当AI积聚达到一定的阈值时,     

细菌人工染色体载体系统在反向遗传学中的应用研究进展

细菌人工染色体是近十几年来发展起来的一种新型DNA克隆载体系统,具有操作简单、遗传稳定、容量大等明显的优势。论文主要综述了细菌人工染色体载体系统在基础研究、基因治疗及病毒载体疫苗等反向遗传学方面的研究进展。     

利用CRISPR/Cas9系统构建绿色荧光转基因斑马鱼

斑马鱼是研究人类疾病的重要动物模型,基因组定点编辑技术在利用斑马鱼研究同源基因功能方面提供了简便高效的途径。利用CRISPR/Cas9系统,在斑马鱼TU品系第5号染色体中选择靶位点,将Cas9 mRNA、靶位点识别的sgRNA和带有同源重组臂、利用短链肌球蛋白(Mylz2)启动子启动的绿色荧光蛋白(eGFP)基因显微注射到斑马鱼受精卵中,获得在该位点定点插入外源基因,并在肌肉中特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼。利用基因组DNA的PCR扩增,结合激发光下斑马鱼胚胎荧光表达情况,在存活的87尾幼鱼中发现其中45尾有荧光表达,同源重组率为51.724%。研究表明,利用CRISPR/Cas9系统成功定点插入外源基因,并获得在肌肉中特异性表达绿色荧光的斑马鱼。     

整合子-基因盒系统与细菌耐药

整合子是细菌基因组中可移动的遗传物质,可以通过其整合酶将携带有耐药基因的基因盒整合到自身基因组中,并使其表达,从而使细菌获得耐药性,甚至多重耐药性.作为近年来关于细菌,尤其是革兰氏阴性菌耐药机制研究的热点,整合子一基因盒系统受到人们越来越多的关注.     

利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株

本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）K88的热不稳定性肠毒素（heat-labile toxin,LT）基因进行无痕敲除并获得K88 LT^-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT^-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT^-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT^-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。     

重组质粒pACYC184-hok/sok的构建及稳定性研究

以低拷贝质粒pACYC184为载体,将hok/sok基因插入到载体BamH Ⅰ位点,构建重组质粒pACYC184-hok/sok稳定系统,同时构建hok/sok基因缺失突变重组质粒pACYC184-hok/sok(M).通过对构建的重组菌进行连续传代和对不同代次的重组质粒进行SphⅠ酶切,分析hok/sok基因的引入对宿主细胞生长的影响.结果表明,重组质粒pACYC184-hok/sok在无抗生素筛选压力下连续传代,传至第135代时质粒稳定率仍是100%,且传代前后的质粒SphⅠ酶切图谱没有发生变化,DNA序列测定表明,插入的hok/sok基因没有发生任何突变.突变重组质粒pACYC184-hok/sok(M)传代前后的质粒SphⅠ酶切结果虽没有发生变化,但其相应的重组菌传至第15代,质粒几乎完全丢失.生长曲线的测定结果表明,与舍pACYC184重组菌生长曲线相似,pACYC184-hok/sok重组菌生长较快,而pACYC184-hok/sok(M)重组菌生长缓慢.以上结果表明,含hok/sok稳定系统,其稳定性明显高于无hok/sok稳定系统的质粒pACYC184以及突变质粒pACYC084-hok/sok(M).重组质粒pAqCYC184-hok/sok具有良好的结构稳定性和分离稳定性.     

OPG/RANKL/RANK系统的研究进展

OPG/RANKL/RANK系统是近年来骨科研究领域中的重大突破,研究发现许多激素、细胞因子等均通过直接或间接的调节骨保护素(osteoprotegerin,OPG),核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator ofNF-κB ligand,RANKL)的表达,调控OPG、RANKL和核因子-κB受体活化因子(recep-tor activator of NF-κB,RANK)之间的比例,从而介导破骨细胞的分化和功能而达到抗骨质疏松或致骨质疏松的作用。现就OPG/RANKL/RANK系统在骨质疏松中的作用做一综述。     

钠/碘转运体研究进展

钠/碘转运体(NIS)是主要存在于甲状腺滤泡基底膜上的跨膜糖蛋白,主要介导胞外碘进入甲状腺细胞,是甲状腺激素合成的主要步骤.该蛋白受多种因素的调节,并与多种疾病的发生密切相关,利用其介导放射性碘治疗已具有良好的临床应用前景.近年来研究表明乳腺组织也能摄取放射性碘,哺乳期和非哺乳期乳腺组织中的NIS的mRNA表达有所不同...     

鸡肠道免疫的研究进展

鸡肠道相关淋巴组织是粘膜相关淋巴组织的主要组成部分 ,是防止肠道病原感染的第一道防线。其中的肠道上皮、上皮间淋巴细胞、粘膜固有层淋巴组织在肠道免疫功能的调节方面起着重要的作用。本文就鸡肠道免疫研究进展做一综述。     

胰岛素样生长因子系统在动物生产中的研究进展

GH的促生长作用要通过肝脏、软骨等组织产生生长因子，即胰岛紊样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)来介导。IGF系统与动物的生长发育、生产关系密切。作者综述了近年来IGF系统在动物生产方面的研究进展。