鸡IL-2和IL-15基因真核表达质粒对禽流感疫苗的免疫增强作用

根据GenBank中的鸡IL-2和IL-15序列设计了2对引物，采用RT-PCR法从山地乌骨鸡外周血淋巴细胞RNA中克隆了IL-2和IL-15基因，与pcDNA3．1连接构建了真核表达质粒pDNAIL-2和pDNAIL-15，研究了其对禽流感灭活疫苗的免疫增强作用。结果显示，免疫后第10d，pDNAIL-15＋AI灭活疫苗组和pDNAIL-2＋AI灭活疫苗组HI抗体水平显著高于AI灭活疫苗组（P〈0．05）。免疫后第10d，pDNAIL-15＋AI灭活疫苗组CD4^＋淋巴细胞百分含量显著高于pDNAIL-2＋AI灭活疫苗和AI灭活疫苗组（P〈0．05）；免疫后第23d，pDNAIL-2＋AI灭活疫苗组CD4^＋淋巴细胞百分率显著高于pDNAIL-15＋AI灭活疫苗和AI灭活疫苗组（P〈0．05）。证实pDNAIL-2和pDNAIL-15能提高禽流感灭活疫苗的免疫效果。     

缓释复方免疫增强剂对4种鸡传染病疫苗免疫增强效果研究

为了验证缓释复方免疫增强剂对鸡减蛋综合征(EDS-76)、鸡新城疫(ND)、鸡传染性支气管炎(IB)和鸡传染性法氏囊病(IBD)4种疫苗的免疫增强作用,试验选用30日龄海兰褐蛋鸡80只,随机分为4组,每组又均分为试验组和对照组,分别注射EDS-76、ND、ND-IB和IBD疫苗,同时对试验组雏鸡投服缓释复方免疫增强剂1粒/只,在免疫前、免疫后12、27 d采血测定抗体效价(或阳性率)、T淋巴细胞花环形成率和ANAE阳性率。结果表明,试验组鸡EDS-76、ND、IB抗体效价和IBD抗体阳性率、T淋巴细胞花环形成率和ANAE阳性率均显著或极显著高于对照组。以上结果说明,缓释复方免疫增强剂可以提高EDS-76、ND、ND-IB和IBD4种疫苗抗体效价(或阳性率),增强鸡体液免疫功能和细胞免疫功能。     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120疫苗株S1基因的克隆与序列测定

根据国外已发表的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因序列设计了一对引物，通过：RT-PCR特异性扩增出IBV H120疫苗株的S1基因，产物大小为1．62kb，与设计相符。同源性比较结果显示，H120株与H52、M41和BEAU株的S1基因核苷酸序列的同源性分别为97．1％、96．9％和96．8％，表明IBV H120疫苗株与标准毒株的S1基因具有高度的同源性。     

缓释复方免疫增强剂对鸡ND—IB二联弱毒疫苗免疫增强效果研究

80只30d龄蛋鸡随机均分成试验组和对照组,分别皮下注射ND—IB二联弱毒疫苗2头份／只,同时给试验组鸡投服缓释复方免疫增强剂1粒／只,对照组不投服。在免疫前、免疫后10d、20d、30d和40d,采血测定发现免疫后不同时期鸡ND、IB抗体效价和T淋巴细胞ERFC形成率试验组显著或极显著高于对照组,表明缓释复方免疫增强剂可以提高鸡体液免疫功能和细胞免疫功能。     

表达传染性支气管炎病毒S1基因与鸡IL-18基因重组禽痘病毒的构建

将含痘病毒启动子LP2EP2的鸡传染性支气管炎病毒S1糖蛋白基因和鸡IL-18(ChIL-18)基因同时插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组禽痘病毒转移载体pSYS1/ChIL-18。用脂质体将其转染已感染禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达S1和鸡IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-S1-ChIL-18)。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选,对重组病毒rFPV-S1-ChIL-18进行多次蚀斑克隆。以重组禽痘病毒DNA为模板,利用S1基因和鸡IL-18基因特异引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7 kb和1条约0.6 kb的带。经间接免疫荧光法和T细胞转化试验证实感染rFPV-S1-ChIL-18的CEF中存在表达的S1和鸡IL-18。     

鸡胚接种鸡白介素18重组质粒对IBDVDNA疫苗免疫增强作用的研究

用鸡白细胞介素18(ChIL-18)重组质粒(pCI-ChIL-18)接种18胚龄SPF鸡胚,利用适时荧光定量PCR方法对试验鸡不同时间点的动态变化进行检测.检测结果表明,胚胎接种pCI-ChIL-18使ChIL-18在鸡血液中早期持续高浓度存在,能促进鸡脾脏和法氏囊中ChIL-18基因的大量表达.用pCI-ChIL-18与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫18胚龄SPF鸡胚,设1日龄雏鸡肌肉免疫对照组和空白对照组,2周龄时二免,6周龄时用IBDV标准强毒株BC6/85攻击.结果表明,胚胎免疫pCI-ChIL-18能显著促进试验鸡T、B淋巴细胞的早期增殖反应,增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的早期抗体水平及其对强毒攻击的保护力.并进一步证明胚胎免疫pCI-ChIL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的早期免疫效果具有显著的增强作用(P相似文献   

ILTV gB基因与鸡IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性

本试验构建了能分别或同时表达ILTV gB和IL-18基因的重组质粒pIRES-gB、pIRES-IL18、pIRES-gB/IL18。将重组质粒通过腿部肌肉多点注射免疫21日龄雏鸡,35日龄加强免疫1次,二免后2周用ILTV HN1株进行攻毒。pIRES-gB/IL18和pIRES-gB+pIRES-IL18免疫雏鸡后均能促进外周血T淋巴细胞亚群数量和血清中特异性抗体水平的增加,能明显增强ILTV DNA疫苗对强毒的攻击保护,但pIRES-gB/IL18免疫组要优于pIRES-gB+pIRES-IL18混合免疫组及其他对照组,差异显著或极显著。结果表明,鸡IL-18能明显增强ILTV DNA疫苗的免疫原性。     

国产IBV疫苗株核衣壳蛋白基因的亲缘关系

利用自行设计的引物Cx和Cs，通过RT－PCR方法分别扩增出鸡传染性支气管炎病毒（IBV）D41株，H120GD株、H120SH株、H52GD株等4个国产疫苗株和标准强毒M41－E4株完整的N基因cDNA,然后将其分别克隆到pGEM T-Easy或pMD 18-T载体中并测序。测序结果表明，这5个IBV毒株可分2组，其中D41株，H120GD株和H120SH株为一组，它们的核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99．7％－99．8％和99．0％－99．5％，而H52GD株与M41－E4株构成另一组，其核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99．7％和99．5％；而2组之间的最大同源性仅为91．0％和93．2％。在系统发生进化树上，这2组分别位于不同的分支簇上。值得注意的是，国内的H52GD株与国外报道的H52株不在同一分支簇上，相反却与国内强毒M41－E4株以及国外报道的M41株在同一分支簇上。这一结果表明，国内的H52GD疫苗株与国外报道的H52疫苗株不同，它们在亲缘关系上更靠近M41－E4株和M41株。     

缓释复方免疫增强剂对四种鸡病疫苗免疫增强效果研究

鸡新城疫（ND）、传染性支气管炎（IB）、传染性法氏囊病（IBD）、减蛋综合征（EDS-76）是由各自病毒引起的鸡的传染病,在养鸡业中比较常见和多发,严重威胁着养鸡业的健康发展,生产中主要应用疫苗接种进行预防。     

重组鸡IL-2作为传染性法氏囊病疫苗免疫增强剂对鸡细胞免疫水平的影响

传染性法氏囊病是危害养禽业的一种最为重要的疾病之一，经常造成鸡只的死亡，耐过鸡免疫抑制，以后疫苗接种免疫失败和产蛋率下降，造成严重的经济损失。传染性法氏囊病活苗免疫效果虽然较好，但保护期短，易引发感染和免疫抑制；灭活苗较安全，保护期长，但效果较差，应寻找一种免疫增强剂，     

禽传染性支气管炎DNA疫苗在鸡体内的分布和安全性

采用本实验室构建的3种禽传染性支气管炎病毒基因的真核表达质粒pIBVS1、pIBVM、pIBVN,按各50 mg/L配制成质量浓度为150 mg/L的DNA疫苗,经腿部肌肉分点注射免疫1周龄SPF雏鸡。分别在免疫后24 h,73、0及60d,采集试验鸡的血液、心、肝、脾、肺、肾、胸腺、性腺（卵巢/睾丸）及注射部位肌肉进行组织总DNA抽提,以组织总DNA为模板进行PCR扩增。另外,在对照组DNA模板中加入不同拷贝数的质粒,确定PCR反应的灵敏性。以纯化后的组织总DNA为模板,PCR法检测质粒DNA整合到鸡细胞染色体基因组上的可能性,评价疫苗的安全性。结果表明,该疫苗在24 h内迅速分布于全身,并能在血液及所有检测的组织器官内持续分布60 d;纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合现象,证实该DNA疫苗的安全性好。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组腺病毒的构建

为构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)主要免疫原S1蛋白的重组腺病毒,本研究以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,以IBVCK/CH/LHLJ/04V株S1基因为外源插入靶基因,通过细菌内同源重组法构建了一株稳定表达IBVS1蛋白(90ku)的重组腺病毒,命名为rAdV-S1。通过PCR鉴定、间接免疫荧光及western blot检测证实S1蛋白在重组腺病毒中获得表达。对构建的重组腺病毒和亲本腺病毒的生长动力学分析表明,该重组病毒的毒价为108.25TCID50/mL,并且两者在生长动力学方面无显著差异。本研究为动物试验和该重组腺病毒免疫特性的研究奠定基础。     

表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。     

IBV M基因与IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)的M基因和禽白介素18(IL-18)基因分别插入双顺反子质粒pIRES-EGFP/DsRed中,构建IBV M和IL-18基因的共表达质粒pIRES-M/IL18及表达M基因的pIRES-M质粒。通过脂质体转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测质粒在体外的表达。将构建的质粒用脂质体包裹后,通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄雏鸡,28日龄加强免疫1次;免疫前后均采血检测ELISA抗体效价和外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量;二免后2周用IBV肾型强毒进行攻毒。结果显示,pIRES-M/IL18、pIRES-M质粒均在Vero细胞中有效地转录并表达目的蛋白。从免疫后7 d起,pIRES-M/IL18免疫组产生的抗体水平及外周血T淋巴细胞亚群数量均高于pIRES-M组。pIRES-M/IL18、pIRES-M组对强毒的攻击保护率分别为65%和40%。以上结果表明,禽源IL-18基因与IBV M基因共表达可增强鸡体对DNA疫苗的免疫应答,提高对IBV强毒的抵抗力。     

黄芩抑制鸡传染性支气管炎病毒增殖的作用机制研究

为研究黄芩乙醇提取物对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的体外抑制作用及对IBV感染细胞内抗病毒基因表达的影响,进行以下试验:①以人肺癌H1299细胞为供试细胞,在IBV感染过程中在细胞培养体系中加入一定量的黄芩乙醇提取物,24 h后检测病毒增殖量;②将黄芩乙醇提取物稀释成4个不同浓度,观察不同浓度的提取物对IBV的抑制作用;③用RT-PCR检测黄芩乙醇提取物对IBV感染细胞内抗病毒基因OASL、IFI27、STAT1表达的影响。结果显示:黄芩乙醇提取物对IBV具有明显的抑制作用,且药物浓度越高抑制作用越明显;此外,黄芩乙醇提取物可增加IBV感染细胞内抗病毒基因的表达量。     

Effects of DDA, CpG-ODN, and plasmid-encoded chicken IFN-�� on protective immunity by a DNA vaccine against IBDV in chickens

This study examined the adjuvant effects of dimethyl dioctadecyl ammonium bromide (DDA), CpG oligodeoxynucleotides (CpG-ODN), and chicken interferon-γ (ChIFN-γ) on a DNA vaccine (pcDNA-VP243) against the infectious bursal disease virus (IBDV). A plasmid encoding chicken IFN-ã was constructed. Twice at 2-week intervals, two-week-old chickens were injected intramuscularly and intraperitoneally with either a DNA vaccine alone or a DNA vaccine together with the respective adjuvants. On week 2 after the second immunization, the chickens were orally challenged with the highly virulent IBDV. The groups that received the DNA vaccines plus either DDA or CpG-ODN showed significantly lower survival rates than the group that received the DNA vaccine alone. However, the survival rates for the DNA vaccine alone and for the DNA vaccine plus ChIFN-γ were similar. The chickens had no detectable antibodies to the IBDV before the challenge but all the surviving chickens in all groups except for the normal control group showed the induction of antibodies to the IBDV at day 10 after the challenge. As judged by the lymphocyte proliferation assays using the a WST-8 solution performed on the peripheral blood and splenic lymphocytes, the stimulation indices (SI) of the peripheral blood lymphocytes in all groups except for the normal control group were similar immediately before the challenge. At 10 days post-challenge, the SI for DNA vaccine plus either CpG-ODN or ChIFN-γ was similar to that of the DNA vaccine control group. For splenic lymphocytes, the SI in the DNA vaccine plus CpG-ODN and DNA vaccine plus ChIFN-γ groups were higher than for the DNA vaccine control. These results suggest that DDA actually compromises the protection against the IBDV by DNA vaccine, and CpG-ODN and IFN-γ had no significant effect.     

鸡IL-18对禽多杀性巴氏杆菌DNA疫苗的免疫佐剂作用

为了探索鸡IL-18在禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗中的免疫佐剂作用，分别用共表达鸡IL-18基因和禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗、鸡IL-18真核表达质粒pcDNA3／cIL-18与禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗混合物、禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗肌肉注射5周龄鸡，首免后每周采取外周血及外周抗凝血，应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1进行攻击。结果鸡IL-18能够明显增强禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗的免疫原性，显著提高免疫鸡的体液免疫和细胞免疫水平，并且鸡IL-18与禽多杀性巴氏杆菌H基因共表达时的免疫佐剂作用最强，能强有力地抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击。结果表明，鸡IL-18可作为DNA疫苗的一种理想的免疫佐剂。     

鸡胚成纤维细胞cDNA真核表达文库的构建及鉴定

为构建鸡胚成纤维细胞cDNA真核表达文库并对文库质量进行鉴定,从鸡胚成纤维细胞中直接提取mRNA,用紫外分光光度计测定含量.经电泳确定mRNA的质量,反转录合成第一、二链cDNA,经苯酚氯仿抽提后与EcoR Ⅰ接头连接,经Not Ⅰ酶切后用spin column除去小于500 bp的cDNA片段,与经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切的真核表达质粒连接,连接产物电转化感受态细胞,测定文库的容量大小并通过colony PCR鉴定插入cDNA片段的大小.构建成含8.8×105个重组子的鸡胚成纤维细胞cDNA文库,重组子中平均插入外源片段长度大于1.0 kb的约占85.7%.从结果看构建的文库合格,适合用于筛选目的cDNA克隆.