鹅源H5N1亚型禽流感病毒感染雏鸡免疫器官的病理学观察

应用组织病理学及超微病理学观察手段对HSN1亚型禽流感毒株感染雏鸡免疫器官的病理学变化进行了系统研究。结果显示，感染雏鸡胸腺、腔上囊及脾均表现不同程度的病理学损伤。表明，禽流感病毒感染可造成雏鸡免疫器官组织损伤，这是导致感染雏鸡免疫功能降低的重要机制之一。     

H5N1禽流感病毒感染雏鸡免疫器官细胞因子的变化

为探讨细胞因子在禽流感免疫发病机制中的作用,应用细胞培养技术和细胞因子活性检测方法,通过对胸腺和脾脏IL-2、IFN和TNF3种细胞因子的检测,研究不同日龄(7和21日龄)SPF雏鸡感染禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)后,上述被检指标的动态变化,结果发现,无论是7日龄,还是21日龄SPF雏鸡感染AIV后,其免疫器官胸腺和脾脏的IL-2和IFN诱生活性均有不同程度的降低,而TNF活性升高;但不同日龄雏鸡之间被检细胞因子,其降低或升高程度不论持续时间还是量也不完全相同,该研究不但表明细胞因子在禽流感免疫、发病中具有十分重要的调节作用,而且也与雏鸡感染年龄存在一定相关性。     

H5N1亚型禽流感病毒感染SPF雏鸡免疫器官变化

为了探讨H5N1禽流感病毒(AIV)感染对SPF雏鸡免疫器官细胞免疫功能的影响。以7日龄SPF雏鸡为研究对象,应用组织化学技术结合病理学方法,通过T细胞数量、增殖功能、CD4~+和CD8~+亚型数量及其比值变化的检测,对H5N1亚型AIV感染SPF雏鸡后,免疫器官细胞免疫变化进行了较系统研究。结果发现,H5N1亚型AIV感染SPF雏鸡后3～7 d,其胸腺、脾脏、腔上囊无论是T细胞数量还是胸腺和脾脏T细胞对Con A的增殖功能,以及CD4~+和CD8~+T细胞数均显著低于对照雏鸡。病毒感染雏鸡后1～5 d,CD4~+/CD8~+T细胞比值也显著低于对照雏鸡;AIV感染雏鸡全部发病,呈现典型AIV感染症状,死亡率为40%。表明AIV感染所致雏鸡免疫器官细胞免疫功能低下,是AIV免疫致病机制的重要环节。     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒感染SPF雏鸡免疫球蛋白含量的变化研究

以7日龄SPF雏鸡为试验动物,采用常规间接酶联免疫吸附试验(IELISA)法,对鹅源H5N1亚型禽流感病毒(AIV)感染SPF雏鸡后,其泪液、气管液、肠液、胆汁的IgA、IgG、IgM含量的动态变化进行了检测.结果发现,鹅源H5N1亚型中强毒AIV感染SPF雏鸡后,其泪液、气管液、肠液、胆汁的免疫球蛋白IgA、IgM含量均在1～3 d或1～4 d显著低于相应对照雏鸡(P＜0.05),而感染后第5天,上述被检指标开始升高,并于5～8 d或5～14 d,病毒感染雏鸡的IgA和IgM显著高于对照雏鸡(P＜0.05或P＜0.01).表明7日龄SPF雏鸡感染AIV后的早期,其消化道和呼吸道的体液免疫功能降低.     

两株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因诱导细胞凋亡的研究

为了研究H5N1亚型禽流感病毒NS1基因诱导的细胞凋亡作用，我们将两株H5N1亚型禽流感病毒A／Duck／Guangdong／40／2000（H5NI）（简称DKGD／40／00）和A／Duck／Guangxi／35／2001（H5NI）（简称DKGX／35／01）的NSI基因克隆到真核表达载体plRES2-EGFP，转染Hela细胞后，应用荧光显微镜检测转染表达效率，应用TUNEL和流式细胞仪观察NSI基因产生的细胞凋亡作用。结果两株病毒NSI蛋白表达均能诱导Hela细胞凋亡，凋亡率无明显差异。表明单一的NS1并不能完全阐明凋亡的产生与病毒毒力强弱和病毒扩散之间的关系。     

H9N2亚型禽流感病毒诱导蛋鸡免疫器官细胞凋亡的动态变化

应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素化的dUTP切口末端标记（即TUNEL）法和透射电镜（TEM）,对人工感染H9N2亚型禽流感病毒蛋鸡的脾脏、胸腺、法氏囊和盲肠扁桃体进行了细胞凋亡动态研究。结果显示,感染蛋鸡脾脏、胸腺、法氏囊中细胞凋亡率升高。接种后3d,脾脏和法氏囊的细胞凋亡率升至最高值分别为6.2%和1.7%,随后下降,但在接种后14d仍显著高于对照组（P〈0.05）。胸腺的细胞凋亡率从接种后3～21d均极显著地高于对照组（P〈0.01）。而盲肠扁桃体的细胞凋亡率在整个试验期间变化不明显。电镜下凋亡细胞呈典型的形态学特征：细胞染色质固缩并凝结成块,聚集在核膜周边呈新月状或环状小体。结果表明,H9N2亚型禽流感病毒感染蛋鸡能诱导免疫器官的细胞凋亡。     

雏鸭感染鹅源H5N1亚型禽流感病毒后疫器官淋巴细胞增殖功能变化

以21日龄雏鸭为研究对象,应用细胞培养技术和四甲基偶氮唑盐(MTT)检测法,对鹅源H5N1亚型禽流感病毒(AIV)感染雏鸭胸腺、法氏囊和脾脏的T或/和B淋巴细胞增殖功能变化进行了较全面系统的动态检测.结果发现,鹅源H5N1亚型中强毒AIV感染雏鸭后,其上述免疫器官T或/和B淋巴细胞对ConA或LPS的增殖反应均不同程度地低于相应对照雏鸭,表明AIV感染雏鸭后,其免疫器官的细胞免疫和体液免疫功能明显受抑制,上述免疫病理改变可能是导致感染雏鸭免疫抑制的主要原因之一.     

H6N6亚型禽流感病毒感染鸭免疫器官中3种细胞因子的表达变化

为探讨鸭感染H6N6亚型禽流感病毒(AIV)后对免疫器官中细胞因子IL-2、IL-10和IFN-α转录水平的影响,建立荧光定量PCR方法对胸腺、脾脏、法氏囊中的IL-2、IL-10和IFN-α3种细胞因子检测,研究非免疫鸭感染H6N6亚型AIV后1、3、5 d各细胞因子在免疫器官中的变化。结果显示,建立的荧光定量PCR方法标准曲线相关系数R²为0.996～1.000,扩增效率为92.2%～93.6%,相关性较好,熔解曲线整齐单一,变异系数均小于9%,可用于后续试验;鸭在感染H6N6亚型AIV后的一定时间内免疫器官中的IL-2、IL-10和IFN-α呈现不同程度的转录水平变化,以及不同的细胞因子在不同组织之间的转录水平差异较大,其中IL-2在法氏囊中的转录水平比在胸腺和脾脏中变化明显较大;而IFN-α在胸腺和脾脏中的转录水平高于法氏囊;IL-10在免疫器官中转录水平较低。还发现H6N6亚型AIV感染鸭后免疫器官中的IL-2、IL-10、IFN-α转录水平在一定时间内为先上升后下降趋势,并且在感染后5 d降到最低。表明感染H6N6亚型AIV对鸭免疫器官中IL-2、IL...     

1株H5N1亚型高致病力禽流感病毒人工感染鸭的细胞凋亡观察

TUNEL染色法和透射电镜观察表明,鸭静脉接种或眼-鼻-口腔-泄殖腔混合接种高致病力禽流感病毒A/duck/Guangdong/220/2004(H5N1)后,心、肝、脾、肺、肾、胰、肠、脑、胸腺和法氏囊均可发生细胞凋亡.其中,凋亡主要发生在胰腺泡上皮细胞、肾小管上皮细胞、肝细胞和肠黏膜上皮细胞;也有少量神经元、神经胶质细胞、心肌细胞、呼吸毛细管上皮细胞,胸腺、脾脏和法氏囊淋巴细胞发生凋亡.     

禽流感病毒与番鸭呼肠病毒感染番鸭免疫器官细胞凋亡的研究

应用原位末端标记法和免疫组化SABC法,分别以H9亚型禽流感和番鸭呼肠病毒单独感染或混合感染雏番鸭后1、3、5、7、10d对胸腺、法氏囊、脾脏细胞凋亡和P53的动态变化进行检测。结果显示,H9亚型AIV,MDRV单独感染和混合感染均可导致雏番鸭胸腺、法氏囊和脾脏出现淋巴细胞凋亡增多;病毒感染早期各免疫器官组织细胞凋亡明显,感染后期细胞凋亡量逐渐减少;混合感染组脾脏、胸腺细胞凋亡更为显著。P53表达的变化与细胞凋亡呈现相同变化规律,表明P53表达与病毒诱导的细胞凋亡机制密切相关。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的真核表达及其在细胞中的分布

为构建禽流感病毒(AIV) H5N1亚型非结构蛋白NS1的真核表达载体,并鉴定其在哺乳动物细胞中的表达与分布,本研究采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒的总RNA中扩增NS1全长基因,并将其克隆于pXJ40中,构建真核表达载体pXJ40-HA-NSl.将该重组质粒转染293T细胞,通过western blot方法鉴定表达的NS1蛋白;并以免疫荧光技术观察NS1在H1299细胞中的分布与定位.Western blot结果显示NS1基因编码蛋白获得表达,免疫荧光检测显示NS1蛋白主要存在于细胞核中.本研究为NS1蛋白功能和H5N1亚型AIV致病机制的研究奠定了基础.     

一株H5亚型禽流感病毒N P蛋白两个鸡M HC分子限制性T细胞表位的鉴定

为验证一株禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)中的3条T细胞表位候选肽NP89-97(PKKTGGPIY)、NP198-206(KRGINDRNF)和NP64-71(ERMVLSAF)的免疫原性,本研究构建了含有NP基因的重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,间接免疫荧光和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得表达.重组质粒免疫鸡后,用间接酶联免疫实验检测发现重组质粒在鸡体内能诱导产生相应的抗体.将多肽NP89-97、NP198-206、NP64-71和不相关肽N71-78(WRRQARYK)在体外刺激免疫后鸡的脾淋巴细胞,流式细胞术检测发现CD8+T淋巴细胞增殖分别为13.7%、11.9%、0.6%和0.4%;ELISA检测结果显示多肽NP89-97、NP198-206刺激后的淋巴细胞中IFN-γ的分泌量明显增加.本实验表明多肽NP89-97和NP198-206能在体外诱导活化的鸡淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞反应,为AIV NP的T 细胞表位.该研究结果对研究禽类抗流感病毒的免疫机制及抗流感疫苗具有重要的意义.     

H7N2禽流感病毒分离株血凝素蛋白全基因的序列分析

为进一步分析H7N2禽流感病毒（AIV）分离株血凝素（HA）基因的特性,参照已发表序列设计了1对引物,采用RT-PCR获得了1条约1.7 kb的DNA片段,测序后进行了同源性比较、HA基因系统发育进化树分析和氨基酸编码分析.结果表明,所测的2个分离株的HA基因全长1 664 bp,编码除信号肽以外的HA蛋白的全部544个氨基酸,其中包括HA1的323个氨基酸,HA2的221个氨基酸.2个分离株HA基因核苷酸序列的同源性为99.4%;与GenBank中AIV标准株A/Afri.Star./Eng-Q/983/79（H7N1）的同源性最高,分别为99.4%和99.0%;与美国A/Chicken/NewYork/13142-5/94（H7N2）株同源性很低（仅65.0%）,而与以色列、意大利H7N2 AIV的同源性较高（为96%～97%）;2个分离株在HA基因进化树中均处于H7亚型AIV的欧亚群系分支内.推导氨基酸的序列分析表明,其HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为-GR-GLF-,仅包含1个碱性氨基酸（R-）残基,符合低致病力AIV的基因特征.     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的表达及纯化

用RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒（AIV）A／Duck／Zhejiang／12／00中获得NA基因，将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-32a中，将序列测定和双酶切验证准确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导，经SDS-PAGE和Western-blot分析，结果显示，重组蛋白得到了可溶性表达，表达的蛋白质分子质量为33ku；该蛋白可以与禽流感H5N1亚型阳性血清反应，具有良好的免疫原性；ELISA检测结果表明，用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。     

HSN1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A／Goose／Guangdong／1／96（H5N1）株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中，构建重组转移载体pSY（NA＋LacZ），将其转染鸡胚成纤维细胞，经蓝白斑筛选，纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA，用其免疫SPF鸡，检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示，该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白，表达产物的分子质量约为55ku；用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后，能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明，重组禽痘病毒rFPV—NA具有良好的免疫原性。     

利用假病毒技术筛选H5N1亚型禽流感病毒中和活性单克隆抗体

为筛选H5N1禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)特异性中和抗体,本研究构建了表达HA蛋白的重组质粒,利用该重组质粒及缺失表达人免疫缺陷病病毒1型(HIV-1)囊膜蛋白基因的骨架质粒,构建了表面整合有H5亚型AIV HA蛋白的HIV假病毒。利用该假病毒系统,筛选得到一株具有中和活性的单克隆抗体(MAb)。经测定,该MAb与纯化的全病毒具有较好的反应性,其对HIV-H5HA假病毒的中和效价为64。中和试验表明该MAb能够有效阻断野生型病毒对鸡胚的感染。本研究结果为开发H5N1 AIV的被动免疫治疗方法奠定了基础,同时对亚单位疫苗的研制也具有一定的意义。     

一株鸭源H5N2禽流感病毒全基因组序列分析及对鸡的致病性研究

2012年在我国重庆市活禽交易市场进行流行病学调查时,从鸭体内分离到1株H5N2亚型禽流感病毒(AIV),DK/CQ036/12(H5N2).为了解该株H5N2亚型AIV的生物学特性,本研究对其进行了全基因组分析及对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性试验.序列分析显示:HA裂解位点序列为341R-----346TRGLF350,为低致病性AIV特征.内部基因来源较复杂,与KD/CQ/036/12分离株的M基因NP基因同源性最高的病毒株均来自H4、H7等亚型分离株,呈明显的异源性.分离株的感染性试验显示,该分离株在鸡体内可以通过呼吸道和消化道向外排毒,但并不能在鸡体内有效的复制.对小鼠的感染性试验结果显示,仅在鼻甲和肺能检测到病毒存在,其他脏器病毒滴定结果为阴性,表明病毒对鸡和小鼠均呈低致病性.