酵母α-半乳糖苷酶组成型表达基因的重组构建及转化

用PCR方法从酿酒酵母AH109中扩增出α-半乳糖苷酶MEL1基因片段，与乙醇脱氢酶组成型启动子重组后构建成表达重组质粒pGAD-GAL,将重组质粒pGAD-GAL转化不带α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母后，在预先涂布有X-α-Gal的亮氨酸缺陷培养基(SD／-Leu)平板上选择到蓝色菌落，实现了α-半乳糖苷酶在酵母内的组成型表达。     

α-半乳糖苷酶产酶菌种的定向筛选及诱变选育

从土壤样品分离、实验室保藏菌种及引进菌种共200多个菌株中，经纸层析定向筛选，获得20株具有显著产α-半乳糖苷酶活性特性的菌株。进一步以R15^#菌株为出发菌株，经^60Co诱变处理，及紫外-亚硝基胍复合诱变，得到产廿半乳糖苷酶性能稳定、活力较高的变异菌株3个，其产酶活力达231U／g以上，平均比出发菌株提高190．9％。其中RM48^#菌株经连续传代7代，产酶性能未出现较大的变异，具有较好的遗传稳定性。该菌株经鉴定为黑曲霉变种（Aspergillus niger v．Tiegh）。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时间为6 h,IPTG的最佳诱导浓度为1 mmol/L,且具有良好的热稳定性;在诱导后6 h,耐热β-半乳糖苷酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的20%,表达效率较高;对透析蛋白进行蛋白质定量,蛋白质量浓度为0.75 mg/mL,透析蛋白的耐热β-半乳糖苷酶活性为75 U/mL,比活性为100 U/mg;酶促动力学研究表明,耐热β-半乳糖苷酶的反应常数为0.398μmol/mL,最大反应速度为27.435μmol/(min.mL)。【结论】耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中得到成功表达,并且在很大程度上提高了耐热β-半乳糖苷酶的活性。     

β-半乳糖苷酶研究进展

随着生物技术的发展,β-半乳糖苷酶不仅在食品工业中的用途越来越广泛,在生物技术领域如基因工程、酶工程、蛋白质工程等方面也都发挥着重要作用,并开始广泛应用于医药等领域。文章对β-半乳糖苷酶的性质、来源、作用机理、应用情况等进行概述,着重介绍了β-半乳糖苷酶在研究上的新进展和应用上的一些新领域。     

蜡梅α-半乳糖苷酶基因的克隆和表达分析

从蜡梅中克隆α-半乳糖苷酶基因,通过对其酶学性质及基因表达分析,为研究蜡梅的低温适应的分子机理提供参考.通过PCR扩增获得α-半乳糖苷酶基金(CpGAL),构建了该基因的原核表达载体pET28a-CpGAL并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达并分离纯化得到融合蛋白.利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测CpGAL基因在腊梅不同发育时期的表达差异.     

α-半乳糖苷酶法合成α-半乳糖基-β-环糊精的研究

应用发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶法合成α-半乳糖基-β-环糊精,研究其合成工艺.通过BoxBehnken设计等方法,得出工艺条件为α-半乳糖苷酶用量73 nkat,时间28 h,pH 6.3,温度40℃,振荡速度75 r/min,反应体系包括2mL醋酸缓冲液(50 mmoL/L),β-环糊精0.4 mol/L,蜜二糖0.8...     

1株产α-半乳糖苷酶乳球菌的分离鉴定及酶学特性

从湘西富含豆粕下脚料土壤中筛选鉴定出1株产α-半乳糖苷酶细菌,对其进行显微形态观察、分子生物学鉴定及酶学特性分析.结果表明,该细菌为球形细菌,革兰氏染色阳性,16S rDNA序列与乳球菌有98%的同源性,可以确定为乳球菌属.细菌产分泌性α-半乳糖苷酶,其胞外α-半乳糖苷酶摇瓶发酵液初酶活为6.21 U/mL,在45℃、...     

产β-半乳糖苷酶芽孢杆菌的筛选及产酶条件的优化

[目的]筛选产β-半乳糖苷酶的芽孢杆菌并对其产酶条件进行优化。[方法]从土壤中筛选出一株具有β-半乳糖苷酶活性的菌株,对其进行鉴定并对其发酵产酶条件进行优化。[结果]该菌株被初步鉴定为巨大芽孢杆菌。该菌株的最佳碳源是乳糖,最佳氮源是牛肉膏和蛋白胨,Na+对产酶有明显的促进作用。当乳糖含量为1.20%,牛肉膏含量为0.63%,蛋白胨含量为1.04%时,该菌株所产β-半乳糖苷酶酶活可达3.68 U/ml。初始pH值为8.0,培养温度为45℃,接种量为2%,振荡培养17 h,该菌株所产β-半乳糖苷酶的酶活最高,为5.49 U/ml。[结论]该菌株在高温条件下生长旺盛,适宜生长pH值范围广,在生产实践中具有一定的应用价值。     

α-半乳糖苷酶及其在肉鸡日粮中的应用

[目的]综述α-半乳糖苷酶及其在肉鸡日粮中的应用。[方法]对α-半乳糖苷的结构、特性、抗营养作用机理及α-半乳糖苷酶的特性及在肉鸡日粮中的应用进行综述,并展望了其应用前景。[结果]α-半乳糖苷是无色透明状液体,甜度为蔗糖的70%,总能为8 136kJ/g,粘度低于麦芽糖,吸湿性比蔗糖小。α-半乳糖苷由半乳糖、葡萄糖和果糖组成,具有良好的热稳定性。在肉鸡日粮中添加α-半乳糖苷酶后,肉鸡日增重增加,能量代谢及养分利用率提高。[结论]该研究为进一步推进该酶制剂在肉鸡日粮中的合理应用奠定基础。     

黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ的亚细胞定位

基因枪法将经测序验证的黄瓜酸性α-半乳糖苷酶Ⅰ基因--EGFP融合表达载体导入洋葱表皮和黄瓜愈伤组织细胞,共聚焦显微镜下观察EGFP的表达情况.结果表明,该基因在包括液泡在内的整个细胞中均有表达.     

低温β-半乳糖苷酶的分离纯化

[目的]分离纯化低温β-半乳糖苷酶。[方法]采用硫酸铵沉淀、凝胶色谱和离子交换色谱对低温菌株Rahnella aquatilis sp.14-1在摇瓶条件下的所产低温β-半乳糖苷酶进行了纯化,并对提纯的酶进行了酶学性质的研究。[结果]摇瓶发酵液经过超声波破碎细胞得到粗酶液体,用硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-25凝胶层析和DEAE-cellulose离子交换色谱分离纯化得到低温β-半乳糖苷酶,用SDSPAGE检测显示电泳单一区带,纯化的酶分子量为60 kD。[结论]研究可为低温β-半乳糖苷酶的开发应用提供参考依据。     

植物β-半乳糖苷酶研究进展

植物β-半乳糖苷酶是一类糖苷水解酶,能够从β-D-半乳聚糖或寡聚糖支链非还原末端切除β-D-半乳糖残基。β-半乳糖苷酶广泛分布于各种植物中,通过对细胞壁的重塑参与植物生长发育过程。总结了植物β-半乳糖苷酶生化与分子生物学方面的最新研究进展,并就其结构域及催化机制、生化特性、亚细胞定位和表达模式、生理功能等方面展开详述。     

从发芽咖啡豆中分离纯化α-半乳糖苷酶的研究

[目的]研究从发芽咖啡豆中分离纯化α-半乳糖苷酶。[方法]通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱和Sephacry1 S-200-HR凝胶过滤色谱等分离纯化技术,从发芽咖啡豆中分离纯化a-半乳糖苷酶。SDS-PAGE用来分析该酶的纯度和分子量。[结果]经过3步分离纯化之后,发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的比酶活达到191.50 nkat/mg,纯化倍数为23.18倍。与绿咖啡豆α-半乳糖苷酶相比,发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的比酶活较高,但产率和总的提取率都较低。SDS-PAGE分析结果表明,该酶出现单一谱带,分子量为3 8805 D。[结论]发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶产量和总提取率的提高有待进一步的研究。     

低温β-半乳糖苷酶的研究进展

低温β-半乳糖苷酶在低温下仍保持高酶活,而具有高活性的低温β-半乳糖苷酶应用于环境工程和食品行业,有着中温和高温β-半乳糖苷酶所没有的优越性,尤其在乳品工业,可在低温下水解乳糖,生产无乳糖乳制品,供乳糖不耐受者食用.而低温β-半乳糖苷酶因其具有的理论和应用上的双重意义,成为近年来的研究热点.综述了微生物低温β-半乳糖苷酶的研究现状,包括酶的微生物来源,分离筛选、分类特征、酶学性质、分子结构及定向进化,并对其前景进行了展望.     

黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶发酵条件优化

[目的]优化黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶的发酵条件。[方法]采用单因素试验和正交试验相结合的方法优化了黑曲霉液体发酵产α-半乳糖苷酶的发酵条件。[结果]单因素试验结果表明,以蔗糖为碳源的黑曲霉生长最好,所产酶的活力最高,最佳碳源浓度为15g/L;蛋白胨浓度为15g/L时黑曲霉干重最大,蛋白胨浓度为10g／L时所产酶的活力最高;pH值为5时黑曲霉的生物量最大,pH值为4时所产酶的活力最高;培养温度为30℃时,所产酶的活力最高。最佳培养基组成为葡萄糖20g／L＋蛋白胨5g/L＋MgSO4 0．05g/L＋KC10．5g/L＋K,HPO4 1g/L＋FeSO4 0．5g/L。当pH值为5,发酵温度为25℃,孢子接种量为10^6cfu/ml,发酵时间为96h时,培养基上黑曲霉产α-半乳糖苷酶的活力最高,达到（3．250±0．035）U／ml。[结论]该试验为仪一半乳糖苷酶的工业化生产提供了参考依据。     

地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆及序列分析

β-葡聚糖是以β-1,3和β-1,4混合糖苷键连接形成的D-葡萄糖聚合物,主要存在于单子叶禾本科谷实中.有些微生物会产生降解β-葡聚糖的β-1,3-1,4-葡聚糖酶.将β-葡聚糖酶基因在食品级宿主菌中表达对动物饲料工业具有十分重要的应用价值.实验以地衣芽孢杆菌为材料,提取其总DNA,扩增其β-1,3-1,4葡聚糖酶基因序列,将该片段克隆到pMD 19-T载体进行测序,并将测序结果进行BLAST比对.发现其与GenBank中的两段基因序列具有较高的同源性.     

金针菇菌根α-半乳糖苷酶在豆乳粉中的应用

利用金针菇菌根含有α-半乳糖苷酶,且该酶可以水解豆乳中寡糖这一特性,以金针菇菌根、大豆为主要原料,通过粉碎、浸提、过滤、调配、均质、喷雾干燥等步骤来制备金针菇豆乳粉。以还原糖含量和感官评分为指标进行单因素试验,并在单因素试验的基础上,以感官评分为响应值,进行响应面优化试验来确定金针菇豆乳粉的最佳工艺参数。结果表明,最佳工艺参数为:大豆与水的料液比1∶4(g/m L)、金针菇菌根粗酶液与豆乳的体积比3∶7、金针菇菌根粗酶液与豆乳的反应时间3 h、金针菇菌根粗酶液与豆乳的反应温度40℃、单甘酯添加量0.010 g/m L、麦芽糊精添加量0.20 g/m L、喷雾干燥进口温度177℃。在此条件下,制得的产品寡糖含量较低,溶解状态良好,品质优良,风味独特。     

一种海洋来源蜡样芽孢杆菌α-半乳糖苷酶基因的克隆表达及功能鉴定

为获得高效的α-半乳糖苷酶并了解其功能,采用基因工程技术,从鹿角菜中筛选获得的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus中克隆得到一个新的α-半乳糖苷酶基因(BcgalA),并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功进行了重组表达。结果表明:BcgalA基因序列编码441个氨基酸,预测的BcGalA蛋白相对分子质量约为50 380,生物信息学分析显示,该酶属于GH4家族;酶活试验表明,在37℃、pH 8.0条件下该酶水解4-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(pNP-α-Gal)、棉子糖的比活力分别为(1.498±0.034)、(0.261±0.012)U/mg,但对半乳甘露聚糖无水解活性。研究表明,本研究中克隆表达的BcGalA是一种属于GH4中仅对低分子量底物起作用的α-半乳糖苷酶,为探究GH4α-半乳糖苷酶的结构与功能关系提供了样本。