家蚕杆状病毒载体构建及外源基因的表达

本文介绍了杆状病毒载体构建方法,分析了影响外源基因表达效率的因素,概述了近年来家蚕杆状病毒栽体在蚕体内表达外源基因产物所取得的成绩,并指出了这一系统存在的问题,提出了改进意见.     

猴B病毒gB基因杆状病毒表达载体的构建

根据B病毒E2490株(基因序列AF533768)人工合成猴B病毒gB基因,通过XbaI和EcoRI特异性酶切,将其亚克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切及测序鉴定,表明构建了猴B病毒gB基因杆状病毒表达重组质粒pFastHTA-gB。在此基础上,重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经平板抗性筛选,PCR鉴定,表明获得了转座的杆粒,为下一步进行昆虫细胞的转染和以猴B病毒gB蛋白为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。     

口蹄疫多基因杆状病毒转移载体的构建

采用分步 PCR扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因 P1 ,非结构蛋白基因 2 A、2 B、3 C蛋白酶和 3 D聚合酶按正确的读码框依次连接克隆入 p GEM-T载体。然后 ,将切取的目的基因亚克隆入杆状病毒转移载体 p Mel Bac B。构建成功的重组 p Mel Bac B/P1 2 X3 C3 D转移载体经测序鉴定 ,含有完整的目的基因表达盒 ,转移载体可与杆状病毒骨架载体进行昆虫 sf9细胞内同源重组 ,以产生重组杆状病毒     

NDV融合蛋白裂解位点基因的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建与鉴定

将新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株和ＬａＳｏｔａＥ４株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因从本实验室构建的重组质粒ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ中用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ切出。将这２个毒株的Ｆｃ基因定向克隆入昆虫杆状病毒表达载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株的Ｆｃ基因克隆ｐＸ３Ｆ４６Ｆｃ和ｐＸ３ＬａＦｃ。重组质粒用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ酶切法、ＰＣＲ和核酸探针法进行了鉴定，证明插入的基因来自ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵ－ＣＬａＦｃ，插入的位置和方向都正确。这２个载体的构建为Ｆｃ基因在昆虫细胞系统的表达创造了条件。     

用杆状病毒载体系统表达禽畜传染病病毒基因研究概况

用杆状病毒载体系统表达禽畜传染病病毒基因研究概况陈茹（广州动植物检疫局，５１００１０）杆状病毒（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）属杆状病毒科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ），因病毒粒子呈杆状而得名，是一环状双链ＤＮＡ病毒，基因纽约为１３０Ｋｂ。本科下分两个亚科...     

人胰岛素基因杆状病毒表达载体的构建及其在Sf9细胞中的表达

对人胰岛素基因真核表达载体（pCMA／mINS）进行Xho I酶切，回收的含人胰岛素基因组基因的1608bp片段与线性化的杆状病载体pFast Bac I进行连接，获得重组载体pFast/mINS。将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌，在体内进行重组，并经2次抗性与蓝白斑筛选，得到杆状病毒重组载体Bacmid/mINS。将该载体转染Sf9细胞，获得了重组杆状病毒，经Tricine-SDS-PAGE和Western-blotting检测，重组杆状病毒在Sf9细胞中的表达产物是胰岛素原，而细胞培养上清中未检测到胰岛素和胰岛素原。     

构建重组昆虫杆状病毒载体的新策略

分析了板栗贮藏过程中乙烯产率、呼吸速率、淀粉酶和过氧化物酶活性的变化情况，阐明了板栗萌发的生理生化特性。     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞     

宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达

通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。     

NDV融合蛋白裂解位点基因的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建…

将新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株和ＬａＳｏｔａＥ４株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因从本实验室构建的重组质粒ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ中用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ切出。将这２个毒株的Ｆｃ基因定向克隆入昆杆状病毒表达载体ｐＳＸＩＶＶＩＸ３的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ位点之间，获得２个毒株的Ｆｃ基因克隆ｐＸ３Ｆ４６Ｆｃ和ｐＸ３ＬａＦｃ。重组质粒用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ，ＰｓｔＩ酶切法，ＰＣＲ和核酸探针法进行     

鸡TBX6过表达和干扰载体构建及干扰载体效率检测

研究旨在构建TBX6的过表达和干扰载体,为后续研究TXB6在精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）形成过程中的功能奠定基础。通过qRT-PCR检测TBX6在胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和SSCs的表达水平,根据NCBI上提供的TBX6 CDS区的序列,设计引物扩增目的片段,将其连接到经线性化的慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro上,构建TBX6的过表达载体;同时,根据TBX6 CDS区设计三个干扰靶点,在退火后将其连接到经线性化的干扰载体pLVX-shRNA2-puro上,并且进一步将三个干扰载体转染鸡成纤维细胞系（DF-1）,观察荧光表达情况并通过qRT-PCR检测其干扰效率。结果显示,TBX6在SSCs上的表达量显著高于ESCs(P<0.05),测序和双酶切验证显示成功构建TBX6过表达及干扰载体;干扰载体转染DF-1细胞后均能稳定表达EGFP荧光蛋白,且shRNA2-TBX6的干扰效果最好。结果表明,TBX6过表达及干扰载体构建成功,且经定量检测后确定shRNA2-...     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB、gE基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

本试验用PCR方法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型(bovine herpesvirus-1,BHV-1)Bartha Nu/67株gB、gE基因片段,将其克隆到pGEM-T-easy载体。经转化、筛选、鉴定后将重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHTb连接,得到了重组质粒pFBHgB、pFBHgE。经酶切和测序鉴定后,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性、蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到了含gB、gE基因的重组穿梭载体。     

口蹄疫病毒多基因片段的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

根据定点突变原理获得了包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段，经SpeⅠ和HindⅢ双酶切后，与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHT连接，得到了重组质粒pFB-P12X3C3D。经酶切和测序鉴定后，将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac，经抗性及蓝白斑筛选，得到了含P12X3C3D多基因的重组穿梭载体，将其命名为Bacmid-P12X3C3D；提取其DNA并转染Sf9昆虫细胞，最后获得含口蹄疫病毒P12X3C3D多基因的重组杆状病毒。     

PRRSV变异株ORF6基因重组杆状病毒的构建及其在昆虫细胞的表达

参照GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)XH-GD株ORF6(M蛋白)基因序列,设计合成了一对引物,扩增PRRSV ORF6基因.将该基因克隆于转移质粒载体pFcDNA3.1(+)中,获得重组转移质粒pFcDNA3.1-ORF6并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-ORF6,再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBacmid-ORF6,经PCR鉴定证实目的基因正确地插入到杆状病毒基因组的CMV启动子下游;经过问接免疫荧光试验(IFA)检测,M蛋白在SD细胞中得到了表达,而且表达的产物具有特异免疫学反应性.     

杆状病毒载体灭活方法的研究进展

杆状病毒表达系统作为重要的真核表达系统,有其独特的优势。近些年,将重组杆状病毒灭活后制备疫苗的研究越来越多,本文综述了杆状病毒系统表达流程,以及利用甲醛和β-丙内酯（BPL）这两种常见的病毒灭活剂灭活杆状病毒,并对其安全性进行分析。