产肠毒素大肠埃希菌主要黏附素的研究进展

产肠毒素大肠埃希菌的主要黏附素抗原有K88、K99、987P和F41,在发病学和免疫学上扮演着重要的作用.文章就其理化特性、生物学特性、分子生物学特性及主要检测方法进行综述.     

猪MyD88基因的原核表达

采用PCR方法从pGEM-pMyD88重组质粒中克隆了猪MyD88分子全长基因,构建了无信号肽序列的原核表达载体pET-30a-pMyD88-ED,在不同IPTG浓度和时间下进行诱导表达,利用切胶洗脱法纯化表达的融合蛋白。结果表明,在IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L,诱导时间为6 h时表达量达到最大,SDS-PAGE分析表明表达出约35 ku的融合蛋白,主要以包涵体的形式存在;通过切胶纯化后,融合蛋白的纯度可达90%;Western blot分析显示,表达的融合蛋白能被抗His标签的单克隆抗体识别,说明目的蛋白在大肠埃希菌中得到了成功表达。     

牦牛大肠埃希氏菌的肠毒素试验

从自然病死牦牛体内分离出3株大肠埃希氏,用改良Mundell产毒液体培养基分别培养,培养物经高速离心,过滤,使用滤液做兔回肠结扎试验,乳鼠灌胃试验和大鼠回肠环袢试验.结果表明3株大肠埃希氏菌均产生肠毒素,阐明了牦牛腹泻的病因.     

大肠埃希氏菌F18菌毛FedF蛋白的表达与鉴定

根据已发表的F18菌毛F亚单位的基因序列(fedF)设计了1对引物．利用PCR技术分别扩增到F18ab和F18ac菌毛的fedF编码序列，并按预定的阅读框架分别插入表达载体pGEX-6p-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游，获得重组质粒pPFedF／ab与pPFedF／ac，然后转化大肠埃希氏菌BL21获得重组菌PPFedF／ab与PPFedF／ac。测序结果表明，fedF编码序列大小均为837bp，与GenBank中登录的EedF结构编码序列(Z26520)大小一致。通过对菌体裂解物进行SDSPAGE电泳分析以及Western-blotting鉴定，证明重组大肠埃希氏菌PPFedF／ab与PPFedF／ac均可以表达融合蛋白形式的FedF(分别命名为GST-FedF／ab与GST-FedF／ac)。     

大肠埃希菌热敏性肠毒素B亚基研究进展

产肠毒素大肠埃希菌(EnterotoxigenicE.coil,ETEC)是引起幼畜、婴幼儿及旅游者腹泻的重要病原之一。ETEC产生两类肠毒素,一种是对热敏感的热敏性肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT),另一种是对热不敏感的耐热性肠毒素(heat-stable enterotoxin,ST)。LT不仅是ETEC主要的毒力因子,而且还是一种重要的黏膜佐剂,它由A、B亚基组成,由于LT A具有毒性作用,限制了LT作为黏膜免疫佐剂的应用;而LT B无毒且具有黏膜佐剂活性,使其成为备受关注的佐剂之一。近年来对LT B的结构、介导的免疫调节分子机制、突变体及其佐剂作用已进行了较为深入的研究,为充分利用LT B的黏膜免疫佐剂功能奠定了基础。     

ETEC K88菌毛蛋白抗体PPA-ELISA检测方法的建立

以纯化的大肠埃希菌K88菌毛蛋白为包被抗原,建立了检测大肠埃希菌K88IgG抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA的最适反应条件,即最佳抗原包被浓度为1μg/mL,兔抗体稀释倍数为1∶10,猪抗体稀释倍数为1∶100,确定最佳封闭液为50g/L脱脂奶粉,最佳封闭时间为0.5h,血清反应时间0.5h,二抗反应时间1h,底物室温反应时间为15min,阴阳性临界值兔血清为0.33、猪血清为0.45。证实该间接PPA-ELISA方法特异性强、重复性好、敏感度高,可以作为疫苗效力检验和流行病学调查的参考方法。     

抗鸡致病性大肠埃希氏菌O88单克隆抗体的研究

用纯化的鸡致病性大肠埃希氏菌Ｏ８８菌株（ＭＧ３８ｅ）热灭活抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ雌性小鼠,再用该菌株粗提的脂多糖尾静脉注射加强免疫后,取其脾细胞与ＳＰ２／０细胞融合,经有限稀释法克隆,用间接ＥＬＩＳＡ及凝集试验（ＩＨＴ）筛选,获得４株能稳定分泌该菌株单克隆抗体的杂交瘤细胞。哪样我瘤细胞培养液ＥＬＩＡＳ和ＩＨＴ效价分别为１：１００～１：１０００和３ｌｏｇ２～４ｌｏｇ２;腹水效价分别为１：１００～１：４     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902（K88ac,ST^ ,L^ )的攻击，用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ST1的毒性，这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达

应用PCR从产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）中扩增出不含信号肽序列的K99菌毛蛋白基因片段，克隆测序后，将该片段连接到E.coli表达载体pET28a( )中，转化E.coli表达菌株BL21（DE3），筛选得到可诱导表达K99抗原的工程菌株。经IPTG诱导，分离纯化K99重组蛋白，以其免疫新西兰大白兔，获得重组蛋白的兔抗血清；免疫印迹分析表明，此重组蛋白制备的抗血清能与标准的K99强毒株姓明显的抗原抗体反应。     

华东地区部分猪源大肠杆菌K88黏附素的生物学特性

近年来，从华东地区患腹泻仔猪中分离到一些表达K88菌毛的大肠杆菌，这些菌株只与K88a因子单抗反应，而不与b、c、d因子单抗反应。通过K88常规血清交叉吸收试验、SDS-PAGE、Western印迹，表明这些菌株不仅与K88ac参考菌株C83907制备的c因子血清反应，而且与以分离株SEC586制备且经K88ab、K88ac、K88ad参考菌株吸收后的血清也反应。对分离株SEC586、SEC464的K88主要亚单位结构基因faeG的克隆、测序，发现该基因由846对核苷酸组成，编码菌毛主要亚单位的262个氨基酸及21个氨基酸的信号肽，比国外报道的K88ac FaeG亚单位（263个氨基酸）少了1个氨基酸，比K88ab、K88ad（265个氨基酸）少了3个氨基酸。SEC586、SEC464菌株的FaeG亚单位氨基酸序列的同源性为97．7％，它们与K88ac的同源性为94．7％和96．2％；与K88ab的同源性为90．1％和91．2％；与K88ad的同源性为87．0％和88，6％。结果表明，新分离的K88ac大肠杆菌黏附素主要亚单位已发生了部分变异。     

大肠杆菌黏附素蛋白与热稳定肠毒素融合基因植物表达载体的构建

利用DNA重组技术,将编码大肠杆菌黏附素蛋白K 88ac与热稳定肠毒素ST II的融合基因的序列片段克隆到植物表达载体pB in48中,成功地构建了植物重组表达质粒pB in48-K 88-ST,并将其转化到农杆菌EHA 105中,为K 88ac-ST II基因的进一步研究奠定了基础。     

兔出血症病毒主要结构蛋白基因的克隆、原核表达及其免疫原性鉴定

本试验采用RT-PCR方法扩增了兔出血症病毒(rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后,进行序列测定,将测序正确的纯化产物双酶切,克隆入原核表达载体pET28b(+)中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E.coli Rosetta^TM,用IPTG诱导培养重组表达菌。经SDS-PAGE分析,在分子质量62.0 ku处可见明显的表达带,经Western blotting检测,约在62.0 ku处出现特异性的反应带。结果表明,表达蛋白具有良好的抗原性。     

副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的分段表达及其免疫原性分析

本研究旨在获得副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物(TbpA),并对其免疫原性进行分析鉴定.采用生物信息学方法预测HPS的TbpA抗原表位,根据GenBank上发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成3对引物,用PCR从安徽省HPS分离株(LJ3) tbpA中分段扩增出tbpA1、tbpA2和tbpA3,并连接到pET-32a(+)载体上,经BamH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)中,进行IPTG诱导表达.利用SDS-PAGE检测目的蛋白,Western blotting分析重组蛋白的免疫活性;通过小鼠免疫攻毒保护试验和血清杀菌力试验,鉴定重组蛋白的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力.结果表明,从HPS(LJ3)tbpA中扩增出与预期设计的1140、897、666 bp大小相符的3个片段(tbpA1、tbpA2、tbpA3),扩增产物连接载体得到重组质粒,在大肠杆菌中实现表达,获得大小为62、54、44 ku的目的蛋白(rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3),均能与HPS阳性血清反应.rTbpA1与甲醛灭活菌体对小鼠免疫攻毒的保护率分别为20％和40％,但rTbpA1引起小鼠平均死亡时间显著延迟,兔抗rTbpA1与兔抗HPS(LJ3)血清具有同样显著的杀菌活性.结果显示,成功表达的rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3均具有良好的反应原性,其中rTbpA1更具有良好的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力,可望成为副猪嗜血杆菌病疫苗和血清学检测的候选成分.     

空肠弯曲菌peb1A基因的克隆表达及免疫原性分析

根据空肠弯曲菌基因序列设计引物,以菌株ATCC 29428为模板扩增出peb1A基因片段,定向克隆至pMD18-T载体中,并对克隆片段测序,比较所测序列与不同来源弯曲菌的同源性;用软件改造并合成peb1A基因78 bp～780 bp区间片段,PCR扩增后,构建出表达载体pET-28a(+)-peb 1Ag,转化至E.c...     

弓形虫胚层发育相关蛋白的原核表达及免疫原性研究

试验旨在研究弓形虫胚层发育相关蛋白（TgERP）的免疫原性,以弓形虫RH株的基因组DNA为模板,扩增TgERP基因,将其连接于表达载体pET-30a(+)后,转化至Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达,应用Western blotting对重组蛋白的反应原性进行分析,并用纯化后的TgERP蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果显示,在37 ℃条件下用1.0 mmol/L IPTG诱导6 h表达可溶性TgERP蛋白的量最大。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子质量为16.7 ku,以可溶形式表达,纯化后蛋白条带单一。经Western blotting分析,TgERP蛋白有较好的反应原性;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶51200,表明该蛋白具有较好免疫原性。提示,TgERP蛋白可作为血清学诊断方法的候选抗原和弓形虫病疫苗的候选分子,为建立弓形虫新型诊断方法和研制新型弓形虫疫苗奠定了基础。     

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性,为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象,运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因,构建原核表达载体pET-32a （+）-P48,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48,纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a （+）-P48,重组蛋白P48大小约为66 ku,纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应,血清抗体滴度达到较高水平（D_{450 nm}值为1.126）。Western blotting结果显示,抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应,表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性,可作为牛支原体新型疫苗的候选基因,且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高,亲缘关系较近。