中草药防治鸡球虫病的机制及应用策略探讨

鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的严重为害养禽业的一类重要的寄生虫病.使用化学药物防治鸡球虫病易使球虫产生耐药性,且存在药物残留高、毒副作用大等缺点,直接损害人们身体健康.而中草药防治具有毒副作用小、药物残留少、免疫效果好、增强机体免疫能力及促进生长发育等优势.为促进中草药防治鸡球虫病技术的发展,总结了中草药防治鸡球虫病的...     

重组猪胸膜肺炎放线杆菌NLPI蛋白诱导小鼠抗攻击感染的免疫保护力研究

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是猪(Sus scrofa)的一种呼吸道疾病,影响世界养猪业,其病原菌为猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP),现有疫苗由于保护效果不甚理想,因此有必要寻找新的疫苗候选分子。本研究检测了猪APP重组NLPI蛋白(recombinant NLPI,rNLPI)的免疫保护作用。根据Gen Bank中已报道的APP nlpi基因序列设计引物对,然后以APP的基因组为模板PCR扩增nlpi基因,测序后进行生物信息学分析,发现该基因(Gen Bank No.:MH027649)由900 bp组成,编码1个含299个氨基酸的蛋白质,为一外膜脂蛋白,此外膜蛋白在多种APP血清型之间具有很高同源性。将nlpi基因亚克隆至p ET32a(+)载体,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达APP rNLPI,并经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)和蛋白质印迹(Western blot,WB)确认。结果表明,在34 k D处有特异性条带,可被相应的阳性血清识别。动物保护实验采用BALB/c小鼠(Mus musculus)进行,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)用于测定免疫球蛋G(immunoglobulin G,IgG)抗体滴度。结果表明,弗氏不完全佐剂+50μg rNLPI、弗氏不完全佐剂+30μg rNLPI、弗氏不完全佐剂+10μg rNLPI、30μg rNLPI免疫后,可诱导小鼠分别产生40%、20%、10%和20%的存活率;佐剂组和生理盐水对照组存活率为0。幸存小鼠慢慢恢复健康,并正常采食。可见,rNLPI皮下免疫可诱导小鼠产生免疫应答和较高的抗攻击感染的免疫保护力。该研究结果为进一步筛选猪传染性胸膜肺炎分子疫苗积累了基础资料。     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白是禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a（＋）-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B（DE3）中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

捻转血矛线虫ZJ株15kD分泌排泄蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

捻转血矛线虫主要寄生于反刍动物尤其是绵羊的胃内，可引起宿主贫血，抵抗力下降甚至死亡，周期性服药和粪检是当今主要控制方法。但耐药株的出现影响了这种策略的效果，因此人们正致力于疫苗的研究（Knox and Smith，2001）。捻转血矛线虫ES抗原具有双重免疫学功能，一方面，ES抗原与宿主免疫系统直接接触，是最容易刺激机体产生免疫反应的抗原，因而是制备免疫原的理想材料（Bakker et a1．，2004）。另一方面ES抗原是灵敏度特异性强的检测抗原，可测出自然感染1～2条以上捻转血矛线虫的抗体且不与其它虫的抗体发生反应。     

草甘膦人工抗原合成及鼠源多抗血清制备

为检测小分子农药草甘膦(PMG)的残留,本研究合成草甘膦[N-(Phosphonomethyl)glycine PMG]人工抗原,通过免疫制备高敏感性、特异性的鼠源PMG多克隆抗血清;采用EDC法将PMG分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成免疫原PMG-BSA和包被原PMG-OVA;经紫外扫描、SDS-PAGE电泳、质谱鉴定后,免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清;利用间接ELISA法测定多抗血清效价,竞争ELISA测定多抗血清的敏感性和特异性。结果表明,所合成的免疫抗原效果较好,免疫的4只小鼠效价均达1∶104以上,4号小鼠的多抗血清敏感性最高,半数抑制浓度IC50为31.4μg·m L-1,与其他有机磷类农药无交叉反应,具备良好的特异性。本试验成功合成了PMG人工抗原,并制得了敏感性高、特异性好的鼠源多抗血清,为PMG单克隆抗体制备及其免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

含CSFV T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的表达及小鼠免疫试验

将纯化的重组子pM-VP2-E290阳性质粒利用杆状病毒表达系统进行表达,表达产物应用SDS-PAGE、Western blot和Dot ELISA进行分析,确定所表达的蛋白分子量大小约为67kD,且具有天然蛋白的抗原特异性。应用免疫电镜对表达产物进行观察,可见到细小病毒样颗粒。病毒样颗粒在无免疫佐剂参与的情况下,免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,同时设猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)的灭活疫苗免疫组及磷酸盐缓冲液(PBS)接种组作为参比对照,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明,表达蛋白所形成的细小病毒样颗粒,不仅能诱导小鼠机体产生抗猪瘟病毒的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,还能刺激小鼠产生高效价的抗猪细小病毒的特异性抗体,而且机体所产生的抗体效价显著高于灭活疫苗对照组。     

鸭瘟病毒gB蛋白N端抗原域的高效表达及其免疫特性初步研究

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因, 克隆至表达载体pET32a中, 构建了原核表达质粒pET-gB1。将pET-gB1转化至感受态E. coli BL21(DE3) 中, 经IPTG诱导和SDS-PAGE 分析, 可见约42.4kDa 的目的蛋白以包涵体形式表达。Western blotting 分析发现, 表达产物与抗鸭瘟的鼠阳性血清发生特异性反应。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中, 利用His•Bind试剂盒获得纯化的蛋白, 将纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠, 间接ELISA法测得抗体的效价, MTT 法检测免疫小鼠的T 淋巴细胞增殖反应能力。结果说明该融合蛋白能够诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫。     

马γ-干扰素单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

摘要：将原核表达的重组马-干扰素成熟蛋白（mEIFN-）免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以昆虫杆状病毒表达系统获得的重组马-干扰素作为检测抗原进行间接ELISA检测,共筛选到15个阳性细胞株。分别经过3轮亚克隆后,最终得到了12株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用间接免疫荧光（IFA）实验对12株单克隆抗体进行鉴定,结果证实所获得的12株细胞分泌的抗体均为针对马-干扰素的特异性抗体。单克隆抗体亚型鉴定结果显示,4株为IgG1、2株为IgG2a、3株为IgG2b、3株为IgM,而且所有单克隆抗体的轻链均为链。将此12株单克隆抗体分别与用原核系统分节段表达的重组马-干扰素GST-mEIFN-(1-84)、GST-mEIFN-(80-146)蛋白进行特异性ELISA检测,结果表明有7株单克隆抗体识别GST-mEIFN-(1-84),而另5株单克隆抗体与GST-mEIFN-(80-146)发生反应,说明所获得的12株单克隆抗体至少针对两个或两个以上不同的抗原表位。这将为今后建立马-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。     

含CSFV T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的表达及小鼠试验免疫研究

摘要：纯化的重组子pM-VP2-E290阳性质粒，与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞sf9，通过同源重组，形成具有感染活性的重组杆状病毒，并利用重组病毒的LacZ表型进行噬斑纯化。纯化后的高效价重组杆状病毒在昆虫细胞中进行表达，表达产物应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹（Western-blot）和免疫酶斑点技术（Dot-ELISA）进行分析，确定所表达的蛋白分子量大小约为67KD，且具有天然蛋白的抗原特异性。应用免疫电镜对表达产物进行观察，可见到细小病毒样颗粒。病毒样颗粒在无免疫佐剂参与的情况下，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，同时设PPV的灭活疫苗免疫组及PBS接种组作为参比对照，检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明，表达蛋白所形成的细小病毒样颗粒，不仅能诱导小鼠机体产生抗CSFV的特异性CTL反应，还能刺激小鼠产生高效价的抗PPV的特异性抗体。而且机体所产生的抗体效价显著高于灭活疫苗对照组。     

溴氰菊酯残留酶联免疫分析方法的建立

在前期设计合成了溴氰菊酯半抗原（DM）和人工抗原（DM-BSA和DM-OVA）的基础上,进一步利用人工抗原（DM-BSA）免疫新西兰大白兔获得了溴氰菊酯多克隆抗体。研究表明,新西兰大白兔产生的抗体对溴氰菊酯产生了灵敏的特异性免疫反应,所得多克隆抗体的效价为25600。以DM-OVA为包被原建立溴氰菊酯间接竞争ELISA检测方法,确定了抗原抗体最适工作浓度均为1∶12800。在含10%甲醇、pH7.4、盐浓度0.1mol·L^-1的缓冲液条件下制作了溴氰菊酯的标准抑制曲线,抑制中浓度IC50为3.999μg·mL^-1,检出限IC10为0.023μg·mL^-1,检测范围为0.015-100μg·mL^-1。抗体对包括氯菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯在内的8种菊酯类农药的交叉反应率较低,在苹果中的添加回收率为86.2%-105.8%。成功制备出溴氰菊酯特异性抗体,并建立了水果中溴氰菊酯残留间接竞争酶联免疫分析方法。     

灭蝇胺抗原抗体在豇豆、韭菜、芹菜快速检测中的应用研究

本研究设计并合成了灭蝇胺半抗原,制备得到灭蝇胺完全抗原,并通过动物免疫与细胞融合单克隆筛选技术,成功获得灭蝇胺单克隆抗体,IC50达到5.3μg/L。将完全抗原和单克隆抗体应用于金标免疫层析试纸制备,经优化相关参数,获得一种高灵敏度、高特异性、简便快速的检测方法。将方法应用于豇豆、韭菜、芹菜（以下简称“三棵菜”）样品检测,检测结果与仪器参比方法检测结果的符合率达93.3%。结果表明,建立的“三棵菜”中灭蝇胺金标试纸快检方法具有良好的准确度,可实现定性、半定量检测分析,能在15 min内完成样品检测,并具备小型化、操作方便的特性,可为农药残留现场快速筛查提供技术支持。     

积极加强脑保健

人到老年,伴随着机体老化,各种免疫功能 下降,人体的重要器官--脑也开始老化、萎 缩、体积缩小。于是出现记忆力减退,反应迟 钝,甚至老年性痴呆。不过,如能注意脑保健, 是可以延缓脑老化的。 脑保健有以下几个要点。 1、加强锻炼,增加脑组织细胞氧的供给。锻 炼被人们誉为最廉价和有效的预防疾病、延缓 衰老的处方。俗话说,生命在于运动。老年人可 根据自身体质、爱好,选择适当的运动项目进行     

鸡γ-干扰素基因的克隆与鉴定

干扰素是动物机体内复杂的免疫网络中起调节作用的重要细胞因子之一.在体内广泛参与免疫调节及炎症反应等生物过程,具有十分重要的生理功能.目前已有一大批人和动物的干扰素基因被克隆.以重组干扰素作为免疫调节剂及基因治疗剂已显示出广泛的应用前景,成为重要的学科增长点之一.     

基于双功能螯合剂NOTA的重金属铜人工抗原的合成与鉴定

为研究杂环类双功能螯合剂在重金属铜人工抗原制备方面的效果,以2-S-(4-氨基苯)-1,4,7三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(P-NH_2-Bn-NOTA,简写为NOTA)为双功能螯合剂,采用戊二醛法将重金属铜离子分别与载体蛋白BSA、OVA偶联制备免疫原和包被原,并用合成的免疫原免疫制备免多克隆抗体,建立间接竞争ELISA(ic-ELISA)。结果表明,所建立的ic-ELISA线性回归方程为y=7.8632Ln(x)+9.6765(R2=0.9934),IC50和IC20值分别为168.70、3.72 ng·m L-1。交叉反应试验结果显示,除与锌交叉反应率达16%外,该抗体与其他重金属铁、铅和镉的交叉反应率均小于5.6%。本研究成功合成了重金属铜人工抗原并制备了兔多克隆抗体,为杂环类双功能螯合剂应用于重金属快速检测技术奠定了理论基础。     

大片吸虫分泌排泄抗原的分析

取广西牛源大片吸虫成虫制备出分泌排泄（ＥＳ）抗原，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，考马斯亮蓝染色显出７条蛋白带。免疫印迹试验（ＥＩＴＢ）测出其主要特异性免疫成分分子量为３６．３，２８．５及２５．５ｋＤａ，其中２８．５与２５．５ｋＤａ与法国肝片吸虫ＥＳ的部分抗原成分相同。两种片形吸虫与抗血清可以交叉使用无特异性，但与日本血吸虫抗原及抗血清均无交叉反应，人工感染大片吸虫２周后的兔血清即能识别此抗原。ＥＳ抗原提取方法简便，特异性好，敏感性高，可用于片形吸虫病免疫诊断。     

抗链霉素单克隆抗体的制备和鉴定

用CDI法合成链霉素全抗原 ,免疫BALB c小鼠 ,采用杂交瘤技术得到了一株能稳定分泌抗链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞。经ELISA鉴定 ,SM McAb为IgG1类 ;细胞培养上清的效价达 1 0 4以上 ,腹水的达 1 0 8以上 ;与双氢链霉素交叉反应率为 2 0 0 % ,与庆大霉素、卡那霉素无交叉反应。     

抗鸡贫血病毒结构蛋白单克隆抗体制备及其对应抗原表位分析

以纯化的原核表达的鸡贫血病毒结构蛋白为抗原，免疫6-8w的雌性Balb/c鼠, 经过三次免疫后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，以纯化的蛋白为抗原进行ELISA检测，将阳性细胞孔经过三次有限稀释，共获得6株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。间接免疫荧光试验证实6株单抗可以与鸡贫血病毒感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应，Western blot结果显示单抗与杆状病毒表达的VP1重组蛋白可以发生特异性反应。利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行亚型鉴定，结果表明6株单抗均为IgG1亚型，且所有单抗的轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析，初步鉴定了筛选出的单抗所对应的抗原表位，其中有四株单抗识别的表位位于VP1 218-274位氨基酸之间，另外两株单抗识别的表位分别位于275-301位、324-369位氨基酸之间。     

细粒棘球蚴生发层细胞系可溶性抗原的免疫学及SDS-PAGE分析

本研究报道了细粒棘球蚴生发展细胞可溶性抗原的免疫学研究结果及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果，将原头节可溶性抗原，生发展可溶性抗原，囊液抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠制备抗血清并用原头节人工感染Ｂａｌｂ／ｃ小鼠制备阳性鼠血清，再用生发展细胞系可溶性抗原以间接ＥＬＩＳＡ法进行检测以观察该抗原的反应原性；用ｐＡｇ，ｇＡｇ，ＳＨＦ以及生发展分泌抗在分别对曾反种过细胞系细胞的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠的血清进行检测，以了解细胞系抗原     

食物蛋白致敏成分检测技术研究进展

食物过敏是指所摄入的食物中某种组成成分(主要为蛋白质)作为抗原诱导机体产生免疫应答而发生的一种变态反应疾病。食物致敏蛋白的快速高效检出已成为目前食品行业关注的重点。本文介绍了食物致敏原致敏机制,体内、体内检测技术的最新研究进展,并对各种检测技术的优缺点进行了深入分析。在此基础上,对食物蛋白致敏成分检测技术的发展趋势进行了展望,以期为致敏蛋白的深入研究提供参考。     

免疫电镜技术在植物病毒研究中的应用

免疫电镜技术通过将免疫学与超微结构形态学相结合,利用抗原—抗体的专化性反应对抗原或抗体进行精确定位。介绍免疫电镜技术的原理、发展阶段及其在植物病毒研究中的应用。