细菌人工染色体及其在马立克氏病病毒研究中的应用

简要介绍了细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）载体及其修饰技术,重点综述了BAC在马立克氏病病毒基因功能、疫苗研究中的应用。细菌人工染色体是近十几年发展起来的一种新型DNA克隆载体系统,具有操作简单、遗传稳定、容量大等明显的优势,主要用于构建基因组文库、转基因动物模型、分子克隆化病毒等。     

细菌人工染色体荧光原位杂交技术的应用

目前,覆盖人类、植物、畜禽、微生物等100多种物种全基因组的细菌人工染色体文库在不同时间、不同群体中相继产生,为物种基因资源的保存、基因组学和后基因组学的研究提供了可靠的材料。细菌人工染色体与荧光原位杂交技术的结合能够将物种的大片段基因组DNA杂交在染色体上,确定基因或标记物在染色体上的物理位置,从而成为细胞和分子生物学领域中必不可少的工具。论文对细菌人工染色体荧光原位杂交技术在染色体结构与核型分析、疾病与肿瘤病原学研究、基因和标记物的定位与细胞遗传图谱绘制、基因组比较作图及物种进化中的应用和发展进行了综述。     

家蚕微孢子虫细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体(BAC)文库是进行生物基因组学研究的一个重要手段。以家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)重庆分离株为材料,在前期构建的家蚕微孢子虫基因组框架图数据基础上,对构建家蚕微孢子虫BAC文库过程中的关键技术,如脉冲胶块(plug)的制备与处理、限制性酶的筛选、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入DNA片段与载体的摩尔比值等进行了研究,建立了构建家蚕微孢子虫BAC文库适宜的技术体系。构建的家蚕微孢子虫BAC文库由6 478个克隆构成,克隆片段平均大小约为50 kb,相当于家蚕微孢子虫基因组(15.33 Mb)的20倍,文库空载率较低,有利于深入开展家蚕微孢子虫基因组相关方面的研究。     

绒山羊细菌人工染色体BAC文库构建条件的优化

近年来,细菌人工染色体BAC文库成为应用最广泛的基因组文库之一,它以其容量大、遗传特性稳定、嵌合体少、插入片段易回收、操作简便等不可比拟的优点而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究之中。作者就细菌人工染色体BAC文库的构建条件进行了研究,用HindⅢ部分酶切绒山羊基因组,脉冲场凝胶电泳分离大片段DNA,以电洗脱法回收DNA后,与BAC载体连接,将连接产物点透析后,电转化DH10B感受态细胞,最后对转化的片段小提质粒进行NotⅠ酶切,脉冲电泳鉴定其大小。结果表明,本试验采用的方法既可获得较大的插入片段又可获得较高的转化效率,是较好的用于构建大基因组文库的方法。     

绵羊MHC Class Ⅰ区段429P24 BAC克隆的基因筛选与序列分析

为了建立细菌人工染色体(BAC)筛选绵羊cDNA文库的方法,并期望分离到与绵羊疾病有关的基因,试验以429P24 BAC克隆为探针,采用噬菌斑杂交筛选法筛选绵羊cDNA文库,对分离出的cDNA阳性克隆进行测序和计算机序列比较。结果表明:以429P24 BAC克隆为探针筛选出7个阳性克隆,经初步分析可能是与绵羊的免疫和疾病有关的基因。说明以429P24 BAC克隆为探针筛cDNA文库是一种有效的表达序列分离法。     

鸡13号染色体比较图谱的改进（完善）

鸡13号染色体(GGA13)与人类5号染色体(HSA5)的一部分构成比较图谱。用GGA13特异性微卫星标记扫瞄Wageningen鸡细菌人工染色体(BAC)文库。所选BAC克隆最终被测序，57个STS位标被用来构建克隆重叠群。在GGAl3上衷情共检测到了204个BAC克隆，这些克隆约20％是重叠的。基因检测采用双向式方法院。首先从已经不定位的鸡BAC亚克隆序列开始，通过BLAST数据库工具，检测人类和小鼠折同源基因。第2步在人在HSA5q23-q35区域寻找与鸡同源的人类基因。接着用荧光原位杂交(FISH)或SNP方法将鸡的同源基因定位。本研究的比较图谱改进之处在于，使GGAl3上定位的基因数从14增加到20；GGAl3染色体定位的基因有人类HSA5q23-q35，小鼠Mull、Mull3、Mul8染色体上的同源基因。     

重组禽α疱疹病毒研究进展

禽α疱疹病毒可以引起多种家禽重要传染病,重组病毒是研究其基因组结构功能和新型基因工程疫苗的有效手段.文章综述了禽α疱疹病毒转移载体的构建和同源重组方法、感染性细菌人工染色体系统、基因缺失疫苗和重组活载体疫苗的最新进展.     

编码基因完整的伪狂犬病毒细菌人工染色体的构建

为了构建包含伪狂犬病毒(PRV)完整编码基因的细菌人工染色体(BAC),首先对PRV基因组进行了分析,确定了单一酶切位点AcclⅠ,用PCR方法扩增出上下游同源臂、EGFP表达盒并同BAC质粒一起克隆到p UC_(18)质粒,获得转移载体;将经限制性内切酶AcclⅠ处理过的病毒全基因组连同转移载体共同转染BHK21细胞,获得重组病毒;利用PCR检测、电镜观察及生长曲线测定对野毒与重组毒的基本特性进行了比较。结果表明:重组病毒可以稳定地表达绿色荧光,BAC在传代过程中能够稳定存在;重组病毒在电镜下的形态与野毒未见差异,其生长曲线也基本同野毒吻合。说明成功构建的编码基因完整的PRV细菌人工染色体可用于该病毒的结构生物学及致病机理研究。     

禽致病性大肠杆菌O2株跨膜输出蛋白基因组文库的构建与分析

为构建禽致病性大肠杆菌(APEC)跨膜输出蛋白基因组文库,本研究以APEC O2菌株基因组DNA为模板,采用基因随机片段PCR方法扩增,纯化约250 bp~500 bp的片段构建APEC O2菌株跨膜输出蛋白基因组文库。共获得约1.8×10~5个克隆容量的基因组文库,经氨苄/卡那/阿拉伯糖平板筛选到318个克隆。ORF及Signal P分析显示318个克隆插入片段均含有信号肽序列,其中,78个克隆预测为膜蛋白;启动子分析显示144个克隆含有完整启动子,除去29个能自主表达的克隆,推测其余115个克隆的启动子在实验培养条件下沉默,可能需要特殊条件诱导才能表达;GO功能分析克隆插入片段所对应全长基因的ORF显示,其参与的生物过程主要集中于定位、转运;从分子功能角度分析,其主要集中于催化和结合;从细胞组成角度分析,其主要集中于细胞膜、周间质、外膜等与外壳相关的结构中。本实验将为进一步研究APEC的致病性机理奠定基础。     

利用细菌人工染色体文库（BAC）筛选猪乳蛋白基因

利用猪细菌人工染色体文库（porcine Bacteria Artificial Chromosome,pBAC)的两步一四维PCR（two step-4-D PCR)方法筛选猪乳清酸性蛋白（Whey Acidic Protein,WAP),asl-酪蛋白，as2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白的基因pBAC克隆，并提出了BAC基因文库一步一五维PCR（one step-5-D PCR)筛选基因的方法。