伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的表达及基因免疫

构建了2个利用人类巨细胞病毒（HCMV）的启动子启动表达伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的真核表达质粒pCIDI和pcDDI，体外转染BHK－21细胞，用间接免疫荧光法检测，证实糖蛋白gD在细胞中得到表达。用表达质粒pCIDI和pcDDI作为核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，ELISA检测小鼠血清中抗伪狂犬病病毒的抗体，结果其滴度为1：128－1：1512。初步证实，用gD基因作为核酸疫苗免疫动物，可以激活机体的免疫应答反应。     

猪伪狂犬病病毒gD核酸疫苗构建及IL-15基因佐剂对其免疫增强试验

运用PCR技术扩增出伪狂犬病病毒糖蛋白gD基因,将该基因定向克隆于真核表达载体pcDNA3.1+、pCI-neo中,命名重组质粒为pcD-gD、pCI-gD.以小鼠为动物模型,对构建的基因疫苗进行免疫原性的初步评价.为了证明细胞因子是否能增强基因疫苗的免疫效力,本试验用IL-15的表达质粒联合pcD-gD、pCI-gD免疫.结果表明,重组质粒组主要提高细胞免疫水平,特别是联合组中的CD8~+相对其他组别较高.重组质粒在体液免疫方面没有表现出优势,抗体滴度达不到阳性对照组的水平,但是整个抗体水平相对稳定,提示DNA疫苗诱导的抗体维持时间较长.     

不同转染介质对狂犬病病毒糖蛋白基因免疫的效应

将狂犬病病毒糖蛋白 ( RGP) c DNA Bgl 片段 ( 1 .6 7kb)分别克隆进质粒 p GFP-Cl、p SV2 -dhfr和pc DNA3 ,构建了重组质粒 p GFP-C1 -RGP、p SV2 -RGP和 pc DNA3 -RGP,通过脂质体和聚乙烯亚胺 ( PEI)包裹后分别转染 BHK-2 1细胞和乳鼠脑内接种 ,3种重组质粒均能表达出 RGP。表达水平高低依次为 p GFP-C1 -RGP>pc DNA3 -RGP>p SV2 -RGP。 3种重组质粒分别以全裸质粒、质粒 -脂质体、质粒 -PEI形式 ,经骨骼肌免疫小鼠 ,间接 ELISA检测。结果显示 ,免疫鼠血清中特异性抗体水平明显高于对照组 ;80 %免疫小鼠能抵抗狂犬病病毒强毒的攻击。全裸质粒免疫诱生的抗体水平同其剂量相关 ;而以 PEI或脂质体作为转染介质、质粒接种量超过 2 0μg时 ,诱生抗体水平不再随质粒剂量增大而显著变化。质粒免疫后 1 50 d采用 PCR仍然能从注射部位检测到 RGP基因的存在     

猪生殖与呼吸综合征ORF5基因疫苗的构建及其安全性和免疫原性检测

克隆了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SC2株ORF5基因。测序分析表明SC2株属美洲型PRRSV。构建的ORF5基因疫苗经脂质体转染Marc-145细胞后，第26h检测到疫苗蛋白的特异性表达，第56h达到高峰。疫苗肌肉注射小鼠和仔猪后能迅速分布到各组织器官中，未发现核酸疫苗与宿主细胞染色体整合现象；且能使仔猪产生体液和细胞免疫应答，免疫期持续135d以上。结果表明，构建的PRRSV ORF5基因疫苗具有良好的安全性和免疫原性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3株GP5-M-N蛋白核酸疫苗的构建及免疫原性

为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸疫苗用于免疫预防的可行性,试验用PCR方法扩增出PRRSV HB-3株GP5、M和N基因,通过Linker序列将GP5和M串联为GP5-M,双酶切后和N基因一起插入真核表达载体构建重组质粒pcDNA-GP5-M-N,经酶切鉴定表明GP5、M和N基因和载体连接正确。然后将重组质粒转染至Marc-145细胞,经间接免疫荧光及Western blot分析证实重组蛋白能在Marc-145细胞中表达。然后用重组质粒pcDNA-GP5-M-N免疫Balb/c小鼠,中和抗体检测结果表明,首免后2周即有小鼠产生可检测到的病毒中和抗体(1∶4),随后抗体水平快速升高,第8周抗体效价达到最高(1∶32)。说明本试验构建的重组质粒pcDNA-GP5-M-N能诱发免疫小鼠产生较高水平的中和抗体,为PRRSV核酸疫苗的研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒COE核酸疫苗的构建及免疫原性

用疑似患猪流行性腹泻病猪肠病料,扩增部分保护性抗原基因（COE基因）,通过T4连接酶将COE基因与真核表达载体plRES2-EGFP进行连接,提取纯化重组质粒。通过脂质体转染vero细胞,用SDS-PAGE和westernblot鉴定COE蛋白的表达。用重组质粒对BALB／c小鼠进行免疫,观察免疫效果。结果显示成功构建了pIRES2-EGFP—COE真核表达载体;目的蛋白在vero细胞中得到表达;重组质粒免疫小鼠能够产生相应抗体。结果表明,COE核酸疫苗可在小鼠体内诱导相应的抗体产生,这为进一步研究猪腹泻病毒的核酸疫苗奠定了基础。     

伪狂犬病基因缺失疫苗SA215株gD基因的序列分析及其功能

SA215是伪狂犬病病毒3基因缺失疫苗株(PRV TK-/gE-/gI-/LacZ),试验以其主要功能基因gD基因为对象,通过对病毒吸附细胞的差异和免疫仔猪后血清中抗体效价变化的测定,认为gD基因编码蛋白可介导病毒进入细胞和诱导机体产生中和抗体。经从gD基因的基因型到表现型全面分析SA215株的免疫原性,发现gD基因变异没有影响到其功能的实现,推定SA215株应具有良好的免疫原性。     

H5N1亚型禽流感病毒HA基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究

采用RT-PCR技术扩增了高致病性禽流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/04（H5N1）HA基因,然后将其克隆到真核表达载体pCI-neo中,获得重组质粒pCI-HA。在脂质体介导下转染Vero细胞,单抗免疫组化IPMA结果表明,HA蛋白在VeroE6细胞上大量表达。pCI-HA质粒在有或无脂质体佐剂存在下以50μg剂量免疫接种Balb/c小鼠和SPF鸡,对照组只接种50μgpCI-neoDNA,各组以相同剂量加强免疫两次,每次免疫间隔3周。每次免疫前采集血清用ELISA检测抗体效价。最后一次免疫后3周用10^6EID50的高致病性流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/04（H5N1）进行攻毒试验。免疫组小鼠抗体效价与对照组相比明显升高,但脂质体佐剂免疫组与非脂质体免疫组小鼠抗体效价差异不显著,基因免疫组小鼠能够抵抗H5N1高致病性禽流感病毒的致死性攻击。该核酸疫苗虽然能够诱导SPF鸡产生抗体应答,但抗体产生缓慢,效价较低。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3株GP5-M-N蛋白核酸疫苗的构建及免疫原性

为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸疫苗用于免疫预防的可行性,试验用PCR方法扩增出PRRSVHB-3株GP5、M和N基因,通过I,inker序列将GP5和M串联为GP5-M,双酶切后和N基因-起插入真核表达载体构建重组质粒pcDNA-GP5-M-N,经酶切鉴定表明GP5、M和N基因和载体连接正确。然后将重组质粒转染至Marc-145细胞,经间接免疫荧光及Western blot分析证实重组蛋白能在Marc-145细胞中表达。然后用重组质粒pcDNA-GP5-MN免疫Balb／c小鼠,中和抗体检测结果表明,首免后2周即有小鼠产生可检测到的病毒中和抗体（1：4）,随后抗体水平快速升高,第8周抗体效价达到最高（1：32）。说明本试验构建的重组质粒pcDNA-GP5-M-N能诱发免疫小鼠产生较高水平的中和抗体,为PRRSV核酸疫苗的研究奠定了基础。     

PRRSV GP5蛋白及猪IL-18基因共表达核酸疫苗免疫原性试验

本试验通过分子克隆技术分别构建了单独表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因以及PRRSVGP5基因和猪IL-18基因共表达的重组核酸疫苗质粒（pEGFP—GP5和pEGFP—ILl8-GP5）,并进行仔猪免疫原性研究,对构建的PRRSV核酸疫苗所诱导的体液免疫和细胞免疫水平进行检测,进一步研究了PRRSV核酸疫苗免疫效果以及猪IL-18基因对PRRSV核酸疫苗免疫调节作用的影响。同时,调查了商业上应用不同类型的PRRSV疫苗诱导的免疫效果,并与核酸疫苗免疫效果进行比较。结果表明,IL-18作为免疫佐剂在疫苗免疫猪后诱导的病毒特异性细胞免疫反应方面具有很好的调节作用,共表达IL18-GP5蛋白能够明显的改善DNA疫苗的免疫效力,增强抗PRRSV的免疫保护。因此,DNA疫苗做为一种新一代疫苗可用于对抗高致病性PRRSV感染。