高产碱性β-葡萄糖苷酶的产纤维素酶菌株的筛选

为获得高产碱性β-葡萄糖苷酶的产纤维素酶菌株,利用碱性羧甲基纤维素钠平板筛选和β-葡萄糖苷酶平板筛选法相结合,从植物腐败堆积土壤中分离到1株高产碱性β-葡萄糖苷酶的产纤维素酶克雷伯氏杆菌,并对其进行初步酶学鉴定。结果表明:该菌胞外分泌液具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶的活性,其中以β-葡萄糖苷酶活性最高,为48.9U/mL。其所产纤维素酶的最适反应pH值为10.0,最适反应温度为35℃,且Ca2+、Mg2+、Zn2+和Mn2+等金属离子对该酶具有较强的抑制作用。     

纤维素酶活力测定方法研究进展

纤维素酶是一类能够水解纤维素的β-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称,传统上将其分为3类:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶是一种复合酶,准确测定纤维素酶活力的大小,对于研究纤维素酶的特性及应用具有重要意义。该文对纤维素酶测定的常用方法进行了综述和评价。指出单一的酶活力测定方法不能确切的反映该酶的作用机制和活力,只有诸活力的综合测定方能全面的反映酶制剂对纤维素的作用。     

展示在巴斯德毕赤酵母细胞表面的内切-1,4-β-葡聚糖酶的酶学性质

本研究目的是利用毕赤酵母细胞表面展示技术来改善内切-1,4-β-葡聚糖酶的酶学性质。结果显示,SDS-PAGE显示展示酶(DEG)的分子量为34.1kDa,对CMC-Na有底物专一性。与游离酶(FEG)相比,DEG的最适作用温度和最适作用pH值未发生变化,分别为70℃和4.0;对底物的亲和力降低;pH 2.5~8.5时酶活残留率为60%,比游离酶高0.5倍;温度70℃时酶活无损失,残留率为102%,同等条件下比游离酶高1.5倍;DEG重复使用10次以后保留活性仍为65%;而且展示酶对Co2+、Mn2+、Hg2+等重金属离子的耐受力也大大增强。本研究结果表明,展示内切-1,4-β-葡聚糖酶的酶学性质得到大幅度改善,其酸热稳定性、重金属离子耐受性和操作稳定性均有所提高,DEG作为一种酵母全细胞生物催化剂在各种纤维素降解领域具有很广阔的应用前景。     

一株木霉菌(Trichoderma sp.)TY2纤维素酶最佳产酶条件及部分酶学特性研究

[目的]筛选高活力纤维素酶产生菌,高效利用纤维素资源.[方法]从朽木和和纸浆样品中分离筛选出一株产纤维素酶活较高的菌株TY2.对其形态和18S rDNA特征序列分析鉴定为木霉菌(Trichoderma sp.).对菌株发酵条件及酶学特性进行研究.[结果] TY2菌株的最佳产酶条件为:1;滤纸+2;麸皮+0.5;葡萄糖为碳源,0.5;蛋白胨为氮源,起始pH 5.0,温度28 ℃,200 r/min,5 d,其CMCase和FPase活力分别达412.5 和100.3 U/mL.经分离纯化出TY2菌株内切β-葡聚糖苷酶.内切β-葡聚糖苷酶最适反应温度为60 ℃,最适反应pH为4.6,在50 ℃以下,pH 3.0～5.0,酶活性稳定,且在80 ℃仍具有降解CMC-Na的效果.同时研究发现铜离子、锌离子、钾离子和钠离子对内切β-葡聚糖苷酶的酶活有促进作用,而汞离子有明显的抑制作用.[结论]所筛选的TY2菌株具有潜在的工业应用价值.     

纤维素酶系组分活性对杏鲍菇生长的影响

纤维素酶系性能是影响菌丝体产菇质量的重要因素,通过比较不同培养条件下杏鲍菇菌株产纤维素酶系的组分活力特征,阐述酶系组分活力对菌菇生长过程中的纤维素基质降解的生理性能的影响。结果表明:杏鲍菇菌的纤维素酶系中内切葡聚糖酶组分(C1酶)活力变化明显,活性较强,β-葡萄糖苷酶组分(BG酶)活力升高受C1酶活力变化的影响,并且C1酶活力和BG酶活力的高低与菌丝生长速度关系密切,而外切葡聚糖酶组分(Cx酶)活力弱而稳定。进一步的分析显示采用低结晶化程度的纤维素基质对纤维素酶系活力产生有较强的诱导作用。     

微生物混合对纤维素酶活的影响

[目的]研究微生物共存及优化纤维素酶酶系种类和比例搭配。[方法]分别把里氏木霉、黑曲霉和两者1∶1混合菌系以总接种量8mL接入产酶培养基中,10d内每天测定3种纤维素酶组分酶活和滤纸酶活,以此分析其混合菌系与单菌株的生长关系和三种组分酶活的比例。[结果]混合菌系的内切葡聚糖酶活力在第7d达到峰值,外切葡聚糖酶活力和β-葡萄糖苷酶活力分别在在第4d、5d达到峰值后,在第7d、6d又有上升趋势,但这3种组分酶活不同程度低于单菌株,而总酶活力滤纸酶活却高于单菌株。[结论]3种组分酶活力的比例不同,决定着纤维素酶系的完整与否,从而决定了纤维素酶对纤维素的降解程度。     

金属离子对灵芝纤维素酶和木聚糖酶活性的作用

研究了6种金属离子对灵芝纤维素酶和木聚糖酶活性的影响。结果表明：在试验的离子浓度范围内,Mn2＋抑制灵芝纤维素酶的CMC酶活、FP酶活和木聚糖酶活;Zn2＋抑制灵芝FP酶活和木聚糖酶活,却促进CMC酶活;Mg2＋对纤维素酶的CMC酶活和FP酶活有明显的促进作用,但浓度高时会抑制木聚糖酶活;Cu2＋在低浓度时,激活灵芝产的木聚糖酶,其他浓度会抑制纤维素酶活性及木聚糖酶酶活;K＋对纤维素酶的CMC酶活和FP酶活促进作用小,对木聚糖酶活的抑制作用也小;Fe2＋抑制CMC酶活,低浓度抑制FP酶活,高浓度抑制FP酶活,对木聚糖酶活性的作用却相反。     

2种真菌纤维素酶系组分活性研究初报

在液体摇瓶培养和固体发酵条件下 ,对 2株产纤维素酶的野生型真菌的产酶动态和酶系活性进行了分析 ,并将固态酶曲与海林产酶粉进行了综纤维糖化对比试验。结果表明 ,2菌株酶系组分酶活较高 ,尤其是β-葡萄糖苷酶酶活远高于海林酶粉     

哈茨木霉UN-2β-葡聚糖酶诱导及对水稻纹枯病的抑菌防病作用

【目的】优化哈茨木霉UN-2菌株产β-葡聚糖酶的培养基组分及发酵参数,提高其产酶能力,研究β-葡聚糖酶粗酶液对水稻纹枯病病原菌的拮抗作用及田间防效,阐明哈茨木霉菌株UN-2在水稻纹枯病生物防治中的应用潜力。【方法】采用单因素试验考察不同碳源、氮源和金属离子对哈茨木霉菌株UN-2产β-葡聚糖酶的影响,利用正交试验确定木霉菌株产β-葡聚糖酶的最适温度、pH、接种量、瓶装量、摇床转速和发酵时间,优化哈茨木霉菌株UN-2产β-葡聚糖酶诱导发酵条件;通过体外拮抗试验和田间防效试验研究β-葡聚糖酶粗酶液对水稻纹枯病的抑菌防病作用。【结果】哈茨木霉菌株UN-2发酵产β-葡聚糖酶最佳碳源和氮源分别为麦麸和硫酸铵,金属离子Ca²⁺和Mg²⁺对木霉产β-葡聚糖酶活性具有明显的促进作用。哈茨木霉UN-2菌株以10.0 g/L麦麸、0.5 g/L β-葡聚糖、4.0 g/L硫酸铵、1.5 mmol/L Ca²⁺、0.5 mmol/L Mg²⁺为培养基,在温度32℃、起始pH 6.5、接种量8 mL(10⁶      

黑蜣(Bess beetle)纤维素酶的组分及其特性分析

以30日龄的黑蜣幼虫为材料,对其整体匀浆后组织液中的纤维素酶组成及活性进行了分析。结果表明:黑蜣体内存在内切β-1,4-葡聚糖酶(Cx酶)、β-葡萄糖苷酶;β-葡萄糖苷酶和Cx酶的最适宜温度为分别为40℃和50℃;Cx酶和β-葡萄糖苷酶分别在pH值为6.4和5.2时具有最大的活力;β-葡萄糖苷酶和Cx酶的最适宜反应时间为80 min。Cx酶具有比β-葡萄糖苷酶更强的温度适应性,在30～50℃温度范围内可维持最大酶活力的66.20%。     

重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化及部分酶学性质研究

[目的]研究重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质。[方法]由重组大肠杆菌制备重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵液,经乙醇分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析分离纯化后进行SDS-PAGE纯度鉴定,最后分析纯化后重组酶的酶学性质。[结果]SDS-PAGE分析表明纯化后得到了较纯的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶,比活力达13 437 U/mg,纯化倍数为19.85倍,回收率为20.60%,分子量约30 kDa。纯化后重组酶的最适pH值为6.0,pH值4.5~6.0较稳定;最适温度为50℃,40~50℃较稳定;Cu2+和Fe2+对其活力有显著的抑制作用,Mg2+、Zn2+和Mn2+对其活力有抑制作用,比较适合在啤酒酿造上使用。[结论]该研究为重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的工业化应用奠定了基础。     

基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用

以α-半乳糖苷酶基因为筛选标记,构建GAL1诱导型启动子介导的酿酒酵母表达载体YGM-α-gal质粒,将枯草芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到此载体中,构建质粒YGMPA-α-gal,转化宿主酵母后,实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达.结果表明:在2%半乳糖诱导下,摇瓶发酵24h后分泌表达的β-葡聚糖酶活性达到411.9U爛mL-1,而在培养60h后,发酵液中α-半乳糖苷酶活性可达64.2U爛mL-1.说明α-半乳糖苷酶基因可用作酿酒酵母表达载体转化的有效筛选标记,为食品级酿酒酵母表达系统的构建提供了新选择.     

Bacillus subtilis LC-9产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质与催化特性研究

[目的]系统研究Bacillus subtilis LC-9所产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质,探讨其在催化应用上的可行性。[方法]采用两步阴离子交换层析法对B.subtilis LC-9发酵液中的β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行纯化,用SDS-PAGE检测其纯度,研究纯酶的酶学性质及该酶对β-葡聚糖和地衣多糖的降解特性,并采用TLC法检测其水解液中糖的成分。[结果]从自行筛选的糖苷酶产生菌B.subtilis LC-9的发酵液中经两步纯化,得到电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,其比活力达3 502 U/mg,表观分子量为28 kDa;酶的最适反应pH和温度分别为6.5和45℃,且在45℃下稳定;该酶催化地衣多糖的Km值和Vmax分别为4.13 mg/ml和1 238μmol/min/mg,催化大麦β-葡聚糖的Km值和Vmax分别为3.84 mg/ml和1 427μmol/min/mg;该酶降解大麦β-葡聚糖产生寡聚糖,最终产物主要为三糖和四糖,而降解地衣多糖终产物主要为三糖。[结论]从Bacillus subtilis LC-9发酵液中纯化获得了电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,性质研究表明该酶是专一性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,有望用于啤酒、饲料等领域。     

沟眶象纤维素消化酶的分布及金属离子对其活性的影响

[目的]研究金属离子对沟眶象纤维素酶系活性和消化生理的影响。[方法]以酶学分析方法研究了沟眶象消化道纤维素消化酶的分布和Hg2+、Ca2+和K+、Fe2+等7种金属离子对沟眶象肠道纤维素酶活性的影响。[结果]94%Cx酶9、2%C1酶、95.1%-β1,4葡萄糖苷酶存在于沟眶象中肠。在试验浓度范围内(0.1~5.0 mmol/L),处理24 h后,6种金属离子对纤维素酶各组分酶活性具有不同程度的抑制作用,且随浓度的升高而增强,其中Hg2+、Cu2+、Zn2+和Mn2+抑制作用较强,Fe2+对纤维素酶活性有明显的激活作用;处理7 d后,7种金属离子表现较强的抑制作用,在低浓度下Fe2+可使C1酶、-β1,4葡萄糖苷酶活性微弱增强,高浓度表现为抑制作用。[结论]该研究为有效控制沟眶象提供科学依据。     

M12-9-5产β-葡聚糖酶的主要影响因子

[目的]探究M12-9-5摇瓶发酵产β-葡聚糖酶的主要影响因子。[方法]对碳氮源、无机盐和金属离子进行产酶的单因素试验,并通过Placckket-Burman(PB)试验设计确定培养基中影响其发酵产酶的主要因素。[结果]结果表明:在PB设计的二水平范围之内,大麦粉和麸皮之比、蛋白胨、CaCl2、NaCl和吐温80,对酶活呈正效应;而CaCO3、麦芽糖和FeSO4.7H2O对酶活呈负效应。对酶活影响较大的因子为:大麦粉和麸皮之比(P=0.004 0)、CaCl2(P=0.020 4)及NaCl(P=0.021 7)。[结论]大麦粉和麸皮的比例、CaCl2和NaCl的添加量是影响发酵产酶的主要因素。     

植物酯酶反应活性影响条件研究

研究酶液用量、pH值、温度、乙酸-1-萘酯用量等条件对酶促反应影响以及几种金属离子对酶促反应活性的影响,并建立酶抑制方程。结果表明:酶液用量0.25 mL、乙酸-1-萘酯0.6 mL、pH值6.5、温度38℃为酶促反应的最佳条件。Cu2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+、Co2+等离子在一定浓度范围内对酶促反应活性具有激活作用,且Cu2+浓度为0.06 mol/L时激活作用最为明显,能提高60.37%。Co2+浓度为0.04 mol/L时次之,能提高51.75%。     

地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆及序列分析

β-葡聚糖是以β-1,3和β-1,4混合糖苷键连接形成的D-葡萄糖聚合物,主要存在于单子叶禾本科谷实中.有些微生物会产生降解β-葡聚糖的β-1,3-1,4-葡聚糖酶.将β-葡聚糖酶基因在食品级宿主菌中表达对动物饲料工业具有十分重要的应用价值.实验以地衣芽孢杆菌为材料,提取其总DNA,扩增其β-1,3-1,4葡聚糖酶基因序列,将该片段克隆到pMD 19-T载体进行测序,并将测序结果进行BLAST比对.发现其与GenBank中的两段基因序列具有较高的同源性.     

平菇816菌丝生长过程中纤维素酶活性的变化特征

以平菇816为研究对象测定了菌丝体不同生长时期的每日生长量、总生长量、生长速率以及3种纤维素酶酶活性,结果表明平菇816菌丝体的再生能力和生长势很强第1天的日生长量最大第1天至第6天是快速生长期占总生长量的72.17%之后进入平稳生长期,菌丝体平均生长速度为9.88mm/d,外切β1,4葡聚糖酶活性随着生长天数增加而增加而内切β1,4葡聚糖酶活性、β1,4葡聚糖苷酶活性和纤维素酶总活性在第5天达高峰最高和最低酶活性分别相差4.38倍、3.65倍、2.24倍,外切β1,4葡聚糖酶活性与每日菌丝体生长量存在显著正相关（P〈0.05）回归方程为y=0.0209x＋1.2545,早期纤维素活性高低影响菌丝体生长纤维素酶活性与菌丝体生长呈现正相关外切β1,4葡聚糖酶在纤维素分解过程中的起到关键作用显著影响菌丝体代谢能力进一步影响了菌丝体的生长势.     

黑曲霉葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

[目的]分离能水解獐牙菜苦苷的胞外β-葡萄糖苷酶,并研究其分子量、最适催化温度、最适pH、稳定性及催化特征。[方法]黑曲霉液体发酵3d,收集培养液,培养液经盐析、柱分离得到1个β-葡萄糖苷酶。[结果]该β-葡萄糖苷酶的分子量为86kD,最适pH为5.0～6.0,最适反应温度为50～60℃,在60℃以下时酶稳定;Ca2＋、Zn2＋、Fe3＋和Cu2＋能抑制β-葡萄糖苷酶的活性,而Mg2＋和Mn2＋能够激活β-葡萄糖苷酶的活性;纤维二糖是该β-葡萄糖苷酶的最适催化底物。[结论]该酶和大多数真菌来源黑曲霉相似,对獐牙菜苦苷的亲和性弱,对ρ-NPG的亲和力强。